豆豉來源的纖溶酶產生菌株的篩選及發酵性能研究

周秀玲，楊延川，劉璐，張揚

(聊城大學 生命科學學院,山東 聊城 252000)

豆豉來源的纖溶酶產生菌株的篩選及發酵性能研究

周秀玲，楊延川，劉璐，張揚*

(聊城大學 生命科學學院,山東 聊城 252000)

采用酪蛋白平板初篩的方法，從豆豉中分離到278株具有蛋白酶活力的菌株，經過纖維蛋白培養平板復篩，并獲得1株產纖溶酶能力較強的菌株，命名為LZ-238。在對LZ-238菌株常規形態學及生理生化特性鑒定的基礎上，對部分長度的16S rDNA同源性進行了分析，發現LZ-238菌株與地衣芽孢桿菌相似度達99.5%，命名為BacillusamyloliquefaciensLZ-238。通過液體發酵及阿膠納豆的制作，對LZ-238菌株產酶及應用性能進行了評價。經發酵，LZ-238菌株纖溶酶的最高產量可達28.12 U/mL，其制作的阿膠納豆具有豆豉的特有香氣且幾乎無氨味，更符合中國人的口味。

豆豉；纖溶酶；篩選；菌株鑒定

豆豉作為我國的傳統食品一直受到大眾的青睞，無論是直接食用還是做菜調味都是餐中美味。豆豉在制作過程中經微生物作用不僅營養價值得到提升，而且所產生的生理活性物質更是具有抗氧化、降血糖、降血壓、抗腫瘤、抗輻射等作用[1-3]，特別是其溶栓作用近年來越來越受到重視。我國研究者針對豆豉纖溶酶進行了大量的工作，包括菌株的篩選、纖溶酶基因的克隆表達、豆豉纖溶酶的純化及溶栓機制的研究等[4-13]。但是，現有的豆豉纖溶酶酶活力和生產水平直接制約著其進一步開發成保健食品和溶栓藥物。因此，通過高產菌株的篩選等方式提高酶活力及產量成為突破納豆激酶研究瓶頸的關鍵。

本研究以商品化和自制豆豉為出發材料，利用酪蛋白平板初篩及纖維蛋白培養平板高通量復篩的方法，篩選到一株豆豉纖溶酶高產菌株。通過生理生化特征分析結合16S rDNA序列分析確定其分類地位。通過液體發酵及阿膠納豆的制作，對其產酶及應用性能進行了評價，為該菌的后續研究及應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 豆豉

收集產地為重慶、長沙、陽江、南昌、武漢、北京、臨沂、聊城的商品化或自制的豆豉樣品若干份。

1.1.2 主要試劑

纖維蛋白原：購自Sigma公司；尿激酶和凝血酶：購自北京索萊寶科技有限公司。DNA提取試劑盒、PCR試劑及引物：購自上海生工生物工程有限公司。其他生化試劑為進口分裝或國產的分析純試劑。

1.1.3 培養基

初篩培養基：酪蛋白培養基，KH2PO40.5 g，KH2PO41 g，MgSO40.1 g，CaCl20.3 g，蔗糖1 g，酪蛋白2 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH 7.0～7.2。

種子培養基：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，水 1000 mL，pH 7.0～7.2。

發酵培養基：葡萄糖10 g，大豆胨5 g，MgSO40.4 g，ZnSO40.1 g，KH2PO41 g，水1000 mL，pH 7.0～7.2。

保藏培養基：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，瓊脂 15 g，水 1000 mL，pH 7.0～7.2。

纖維蛋白平板：參照Astrup等的方法進行制備[14]。將0.6 g 瓊脂加熱溶解于pH 8.5的20 mL巴比妥鈉-氯化鈉緩沖液中，待溫度降至 50 ℃左右時，加入含有20 mg纖維蛋白原的巴比妥鈉-氯化鈉緩沖液3 mL，混勻后再加入含有20 U凝血酶的巴比妥鈉-氯化鈉緩沖液3 mL，混勻后倒平板。

纖維蛋白培養平板：在纖維蛋白平板培養基中按酪蛋白培養基的比例加入KH2PO4，KH2PO4，MgSO4，CaCl2其他成分不變。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的初篩

