曬醋中功能芽孢桿菌的篩選

趙長青，鄭麗丹，陳菲菲，張毅

(1.四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢 643000；2.四川省川南曬制麩醋生物釀造技術工程實驗室，四川 自貢 643000)

曬醋中功能芽孢桿菌的篩選

趙長青1*，鄭麗丹1，2，陳菲菲1，張毅1

(1.四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢 643000；2.四川省川南曬制麩醋生物釀造技術工程實驗室，四川 自貢 643000)

在曬醋中含有大量的功能保健因子，因此，從醋醅中篩選出能提升曬醋功能保健因子形成的芽孢桿菌具有重要意義。實驗先從曬醋醋醅中初篩出芽孢桿菌，以總黃酮和總酚為功能因子指標，對初篩的菌株進行復篩。隨后，將復篩出的一株菌株進行菌落特征觀察，對其進行生理生化實驗，并進行DNA序列測序，最終確定菌株所屬種類。結(jié)果表明：本實驗共篩出57株芽孢桿菌，其中菌株YB-49在發(fā)酵液中產(chǎn)總黃酮和總酚含量較高，分別為154.6,52.8 μg/mL，被選為目的菌株。DNA鑒定結(jié)果表明：菌株YB-49與BacilluscereusATCC 14579序列相似度最高，結(jié)合菌株YB-49的菌落特征、生理生化特征結(jié)果，可將YB-49鑒定為蠟質(zhì)芽孢桿菌(B.cereus)。將該類芽孢桿菌進行進一步研究，可應用于曬醋傳統(tǒng)釀造工藝。

曬醋；芽孢桿菌；總黃酮；總酚；篩選

傳統(tǒng)食醋有著上千年的歷史，世界上比較著名的傳統(tǒng)食醋有意大利傳統(tǒng)香脂醋、日本米醋、西班牙葡萄酒醋等，在我國食醋產(chǎn)業(yè)有著非常悠久的歷史，其釀造工藝是我國古代勞動人民智慧的結(jié)晶[1]。川南曬醋作為我國“四大名醋”之一，其主要特點為以麩皮、大米為釀造的主要原料，輔以多種中草藥制成藥曲，經(jīng)蒸煮、發(fā)酵、日曬陳釀而成，具有酸味醇厚、微甜爽口、回味悠長、久存不腐的特點，還有增強消化功能、增強體力、增強機能免疫力和抗衰老、降血壓、生血等獨特功能，是一種不可多得的防病保健調(diào)味食品，深受人們歡迎。

在川南曬醋釀造中，微生物的代謝對發(fā)酵產(chǎn)物的特性影響很大。有研究表明：芽孢桿菌在醋酸發(fā)酵階段大量分布，而且與醋酸菌協(xié)同參與發(fā)酵，對食醋中活性物質(zhì)的形成具有促進作用，已有研究表明醋中含有大量的黃酮類、多酚類物質(zhì)，是重要的功能保健因子[2]。目前，本課題組已經(jīng)對食醋功能菌的研究有一定的前期基礎。本試驗從四川麩醋醋醅中篩選出一株產(chǎn)總酮和總酚較高的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，在優(yōu)化條件下，總酚含量可達229.8 μg/mL，總黃酮含量可達241.9 μg/mL；并對其發(fā)酵特性進行了研究，發(fā)現(xiàn)在最適發(fā)酵條件下，總酚可達263.3 μg/mL，總黃酮可達293.2 μg/mL[3-5]。目前尚未發(fā)現(xiàn)對曬醋中功能菌的研究。因此，從川南曬醋醋醅中分離篩選出能夠提升功能保健因子(黃酮類、多酚類物質(zhì))形成的芽孢桿菌具有重要意義。

本文擬從曬醋醋醅中分離出芽孢桿菌，然后將芽孢桿菌進行培養(yǎng)，以總黃酮和總酚為功能因子指標，篩選出能在發(fā)酵液中形成較多該功能因子的芽孢桿菌。

1 實驗部分

1.1 培養(yǎng)基的配制

1.1.1 富集培養(yǎng)基

可溶性淀粉3 g，蛋白胨10 g，酵母膏3 g，磷酸二氫鉀1.5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.1 g，蒸餾水1 L，pH 7.2，于121 ℃滅菌20 min。

