雙菌株混合發酵生產桑葚果醋工藝的研究

汪曉琳

(江蘇食品藥品職業技術學院，江蘇 淮安 223003)

雙菌株混合發酵生產桑葚果醋工藝的研究

汪曉琳

(江蘇食品藥品職業技術學院，江蘇 淮安 223003)

以桑葚為原料，對其果醋生產工藝中的酒精發酵、醋酸發酵進行研究，通過單因素和正交設計試驗，確定了果醋生產過程中酒精發酵階段最佳工藝條件為：初始糖度15%，果汁pH 4.5，酵母接種量10%，發酵溫度30 ℃，此時酒精度達到6.03%；醋酸發酵最佳工藝條件為：初始酒精度9%，AS1.41醋酸菌接種量10%，滬釀1.01醋酸菌接種量9%，發酵溫度32 ℃，在此工藝條件下，桑葚果醋產酸量最終達到5.95 g/dL，果醋香氣濃郁，醋味純正，是眾多果醋產品中的佳品。

桑葚果醋；多菌種；酒精發酵；醋酸發酵

桑葚(Fructusmori)是桑樹成熟的果實，因酸甜適口、肉厚汁多而深受廣大消費者的喜愛。我國是桑葚種植大國，經統計，除青藏高原外，全國各地均有栽培，桑葚品種、產量均居世界首位[1,2]。隨著現代農業的快速發展，桑葚的產量也逐年增加，由于桑葚上市周期短，且貯運保鮮技術尚不成熟，導致果實積壓嚴重。目前，采摘的桑葚鮮果除少量鮮食外，剩余部分可加工成果汁、果酒、果醬，以提高產品的利用率和附加值。以桑果為原料經發酵工藝釀造的果醋不僅具有桑葚特有的果香口感，而且還具有普通食醋的保健價值，現已成為桑葚開發利用的新興食品[3,4]。

目前有關桑葚果醋發酵工藝的研究報道，大部分均采用單一的酵母菌和醋酸菌為菌種進行釀造，如吳婧婧等[5]在經安琪酵母發酵好的果酒中接入AS1.41惡臭醋酸桿菌，成功釀造了酸度為5.95 g/L的桑葚果醋。針對桑葚果醋采用雙菌株混合發酵尤其是在醋酸發酵階段應用兩種菌株進行發酵的報道尚不多見。本研究在桑葚果醋醋酸發酵階段采用兩種不同醋酸菌進行混合發酵，通過兩種菌在發酵過程中的協同作用，不僅提高果醋中醋酸含量，而且使果醋口感更純正，提高了桑葚果實利用率，生產過程中的醋渣又可作為畜禽飼料再度利用，具有很好的發展前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚：市售。

活性干酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；醋酸菌AS1.41及滬釀1.01：本實驗室保藏。

白砂糖：市售一級；瓊脂、葡萄糖、CaCO3、酵母膏：國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉：無錫展望化工試劑有限公司。

醋酸菌保藏培養基：酵母膏1%，葡萄糖1%，瓊脂1.5%，121 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫后加入2%的CaCO3和3%的酒精。

醋酸菌種子培養基：酵母膏1%，葡萄糖1%，121 ℃滅菌20 min，使用前加入3%的酒精。

醋酸菌擴培培養基：經酒精發酵并過濾處理后所得的桑葚果酒。

1.2 儀器與設備

JYZ-D55型水果榨汁機 九陽股份有限公司；ZHW-200B型恒溫震蕩培養箱 上海智誠分析儀器制造有限公司；YM75Z型高壓蒸汽滅菌鍋 上海三申醫療器械有限公司；SW-CF-IF型超凈工作臺 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；DYY-2B酒精計 金壇市恒豐儀器廠；ME204E型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；WYT-I 型手持糖量計 成都泰華光學有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葚果醋制作工藝流程