在超凈工作臺中分別稱取豆豉樣品1.0 g，加入到盛有95 mL無菌水和玻璃珠的錐形瓶中，用6層無菌紗布封口。在37 ℃，180 r/min的條件下恒溫震蕩培養，6 h后置于85 ℃的水浴中靜置8 min，取1 mL上清液進行梯度稀釋。取各梯度稀釋液100 μL分別涂布于酪蛋白平板上，待風干后倒置于37 ℃恒溫培養箱中進行培養。培養過程中觀察菌落周圍是否有透明圈產生。選擇產生透明圈較大的菌落，用滅菌的牙簽接種到酪蛋白平板上，37 ℃恒溫培養24 h后測量菌落直徑及其水解圈的直徑。通過計算水解圈直徑與菌落直徑的比，篩選比值較大的菌株進行保藏。

1.2.2 菌株復篩

將待篩菌株分別接種到種子培養基中，37 ℃，180 r/min培養16 h后按照0.8%的接種量接種到發酵培養基中相同條件下培養48 h后，將發酵液在4 ℃，12000 r/min條件下離心5 min，上清液即為粗酶液。測定粗酶液的纖溶酶活力，將酶活力較高的菌株保存于斜面，以進行后續實驗。改進方法：將初篩獲得的菌株用滅菌牙簽點種到纖維蛋白培養平板上，37 ℃恒溫培養32 h后測量菌落及水解圈的直徑，并以水解圈和菌落直徑之比判定菌株的纖溶酶活性。選擇比值大的菌株再按上述方法進行液體發酵培養后檢測纖溶酶活力。

1.2.3 纖溶酶活力測定

纖溶酶活力的測定參照文獻[15]的方法，略有改動，簡述如下：向滅過菌的10 mL離心管中加入50 mmol/L，pH 8.5的硼酸緩沖液4 mL，再加入0.72%的纖維蛋白原溶液0.4 mL，充分混勻后37 ℃水浴10 min，加入10 U/mL的凝血酶0.1 mL。混勻后37 ℃水浴，待纖維蛋白原完全凝固成纖維蛋白后，加入0.1 mL稀釋的粗酶液，充分混勻后37 ℃水浴60 min，然后加入0.2 mol/L三氯乙酸2 mL以終止反應。室溫下靜置20 min后，5000 r/min離心10 min，取上清液在275 nm波長下測量吸光度，記為Ar。空白對照組將三氯乙酸的加入放在加入酶液之前，其他操作過程不變，其上清液的吸光度記為Ac。1個單位的纖溶酶活性被定義為在60 min內，使吸光度每增加0.001時所需要的酶量。

FU=(Ar-Ac)×稀釋倍數/0.001×60×0.1。

1.2.4 菌株的鑒定

1.2.4.1 生理生化特性檢測

參閱文獻[16,17]按一般細菌常用鑒定方法進行生理生化特性檢測。

1.2.4.2 16S rDNA分析

細菌總DNA的提取使用通用基因組小量抽提試劑盒進行提取。16S rRNA基因的擴增：利用通用引物27f 和1495r擴增16S rRNA 基因。PCR 50 μL反應體系：5 μL 10×Taq 酶緩沖液、3 μL dNTP、5 μL引物、1 μL DNA模板、35 μL雙蒸水和1 μL Taq 酶。 PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性40 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，循環數為35；72 ℃充分延伸10 min；4 ℃保存。 PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，目標片段由上海生物技術工程有限公司測序。測序結果登陸GenBank進行 BLAST比對。

1.2.5 菌株發酵性能檢測

1.2.5.1 液體發酵培養

取1環菌種接種到種子培養基中，37 ℃，180 r/min培養12 h后按照1.2%的接種量接入發酵培養基中進行培養，期間每隔4 h取樣2 mL，進行菌體生長情況及產酶量的檢測。

1.2.5.2 阿膠納豆的制作

參照文獻[18]的方法進行阿膠納豆的制作，制作完成后對其進行感官評價、纖溶酶活力、蛋白酶活力以及游離氨基酸總量的檢測。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