1.1.2 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 L，pH 7.2，于121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

蛋白胨1 g，葡萄糖1 g，豆粕5 g，麩皮3 g，硫酸銨0.05 g，硫酸錳0.01 g，硫酸鎂0.10 g，磷酸氫二鉀0.05 g，蒸餾水1 L，pH 7.2，于121 ℃滅菌20 min。

1.1.4 LB培養(yǎng)基

胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，pH 7.2，于121 ℃滅菌20 min。

1.2 芽孢桿菌的初篩

取4 g曬醋醋醅于100 mL滅菌蒸餾水中，充分震蕩3～5 min后，過濾。然后取2 mL濾液于100 mL富集培養(yǎng)基中，置于37 ℃，150 r/min培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。富集培養(yǎng)完成后，將富集培養(yǎng)基放在90 ℃水浴鍋中加熱5 min，殺滅菌體，使芽孢得到富集。再取富集的芽孢桿菌液稀釋到10-1～10-2020個梯度。稀釋完成后，將不同濃度的菌液分別接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進行平板涂布，然后置于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h。從平板上選擇菌落形態(tài)不同且處于單獨位置的菌株，待長出菌苔后，進行鏡檢，按無菌操作方法在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進行劃線分離，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每隔6 h觀察菌體生長情況。重復此操作，直至出現(xiàn)單一菌落后，將該單一菌落接種到營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基中，然后分別進行編號，最后放于4 ℃冰箱保存。

1.3 芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)

將經(jīng)過初篩后保藏于斜面培養(yǎng)基中的芽孢桿菌分別接種2環(huán)至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，使其初始菌落數(shù)為1×107～3×107cfu/mL，置于37 ℃，120 r/min培養(yǎng)箱中培養(yǎng)46 h，然后進行發(fā)酵液總黃酮和總酚含量的測定。

1.4 發(fā)酵液總黃酮的測定

本實驗采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測定發(fā)酵液中的總黃酮含量[6]。黃酮類化合物中的3-羥基、4-羥基、5-羥基、4-羰基或鄰二位酚羥基會與鋁鹽進行絡合反應，在堿性條件下生成紅色的絡合物。

1.5 發(fā)酵液總酚的測定

本實驗采用福林-酚法測定發(fā)酵液中的總酚含量[7]。在堿性溶液中，福林-酚試劑可以將多酚化合物定量氧化，同時自身被還原生成藍色的化合物，藍色的深淺程度與含酚基團的數(shù)目成正比。

1.6 形態(tài)觀察

將所篩選的菌株進行菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色和芽孢染色。

1.7 菌種的生理生化特征

以產(chǎn)總黃酮和總酚的能力為標準對初篩篩選出的菌株進行生理生化試驗，包括甲基紅試驗、V.P試驗、吲哚試驗、檸檬酸鹽利用、耐鹽性、淀粉水解、接觸酶試驗、糖發(fā)酵產(chǎn)酸[8]。

1.8 目的菌株DNA的提取與送檢[9，10]

CTAB法的全稱是十六烷基三甲基溴化銨法，利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)在高離子強度的溶液中可以與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復合物，但是卻不能沉淀核酸的原理，并充分結(jié)合酶法、SDS法提取DNA，通過有機溶劑的抽提去除蛋白質(zhì)、多糖、酚類等雜質(zhì)，并加入異丙醇沉淀使核酸分離出來。