桑葚→清洗→榨汁→過濾→調pH→調節糖度→滅菌→酒精發酵→過濾→醋酸發酵→澄清→過濾→調配→精濾→滅菌→灌裝→二次滅菌→冷卻→桑葚果醋。

1.3.2 操作要點

原料處理：挑選個大飽滿的桑葚果實，洗凈并去除果蒂，用水果榨汁機進行打漿處理，并用潔凈的紗布對果漿進行過濾，制得桑葚果汁。

酵母活化：稱取一定量的干酵母，加入酵母量30倍的純化水，攪拌均勻，于35 ℃下活化30～60 min即可使用。

醋酸菌活化：將兩種醋酸菌分別按10%的接種量轉接到滅菌好的種子培養基中，于30 ℃的恒溫震蕩培養箱中培養5天，備用。

酒精發酵：桑葚果汁經過過濾后，取100 mL裝入到500 mL的三角燒瓶中，接入已活化好的酵母菌，研究酵母菌接種量(5%，10%，15%，20%，25%)、果汁pH(3.5，4.0，4.5，5.0，5.5)、果汁糖度(8%，10%，12%，14%，16%)、發酵溫度(26，28，30，32，34 ℃)在酒精發酵過程中對桑葚果酒酒精度的影響。根據單因素試驗所得的結果，每個因素選取3個水平采用正交試驗對酒精發酵工藝進行進一步的優化。

醋酸發酵：將桑葚果酒過濾除去酵母后按20%的裝液量轉接到搖瓶中，分別接入已活化好的AS1.41醋酸菌和滬釀1.01醋酸菌進行醋酸發酵，研究AS1.41醋酸菌接種量(4%，6%，8%，10%，12%，14%)、滬釀1.01醋酸菌(4%，6%，8%，10%，12%，14%)、酒精度(2%，4%，6%，8%，10%)、發酵溫度(26，28，30，32，34 ℃)對最終所得桑葚果醋的產酸量的影響。根據單因素試驗所得的結果，每個因素選取3個水平采用正交試驗對果醋醋酸發酵工藝進行進一步的優化。

1.3.3 分析方法

糖度測定：采用手持糖度計測定。

pH值測定：采用酸度計法測定。

酒精度測定：采用酒精比重計法，經過酒精發酵后得到的桑葚果酒進行蒸餾以除去不揮發性成分，將酒精計洗凈擦干，緩緩放入到蒸餾出的酒精水溶液中，待其靜止后進行讀數，同時采用溫度計對其溫度進行測定，通過查表，換算出溶液的酒精度[6-8]。

酸度測定：采用酸堿中和滴定法，取10 mL的桑葚果醋，定容至100 mL后，移取20 mL至錐形瓶中，用氫氧化鈉標準滴定液進行滴定，以酚酞溶液為指示劑，當溶液變為淺粉紅色時為滴定終點[9-11]。果醋酸度(以醋酸計)計算公式如下：

式中：X為果醋醋酸含量(g/dL)；C為NaOH標準滴定液的濃度(mol/L)；△V為滴定過程中消耗的NaOH體積(mL)；20.00為錐形瓶中果醋稀釋液體積(mL)；60為果醋中醋酸的摩爾質量(g/mol)。

2 結果與分析

2.1 桑葚果醋酒精發酵試驗

2.1.1 酵母接種量對果酒中酒精度的影響

桑椹果漿經過過濾后加入白砂糖調節糖度至10%，pH控制在4.0，分別接入5%，10%，15%，20%，25%已活化好的酵母液，在30 ℃下500 mL的三角燒瓶中培養4天后取出并對其酒精度進行測定，結果見表1。

表1 酵母接種量對果酒中酒精度的影響Table 1 Effect of yeast inoculation amount on alcohol content of mulberry wine %