2.1.1 菌株初篩結果

利用稀釋涂布的方法從不同產地的豆豉中篩選到1286株具有酪蛋白分解能力的菌株，將其點種于酪蛋白平板上進行培養后獲得水解圈直徑與菌落直徑比較大的菌株278株，命名為LZ1～LZ278。不同菌株在篩選平板上形成的水解圈見圖1，圖1中a為產酶菌株在酪蛋白平板上形成的透明圈。

圖1 不同菌株在篩選平板上形成的水解圈

注：a為酪蛋白平板；b為纖維蛋白培養平板。

2.1.2 菌株復篩結果

菌株復篩時發現如按照1.2.2的方法進行，雖然能對不同菌株的產酶能力進行有效檢測，但是檢測過程費時、費力而且效率較低。因此對復篩方法進行改進，將初篩獲得的菌株用滅菌牙簽點種到纖維蛋白培養平板上，培養后通過計算水解圈直徑與菌落直徑的比進行篩選。圖1中b為不同菌株在纖維蛋白培養平板上所形成的透明圈。為驗證改進方法的可行性，在278株菌中隨機挑選了30株，利用兩種方法進行篩選，結果見表1。

表1 兩種菌株復篩方法對隨機菌株的檢測Table 1 Detection of random strains by two screening methods

為了便于觀察，按照酶活力從小到大的順序在表中列出，由表1可知，對于產纖溶酶能力弱的菌株無法形成透明圈，隨著產酶能力的增加，直徑比值也呈現出增大的趨勢，雖然也有酶活力高直徑比相對低的情況發生，但該變化對酶活力和直徑比之間的關聯性并未影響。纖維蛋白培養平板的方法具有方便、快捷、高效的優點，因此，可以選用此方法進行菌株復篩。

通過改進的復篩方法在278株菌株中篩選到3株菌的直徑比大于5.50，分別為LZ32，LZ209，LZ-238，其直徑比和纖溶酶活力分別為5.71，25.31 U/mL；5.58，25.26 U/mL；5.82，26.32 U/mL。選擇LZ-238進行后續研究。

2.2 LZ-238形態及生理生化特性

LZ-238在固體培養基上菌落細小，菌落直徑2～5 mm，多為圓形，凸起，表面光滑，邊緣整齊，呈灰白色。顯微鏡鏡檢為革蘭氏陽性菌，大小(2～5) μm×(0.4～0.6) μm，能產生橢圓形芽孢。對菌株LZ-238進行生理生化特征測定，結果見表2。參考伯杰氏鑒定手冊，可初步判定菌株LZ-238為芽孢桿菌屬微生物。

表2 LZ-238的主要生理生化特征Table 2 Main physiological and biochemical characteristics of LZ-238

注：“+”表示陽性；“-”表示陰性。

2.3 LZ-238 16S rDNA系統發育分析

以LZ-238基因組DNA為模板，用細菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') PCR擴增16S rDNA單一條帶大約為1500 bp。將PCR產物送至上海生工公司進行測序。將所測序列在NCBI GenBank數據庫中進行BLAST比對，分析結果表明：與LZ-238同源性最高的前10株菌以枯草芽孢桿菌為主。應用MEGA 6.0軟件中鄰接法(neighbour-joining methods，NJ)構建菌株系統發育進化樹，見圖2。

圖2 菌株LZ-238的16S rDNA基因序列系統發育進化樹

由圖2可知，菌株LZ-238與地衣芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)聚為一個分支上。結合形態、生理生化特征試驗及16S rDNA全序列分析的系統發育研究結果，可以將LZ-238的分類定位為B.amyloliquefaciensLZ-238。

2.4 LZ-238發酵性能

2.4.1 液體發酵性能

利用產酶發酵培養基對菌株LZ-238進行液體培養，其生長曲線及產酶進程見圖3。

圖3 地衣芽孢桿菌LZ-238的生長曲線和產酶曲線

由圖3可知，0～4 h為菌株的生長延滯期，4 h后菌株的增殖速度加快，進入生長對數期，培養28 h后菌株生長進入穩定期，一直維持到36 h后進入衰亡期。對比產酶曲線可以發現在培養8 h后纖溶酶開始大量生成，16～24 h為發酵產酶的高峰期。發酵28 h后酶活水平趨于平穩，在32 h檢測到酶活的最高值為28.12 U/mL，隨后酶活力呈現下降趨勢。由發酵結果可以看出LZ-238菌株的產酶過程穩定，產酶量較高，如作為出發菌株，輔于工業誘變選育技術可望篩選獲得性能較好的生產菌株，具有較高的生成應用價值。

