PCR-DGGE分析不同品牌腐乳中細(xì)菌的多樣性

陳穎慧

(永城職業(yè)學(xué)院 食品化工系，河南 永城 476600)

PCR-DGGE分析不同品牌腐乳中細(xì)菌的多樣性

陳穎慧

(永城職業(yè)學(xué)院 食品化工系，河南 永城 476600)

以不同品牌腐乳為研究對(duì)象，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的變性梯度凝膠電泳技術(shù)對(duì)腐乳中的細(xì)菌進(jìn)行多樣性分析。結(jié)果表明：克東牌腐乳的細(xì)菌多樣性最低，廣合牌腐乳的細(xì)菌多樣性最高。乳酸桿菌屬是腐乳中細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群。乳酸菌屬、藤黃微球菌和糞腸球菌為4種品牌腐乳的共有菌株。融合魏斯氏菌、瑞士乳桿菌和乳酸鏈球菌存在于老才臣牌腐乳、廣合牌腐乳和王致和牌腐乳中。植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌存在于廣合牌腐乳和王致和牌腐乳中。玫瑰考克氏菌只存在于克東牌腐乳中，而醋酸鈣不動(dòng)桿菌只存在于王致和牌腐乳中。可知不同品牌腐乳中細(xì)菌的多樣性存在著差異。

腐乳；細(xì)菌；多樣性；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的變性梯度凝膠電泳

腐乳，又被稱為豆腐乳，是我國(guó)重要的調(diào)味品之一，其風(fēng)味鮮咸、口感軟滑、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，深受我國(guó)消費(fèi)者的喜愛[1,2]。在腐乳的發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌扮演了至關(guān)重要的角色，與腐乳的風(fēng)味、口感和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的變化密切相關(guān)，研究已經(jīng)表明玫瑰耐鹽球菌、植物乳桿菌和藤黃微球菌等微生物在腐乳發(fā)酵過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用[3-5]。市場(chǎng)上腐乳產(chǎn)品多種多樣，也會(huì)呈現(xiàn)出不同的風(fēng)味，因此對(duì)不同品牌腐乳產(chǎn)品進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析十分必要。

目前，大多數(shù)的研究只停留在腐乳中微生物的分離和鑒定，但是傳統(tǒng)分離鑒定的方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且容易受到培養(yǎng)條件的限制，很難達(dá)到分析樣品細(xì)菌多樣性的目的[6,7]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的變性梯度凝膠電泳(Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, PCR-DGGE)技術(shù)能夠不經(jīng)過(guò)分離鑒定，通過(guò)樣品的DNA指紋圖譜反映多樣性情況，并結(jié)合基因測(cè)序技術(shù)對(duì)目的條帶進(jìn)行鑒定，能夠滿足揭示乳酸菌多樣性的需要[8,9]。因此，本研究利用PCR-DGGE技術(shù)分析不同品牌腐乳中細(xì)菌群落特征的差異，為腐乳發(fā)酵劑的篩選提供參考，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與儀器

1.1 主要材料

1.1.1 樣品來(lái)源

4種不同品牌腐乳產(chǎn)品：分別為A(克東牌腐乳)，B(老才臣牌腐乳)，C(廣合牌腐乳)，D(王致和牌腐乳)，購(gòu)買于沃爾瑪超市。

1.1.2 主要試劑

dNTP(2.5 mmol/L)、10×rTaq Buffer(含15 mmol/L MgCl2)、TaqDNA聚合酶、6×Loading Buffer、Marker I和雙蒸水 上海吉泰依科賽生物科技有限公司；TAE緩沖液、TE緩沖液、氯仿、冰乙酸、蛋白酶K、瓊脂糖、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺和過(guò)硫酸銨 無(wú)錫藍(lán)波化學(xué)品有限公司；GeneFinder電泳核酸染料 北京金博益生物技術(shù)有限公司；引物L(fēng)ac1和Lac2，40bp“GC” 蘇州金唯智生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

YP102N電子天平 成都一科儀器設(shè)備有限公司；H2100R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；渦旋振蕩器 上海納茲儀器有限公司；JK-WB-2A數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司；EPS-300穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 上海天能科技有限公司；變性梯度凝膠電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 樣品DNA提取及PCR擴(kuò)增

根據(jù)謝顯華等[10]的報(bào)道，對(duì)腐乳樣品中的總DNA進(jìn)行提取。以提取的總DNA為模板，對(duì)腐乳中的細(xì)菌16S rRNA V3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。所用的引物BA338f(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')，UN518r(5'-ATTACCGCGGCTGCTCC-3')，BA338f引物的5'端加一個(gè)40 bp“GC”夾，擴(kuò)增條件為92 ℃預(yù)變性2 min，92 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次，最后76 ℃延伸6 min[11]。