步驟如下：首先接種2環(huán)菌種于液體LB培養(yǎng)基中，150 r/min，37 ℃搖床培養(yǎng)12 h。然后收集菌體于2 mL離心管中，再加入500 μL CTAB溶液和50 μL溶菌酶(100 mg/mL)，置于225 r/min，37 ℃搖床培養(yǎng)過夜。在經(jīng)過溶菌酶作用后的菌液中加入250 μL 20% SDS和25 μL蛋白酶(20 mg/mL)，置于65 ℃恒溫水浴鍋中水浴1 h，每15 min震蕩混勻1次。當水浴完成后，將離心管于-80 ℃冰箱冷凍15 min后再置于65 ℃恒溫水浴鍋中水浴15 min，如此反復3次。再加入與離心管中液體等體積的tris酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)，經(jīng)過渦旋混勻后靜置10 min。然后于12000 r/min離心15 min，取上清液，重復至無白色沉淀為止。然后，加入等體積的氯仿-異戊醇(24∶1)，經(jīng)過渦旋混勻后靜置10 min，于12000 r/min離心15 min，取上清液。在取得的上清液中加入0.6倍體積的預冷異丙醇并混勻，放入-20 ℃冰箱中沉淀1 h。沉淀完成后，于4 ℃，12000 r/min離心15 min，棄去上清液取沉淀。隨后用1 mL乙醇(70%)洗滌，再于4 ℃，12000 r/min離心15 min，取沉淀重復1次。然后將離心管于超凈工作臺烘干至無酒精味后加入50 μL無菌雙蒸水，放入65 ℃恒溫水浴鍋中水浴1 h。最后將所提取的DNA送至上海杰李生物技術有限公司測序，獲得DNA拼接序列。測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進行比對并采用MEGA 6.0軟件(鄰接法)構(gòu)建16S rRNA 系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 醋醅中芽孢桿菌的初篩

本實驗從四川曬醋醋醅中初篩獲得了57株芽孢桿菌菌株，編號為1#～57#。

2.2 發(fā)酵液總黃酮的測定

根據(jù)蘆丁標準曲線，通過測定各菌株在37 ℃，120 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)46 h后發(fā)酵液中的總黃酮含量(單位為μg/mL)，得到表1。

表1 各菌株發(fā)酵46 h后總黃酮含量測定結(jié)果 μg/mL

由表1可知，所篩選的菌株中，僅有22#和35#，44#，48#，49#菌株的總黃酮含量呈較高水平。49#菌株在46 h發(fā)酵時總黃酮含量最高，為154.6 μg/mL，22#，35#，48#和44#菌株次之，含量分別為150.8，149.9，140.6，136.6 μg/mL，大多數(shù)菌株總黃酮含量處在50.0～120.0 μg/mL之間，其中41#菌株最低，含量僅為30.9 μg/mL。前期實驗中，我們通過對發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵特性進行優(yōu)化，從麩醋醋醅中所篩選出的Bacillusamyloliquefaciens產(chǎn)總黃酮可達293.2 μg/mL。本實驗中，49#菌株產(chǎn)總黃酮含量與Bacillusamyloliquefaciens所產(chǎn)總黃酮含量差距較大，但經(jīng)過將來發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵特性的優(yōu)化研究后，相信49#菌株產(chǎn)總黃酮能力會得到進一步提升。

2.3 發(fā)酵液總酚的測定

根據(jù)沒食子酸標準曲線，通過測定各菌株在37 ℃，120 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)46 h后發(fā)酵液中的總酚含量(單位為μg/mL)，得到表2。

表2 菌株發(fā)酵46 h后總酚含量測定結(jié)果 μg/mL

續(xù) 表

由表2可知，大部分菌株總酚含量一直處于較低水平。其中，10#，16#，49#菌株在46 h發(fā)酵時總酚含量相對較高，分別為58.3，48.2，52.8 μg/mL。而其他菌株的總酚含量在5.6～40.3 μg/mL，15#菌株含量最低，僅有5.6 μg/mL。盡管49#的總酚含量略低于10#，但49#的總黃酮含量(154.6 μg/mL)顯著高于10#(77.6 μg/mL)。因此，49#可作為復篩的目的菌株。前期實驗中，我們從麩醋醋醅中所篩選出的Bacillusamyloliquefaciens，在對其進行發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵特性優(yōu)化后，產(chǎn)總酚可達263.3 μg/mL，在優(yōu)化前產(chǎn)總酚為49.7 μg/mL。本實驗中，49#菌株產(chǎn)總酚含量與Bacillusamyloliquefaciens在進行發(fā)酵條件優(yōu)化前所產(chǎn)總酚含量相比，含量更高。因此，本次所篩選出的49#芽孢桿菌具有進一步研究的價值。