2.4.2 阿膠納豆

以LZ-238為發酵菌株，參照文獻[18]的方法進行阿膠納豆的制作，同時與納豆芽孢桿菌進行對比。制作完成后對兩種納豆進行感官評價、纖溶酶活力、蛋白酶活力以及游離氨基酸總量的檢測。

表3 地衣芽孢桿菌LZ-238與納豆芽孢桿菌 發酵阿膠納豆的性能比較Table 3 Comparison of fermentation performance of B. licheniformis LZ-238 and B. natto

由表3可知，LZ-238作為阿膠納豆的發酵菌株具有優良的性能，其發酵產物的纖溶酶活力、蛋白酶活力、以及游離氨基酸總量均比納豆芽孢桿菌高，其中纖溶酶活力更是高出2.34倍。更值得注意的是在感官評價上LZ-238菌株的評分也比納豆芽孢桿菌高，原因可能是其發酵的阿膠納豆具有豆豉的特有香氣且幾乎無氨味，更符合中國人的口味。

3 結論

本研究采用酪蛋白平板初篩和纖維蛋白培養平板復篩的方法從眾多豆豉樣品中分離獲得一株纖溶酶的高產菌株LZ-238，經生理生化特征分析結合16S rDNA序列分析，鑒定其為地衣芽孢桿菌。LZ-238的液體發酵研究表明菌株具有良好的發酵性能，在發酵32 h后檢測到最高酶活力為28.12 U/mL。在阿膠納豆的制作方面，其發酵產品在纖溶酶活力、蛋白酶活力和游離氨基酸含量方面均比納豆芽孢桿菌的發酵產品具有優勢。由于菌株來源于中國傳統食品豆豉，其發酵的阿膠納豆幾乎沒有氨味且具有特殊的豆豉香氣，更容易被國人所接受。綜上所述，LZ-238菌株無論作為纖溶酶的生產菌株還是作為納豆的發酵菌株均具有優良的性能，如能進一步研究開發將具有良好的應用前景。

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Research on Screening and Fermentation Properties of Fibrinolysin Producing Strains from Fermented Soya Beans

ZHOU Xiu-ling, YANG Yan-chuan, LIU Lu, ZHANG Yang*

(College of Life Science, Liaocheng University,Liaocheng 252000,China)

Two hundred and seventy-eight strains of protease-producing strains are isolated from traditional Chinese fermented soybean food by using casein-plate method and one strain of highest fibrinolytic enzyme producing strains is screened by fibrin-plate method, which is named as LZ-238. Based on morphology, physiological and biochemical characteristics, LZ-238 is identified by 16S rDNA sequences and systematic analysis. The results indicate that 16S rDNA sequences of LZ-238 have 99.5% similarity to the partial sequence ofBacilluslicheniformis, suggesting that LZ-238 is categorized asB.licheniformis, and denominated asB.licheniformisLZ-238. The fermentation performance of LZ-238 under shaking and donkey-hide glue natto production is inspected preliminarily. Fibrinolytic enzyme activity ofB.licheniformisLZ-238 reaches 28.12 U/mL. The donkey-hide glue natto produced byB.licheniformisLZ-238 has less ammonia smell and is more in line with Chinese taste.

fermented soya beans;fibrinolysin;screening;strain identification

2017-02-16 *通訊作者

山東省自然科學基金(2014ZRB01A1N)；聊城大學博士科研啟動基金(31805)；聊城大學大學生科技文化創新基金(SF2014263)

周秀玲(1983-)，女，山東萊蕪人，碩士，研究方向：食品發酵； 張揚(1988-)，男，山東茌平人，博士，研究方向：食品發酵。

TS201.25

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.07.009

1000-9973(2017)07-0041-05