由表1可知，隨著酵母接種量的提高，桑葚果酒中的酒精度也逐漸上升，當酵母接種量達到10%時果酒中酒精度達到最高，為5.41%，繼續增大酵母接種量，其果酒中酒精度出現下降，由于桑葚果汁中營養物質是有限的，當酵母接種量增大時，有限的營養被大量消耗在酵母生長過程中，導致在產物積累時因營養不夠而出現酒精度下降。因此，酵母接種量以10%為宜。

2.1.2 發酵溫度對果酒中酒精度的影響

在酒精發酵過程中，調節桑椹果漿糖度至10%，pH控制在4.0，接入10%已活化好的酵母液，設置發酵搖床的溫度分別為26，28，30，32，34 ℃，培養4天后測定桑葚果酒的酒精度，結果見表2。

表2 發酵溫度對果酒中酒精度的影響Table 2 Effect of fermentation temperature on alcohol content of mulberry wine

由表2可知，當發酵溫度為30 ℃時，桑葚果酒酒精含量最高，酒精度達到5.46%，溫度過低或者過高都會阻礙酵母菌的生長，導致果酒中酒精含量偏低，因此在桑葚果醋酒精發酵過程中選擇發酵溫度為30 ℃較為合適。

2.1.3 糖度對果酒中酒精度的影響

桑椹果漿過濾后，采用白砂糖調節桑椹果漿糖度分別為8%,10%,12%,14%,16%，并控制果漿pH至4.0，接入10%已活化好的酵母液，設置發酵搖床的溫度為30 ℃，培養4天，采用酒精比重計測定果酒的酒精度，結果見表3。

表3 糖度對果酒中酒精度的影響Table 3 Effect of sugar content on alcohol content of mulberry wine %

由表3可知，桑葚果酒中的酒精度隨著糖度的增加呈先上升后下降的趨勢，在果汁糖度為14%時發酵所得的果酒酒精度最高，達到5.71%，糖度過低，酵母生長所需營養不夠，產物得不到有效積累；糖度過高，酵母生長受到抑制，菌體稀少，無法分泌足夠的有效產物，因此本試驗選擇果汁糖度14%為宜。

2.1.4 果汁pH值對果酒中酒精度的影響

桑椹果漿過濾后，調節桑椹果漿糖度為14%，并控制果漿pH分別為3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，按10%的接種量接入已活化好的酵母液，設置發酵搖床的溫度為30 ℃，培養4天，對所得的果酒酒精度進行測定，結果見表4。

表4 pH對果酒中酒精度的影響Table 4 Effect of pH on alcohol content of mulberry wine

由表4可知，隨著果汁pH值的逐漸升高，桑葚果酒中的酒精度也逐漸增高，當果汁pH達到4.5時，果酒中酒精度達到最大，為5.93%，繼續升高果汁pH，果酒酒精度出現下降，這可能是因為溶液過堿時阻礙了酵母的生長，導致發酵過程中酒精得不到有效積累，因此本試驗選擇果汁pH 4.5為宜。

2.1.5 酒精發酵正交試驗設計

為了進一步確定酒精發酵的最佳條件，根據以上單因素試驗所得的結果，選取酵母菌接種量、發酵溫度、糖度和果汁pH值4個因素，進行了四因素三水平的正交試驗，試驗設計及結果見表5和表6。

表5 酒精發酵試驗因素水平表Table 5 Factors and levels of orthogonal test for alcohol fermentation

表6 酒精發酵的正交試驗結果Table 6 Results of orthogonal test for alcohol fermentation

由表6可知，影響酒精發酵工藝因素主次為A>C>B>D，即接種量對果酒中酒精度的影響最大，其次是糖度，發酵溫度次之，pH對酒精發酵工藝的影響最小。由表6結果還可以分析出，A因素中A2水平即接種量為10%， B因素中B2水平即發酵溫度控制在30 ℃，C因素中C3水平即糖度為15%，D因素中D2水平即pH控制在4.5時，所得的酒精度最高，因此本次酒精發酵過程中最佳工藝組合條件為A2B2C3D2。