通過對初篩所得的57株菌株產(chǎn)總黃酮和總酚能力的測定，選擇產(chǎn)總黃酮和總酚能力較強的芽孢桿菌，將一株產(chǎn)黃酮類和多酚類物質(zhì)較多的菌株49#，作為目的菌株，命名為YB-49。

2.4 菌種形態(tài)觀察結(jié)果

2.4.1 菌落形態(tài)觀察結(jié)果

菌株YB-49的菌落觀察結(jié)果見圖1。

圖1 菌株YB-49的菌落形態(tài)

YB-49在瓊脂培養(yǎng)基上生成的菌落較大，呈圓形，生長24 h后菌落直徑約為8～10 mm，色澤為暗奶油色，不透明，表面粗糙似融蠟狀，無特殊氣味。

2.4.2 革蘭氏染色和芽孢染色結(jié)果

菌株YB-49的革蘭氏染色結(jié)果見圖2，芽孢染色結(jié)果見圖3。

圖2 革蘭氏染色鏡檢圖片(1000倍)

圖3 芽孢染色鏡檢圖片(1000倍)

YB-49經(jīng)革蘭氏染色后，發(fā)現(xiàn)菌體呈藍紫色，為陽性，菌體呈桿狀，兩端較平整鈍圓，一般為短鏈或長鏈，寬度約為0.8～1.0 μm，長度約為3.0～5.0 μm。經(jīng)芽孢染色后，發(fā)現(xiàn)芽孢呈孔雀綠色，芽孢完整，呈橢圓形，分布均勻，芽孢囊不膨大。

2.5 生理生化特征

表3 生理生化試驗鑒定結(jié)果

注：“+”表示“有”或“陽性”；“ -”表示“無”或“陰性”。

由表3可知，對菌株YB-49的甲基紅試驗、V.P試驗、檸檬酸鹽利用、硝酸鹽利用、需氧性、過氧化氫酶試驗均為陽性，吲哚試驗為陰性，說明YB-49生長需氧，能水解淀粉和蛋白質(zhì)，能耐受5%的NaCl，能利用葡萄糖、阿拉伯糖產(chǎn)酸，能利用檸檬酸鹽和硝酸鹽，能將H2O2催化分解成H2O和O2，具有發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乙酰四基甲醇的能力。結(jié)合該菌株的革蘭氏染色和芽孢染色結(jié)果，依據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》及《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，將其初步鑒定為芽孢桿菌屬。

2.6 目標菌DNA序列的鑒定

測序獲得YB-49的DNA序列，經(jīng)過在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與其相似度較高的菌株均為芽孢桿菌屬，選取相關菌株，利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖4)，菌株YB-49與B.cereusATCC 14579 列為同一分支，親緣關系最近。同時結(jié)合菌株YB-49的生理生化特征，查閱《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，可將菌株YB-49鑒定為蠟質(zhì)芽孢桿菌(B.cereus)。

圖4 菌株YB-49的系統(tǒng)發(fā)育樹

蠟質(zhì)芽孢桿菌具有獨特優(yōu)勢，因而在許多領域都有廣泛應用。首先，蠟質(zhì)芽孢桿菌可作為拮抗細菌。芽孢桿菌(Bacillus)不僅能產(chǎn)生抗病的生理活性物質(zhì)，而且是預防病蟲害微生物的重要組成部分，尤為突出的便有蠟質(zhì)芽孢桿菌(B.cereus)。作為生物防治中研究和應用比較廣泛的拮抗細菌，蠟質(zhì)芽孢桿菌及其產(chǎn)生的代謝物正越來越受到人們的重視。不但其本身可以被制成微生物菌劑和微生物肥料，其產(chǎn)生的生理活性物質(zhì)也是種類豐富，其中包括細菌素、多肽抗生素、酶類、殺蟲外毒素、激素、溶血素等[11，12]。另外，產(chǎn)生各種酶類并通過這些酶類抑制、降解、水解其他病原體，也是蠟質(zhì)芽孢桿菌表現(xiàn)在生物防治應用上的一種途徑。蠟質(zhì)芽孢桿菌產(chǎn)生的生理活性物質(zhì)還有溶血素、β-瓊脂糖酶、幾丁質(zhì)酶、用于皮革工業(yè)的膠原蛋白酶等[13]。