2.2 DGGE分析

腐乳中細(xì)菌DGGE分析的變性凝膠梯度為30%～55%，將32 μL乳酸菌PCR特異產(chǎn)物與8 μL 6×Loading Buffer混合后進(jìn)行上樣，加入TAE緩沖液并保持在60 ℃、電壓70 V、電泳18 h[12]。電泳結(jié)束后小心將DGGE膠體取下，并用去離子水沖洗2次，配制1%的GeneFinder的染色液，浸沒(méi)膠體，在搖床上避光染色30 min，最后利用UVP凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果，得到DGGE圖譜，并利用Shannon-Weaver指數(shù)分析腐乳中乳酸菌的多樣性，公式如下：

Shannon-Weaver=-∑Pilnpk=-∑(Ni/n)ln(Ni/N)。

式中：Pi為樣品中某一條帶強(qiáng)度在該樣品的所有條帶總強(qiáng)度所占的比例；Ni為第i個(gè)條帶的光密度；N為泳道中所有條帶的光密度值之和。

2.3 基因測(cè)序

選取DGGE圖譜不同位置的優(yōu)勢(shì)條帶在紫外燈下進(jìn)行切膠，將切下的凝膠轉(zhuǎn)移到PCR管中，利用無(wú)菌水對(duì)其進(jìn)行沖洗，搗碎后放入TE緩沖液中，并在4 ℃冰箱中放置12 h。取上清液5 μL，對(duì)其進(jìn)行PCR特異擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送往蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)，從而完成菌株的鑒定。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同品牌腐乳中細(xì)菌DNA-PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)不同品牌腐乳中的細(xì)菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果見圖1。

圖1 不同品牌腐乳中細(xì)菌DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物

注：MI表示Marker I；A～D表示樣品編號(hào)。

由圖1可知，所有樣品的條帶大小在200 bp左右，條帶均一清晰，可認(rèn)為是細(xì)菌的目的條帶。

3.2 不同品牌腐乳中乳酸菌的生物多樣性分析

利用DGGE電泳技術(shù)分析不同品牌腐乳中細(xì)菌的生物多樣性，結(jié)果見圖2。

圖2 不同品牌腐乳中細(xì)菌的DGGE圖譜

注：A～D表示樣品編號(hào)；1～13表示DGGE圖譜中不同位置條帶編號(hào)。

在此基礎(chǔ)上，根據(jù)DGGE圖譜中每個(gè)樣品的條帶數(shù)及Shannon-Weaver指數(shù)評(píng)估其多樣性，結(jié)果見圖3。

圖3 不同品牌腐乳中細(xì)菌的條帶數(shù)目及Shannon-Weaver指數(shù)

由圖2可知，4個(gè)來(lái)自不同品牌腐乳中細(xì)菌的DGGE圖譜中共有13個(gè)不同位置的條帶，且不同樣品的圖譜也存在著一定的差異。由圖3可知，4個(gè)樣品的DGGE條帶的個(gè)數(shù)分別為C(廣合牌腐乳，9條)>D(王致和牌腐乳，8條)>B(老才臣牌腐乳，7條)>A(克東牌腐乳，5條)。Shannon-Wiener指數(shù)是評(píng)價(jià)樣品生物多樣性的重要參數(shù)，且Shannon-Wiener指數(shù)越高說(shuō)明樣品中微生物的種類越多，生物多樣性就越高。Shannon-Weaver指數(shù)結(jié)果表明(見圖3)：C中細(xì)菌的生物多樣性最高，而A中細(xì)菌的生物多樣性最低，可見4種不同品牌的腐乳樣品中細(xì)菌的生物多樣性存在一定的差異。

3.3 DGGE圖譜優(yōu)勢(shì)條帶測(cè)序分析

將13個(gè)不同位置的條帶進(jìn)行割膠、PCR擴(kuò)增及基因測(cè)序，條帶編碼見圖2，測(cè)序結(jié)果見表1。

表1 DGGE圖譜中條帶Blast對(duì)比結(jié)果Table 1 Blast comparison results of brands in DGGE profiles