此外，蠟質(zhì)芽孢桿菌的營養(yǎng)要求少，培養(yǎng)條件低，生長速度快，生長旺盛，對外界不良環(huán)境有一定的抵抗力。對于醋品的生產(chǎn)而言，雖然主要依賴產(chǎn)酸能力極強的醋酸菌，但同時蠟質(zhì)芽孢桿菌等一系列芽孢桿菌對于成品醋香氣成分的形成和醋液口感也有著很大的影響，這也是各地生產(chǎn)的醋口感與香味不同的重要原因[14]。因此，通過后續(xù)對該菌株進一步研究、優(yōu)化和改良后，可將該蠟質(zhì)芽孢桿菌運用在曬醋釀造工藝中，從而提高曬醋品質(zhì)。

3 結(jié)論

經(jīng)富集培養(yǎng)，從曬醋醋醅中共篩選出57株芽孢桿菌，以產(chǎn)總酚和總黃酮的能力為指標，篩選出一株產(chǎn)黃酮類和多酚類物質(zhì)較多的菌株，命名為YB-49。通過對該菌株進行形態(tài)特征觀察、生理生化特征鑒定和DNA序列分析，將YB-49菌株鑒定為Bacilluscereus。該菌株能夠產(chǎn)總黃酮154.6 μg/mL，產(chǎn)總酚52.8 μg/mL。該篩選出的Bacilluscereus可應用于曬醋傳統(tǒng)釀造工藝，以期增加曬醋中的黃酮類和酚類物質(zhì)，提升中國曬醋的品質(zhì)。

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Screening of Functional Bacillus Strains from Sun Vinegar

ZHAO Chang-qing1*, ZHENG Li-dan1，2, CHEN Fei-fei1, ZHANG Yi1

(1.College of Bioengineering, Sichuan University of Science and Engineering, Zigong 643000, China；2.Engineering Laboratory for Biological Brewing Technology of Bran Vinegar in the South of Sichuan, Zigong 643000, China)

As there are a lot of functional healthy factors in sun vinegar, it is significant to selectBacilluswhich can enhance the forming of functional factors in sun vinegar. In this experiment,Bacillusstrains are preliminarily separated from vinegar grains and the separated strains are secondarily screened with total phenols and ketones as the function factors. And then,it is observed for the characteristics of the colonies. In addition, its physiological and biochemical characteristics are detected. Finally,the DNA sequence is sequenced which ultimately determines the kind of the strain. The results show that 57Bacillusstrains are preliminarily separated in total. Among them, the strain YB-49 is selected as the target strain with the total phenols content of 52.8 μg/mL and the total ketones content of 154.6 μg/mL, which are obviously higher. DNA identification shows that the similarity of the strain YB-49 andB.cereusATCC 14579 is the highest. Compared to the results of the colony characteristics, bacterial morphology, physiological and biochemical characteristics, the YB-49 is identified asB.cereus. The isolatedB.cereuscould be further studied and used to the traditional brewing technology of vinegar.

sun vinegar；Bacillus；total ketones；total phenols；screening

2017-02-08 *通訊作者

固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室項目(2015GTJ003)；四川省經(jīng)濟和信息化委員四川省重點技術創(chuàng)新項目計劃(2015LZ00264)；固態(tài)釀造關鍵技術研究四川省院士(專家)工作站(GY2015-02)

趙長青(1981-)，女，副教授，博士，研究方向：食品微生物。

TS264.22

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.07.015

1000-9973(2017)07-0067-05