13個(gè)不同的條帶代表了10種不同的細(xì)菌，其中乳酸桿菌屬是腐乳中細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)屬。乳酸菌屬、藤黃微球菌和糞腸球菌在4種不同品牌的腐乳中均有發(fā)現(xiàn)。融合魏斯氏菌、瑞士乳桿菌和乳酸鏈球菌存在于B，C，D的樣品中。植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌則存在于C和D中。玫瑰考克氏菌只存在于A樣品中，而醋酸鈣不動(dòng)桿菌只存在于D樣品中，可見4種不同品牌的腐乳樣品中的細(xì)菌群落組成也存在著一定的差異。

4 結(jié)論

腐乳風(fēng)味的形成主要取決于微生物的發(fā)酵，腐乳中細(xì)菌群落特征的差異是不同品牌風(fēng)味不同的重要原因之一。在本研究中，4種品牌的腐乳中都含有乳酸桿菌屬、藤黃微球菌和糞腸球菌，其中乳酸桿菌屬是優(yōu)勢(shì)菌群。同時(shí)，不同樣品中細(xì)菌多樣性也存在著一定的差異，C(廣合牌腐乳)中細(xì)菌的生物多樣性最高，而A(克東牌腐乳)中細(xì)菌的生物多樣性最低，此外4種不同品牌的腐乳樣品中的細(xì)菌群落組成也存在著差異。本研究的結(jié)果揭示不同品牌腐乳細(xì)菌多樣性的差異，為腐乳的工業(yè)生產(chǎn)及相關(guān)發(fā)酵劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

[1]李幼筠.中國(guó)腐乳的現(xiàn)代研究[J].中國(guó)釀造,2006,25(1):4-7.

[2]李理,羅立新,梁世中.腐乳的研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2002,28(10):70-74.

[3]魯緋,張京生,劉子鵬,等.青方腐乳中乳酸菌的分離鑒定[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2006,32(4):38-41.

[4]陳曦.藤黃微球菌(Micrococcusluteus)KDF2及其胞外蛋白酶KRP2在腐乳中的應(yīng)用研究[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

[5]李娟娟.玫瑰考克氏菌(Kocuriarosea)KDF3及其胞外蛋白酶KRP3在腐乳中的應(yīng)用研究[D].哈爾濱: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

[6]費(fèi)鵬.輪狀病毒腹瀉嬰兒腸道微生態(tài)變化的研究[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[7]Fei P,Li L,Cai X,et al.Differences in the biodiversity of the fecal microbiota of infants with rotaviral diarrhea and healthy infants[J].Jundishapur Journal of Microbiology,2016,9(4):32-36.

[8]費(fèi)鵬,白洪健,程述震,等.PCR-DGGE法分析嬰兒腸道菌群多樣性[J].食品與機(jī)械,2013,29(2):60-63.

[9]Muyzer G,Smalla K.Application of denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology.[J].Antonie van Leeuwenhoek,1998,73(1):127-141.

[10]謝顯華,李國(guó)基.ERIC-PCR在腐乳品質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用[J].食品研究與開發(fā),2010,31(3):135-138.

[11]陶東婭,金銀旗.不同地區(qū)粘豆包酸面團(tuán)中微生物多樣性分析[J].食品研究與開發(fā),2016,37(13):156-159.

[12]張巧云,孟祥晨.幾種發(fā)酵豆醬的微生物組成及理化性質(zhì)分析[J].食品科技,2013(8):266-270.

Bacterial Diversity Analysis of Fermented Bean Curd with Different Brands

CHEN Ying-hui

(Department of Food and Chemical Engineering, Yongcheng Vocational College, Yongcheng 476600,China)

Fermented bean curd with different brands is as the research object in this study. The bacterial diversity of samples is analyzed using polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) technology. The results show that the bacterial diversity of Kedong fermented bean curd is the lowest, in the meanwhile, the bacterial diversity of Guanghe fermented bean curd is the highest.Lactobacillusspp. is the dominant bacterial community.Lactobacillusspp.,MicrococcusluteusandEnterococcusfaecalisare found in all samples.Weissellaconfusa,L.helveticusandStreptococcuslactisare presented in Laocaichen, Guanghe and Wangzhihe fermented bean curd.L.plantarumandL.fermentumare identified in Guanghe and Wangzhihe fermented bean curd.Kocuriaroseais only found in Kedong fermented bean curd.Acinetobactercalcoaceticusis only identified in Wangzhihe fermented bean curd. Conclusively, there are some differences in bacterial diversity among fermented bean curd with different brands.

fermented bean curd；bacteria；diversity；polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE)

2017-02-01

陳穎慧(1981-)，女，吉林白城人，講師，碩士，研究方向：食品科學(xué)與工程。

TS214.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.07.007

1000-9973(2017)07-0029-04