在正交試驗直觀分析的基礎上進一步對各數據進行方差分析，結果見表7。

表7 酒精發酵正交試驗方差分析Table 7 Analysis of variance of alcoholic fermentation orthogonal experiment

通過比較各因素的F比和F臨界值可以看出，A，B，C因素具有顯著性，即接種量、糖度及發酵溫度對酒精發酵工藝的影響較大，這與表6結果基本一致。

2.2 醋酸發酵試驗

2.2.1 菌種選擇對果醋中產酸量的影響

在桑葚果酒醋酸發酵菌種選擇過程中，我們進行了單、雙菌醋酸發酵預試驗，具體試驗方案如下：將除去酵母后的桑葚果酒過濾，按20%的裝液量轉接到搖瓶中，調整酒精度至8%，按10%接種量分別接入AS1.41醋酸單菌、滬釀1.01醋酸單菌及混合菌(10% AS1.41醋酸菌+10% 滬釀1.01醋酸菌)進行醋酸發酵，控制發酵溫度為30 ℃，經過發酵得到的桑葚果醋中的產酸量見表8。

表8 單菌發酵與混合菌發酵對果醋中產酸量的影響Table 8 Effect of single strain and mixed strains fermentation on acidity of fruit vinegar g/dL

由表8可知，桑葚果醋醋酸發酵過程中，將滬釀1.01醋酸菌和AS1.41醋酸菌混合發酵后果醋中產酸量最大，AS1.41醋酸單菌發酵產酸量次之，滬釀1.01醋酸單菌發酵產酸量最低。AS1.41醋酸菌耐受酒精濃度為8%，最高產醋酸量為7%～9%，滬釀1.01醋酸菌是一個產酸穩定的優良菌種，氧化酒精速度快、能力強，耐酒精度達12%， 但是產酸一般為5%左右，混合發酵可以使兩菌產生協同作用，提高產酸量。

2.2.2 醋酸菌接種量對果醋中產酸量的影響

桑葚果酒酒精度調至8%，發酵溫度控制在30 ℃，研究滬釀1.01醋酸菌的接種量為10%，AS1.41醋酸菌接種量分別為4%，6%，8%，10%，12%，14%對桑葚果醋中產酸量的影響，然后在其他條件相同的情況下，固定AS1.41醋酸菌接種量為10%，考察滬釀1.01醋酸菌的接種量為4%，6%，8%，10%，12%，14%，醋酸菌接種量對果醋中產酸量的影響，具體結果見圖1。

圖1 醋酸菌接種量對果醋中產酸量的影響

由圖1可知，隨著兩種醋酸菌接種量的增加，醋酸發酵結束后果醋中的產酸量均呈先增加后降低的趨勢，其中AS1.41醋酸菌高效產酸接種量為10%，滬釀1.01醋酸菌高效產酸接種量為8%，說明AS1.41醋酸菌適合較高接種量的發酵，滬釀1.01醋酸菌在低接種量時更具有高效性。

2.2.3 初始酒精度對果醋中產酸量的影響

將桑葚果酒酒精度分別調至2%，4%，6%，8%，10%，接入10%的AS1.41醋酸菌和8%的滬釀1.01醋酸菌，發酵溫度控制在30 ℃，進行桑葚果醋醋酸發酵，桑葚果酒初始酒精度對果醋中產酸量的影響結果見圖2。

圖2 初始酒精度對果醋中產酸量的影響

由圖2可知，隨著初始酒精度的升高，果醋中產酸量也逐漸增加，當初始酒精度達到8%后繼續增加酒精度，最終得到的果酒產酸量降低，這可能是過高濃度的酒精抑制了醋酸菌的生長，使最終果醋的產酸量下降。本試驗確定在醋酸發酵前將果酒初始酒精度調至8%為宜。

2.2.4 發酵溫度對果醋中產酸量的影響

桑葚果酒酒精度調至8%，接入10%的AS1.41醋酸菌和8%的滬釀1.01醋酸菌，發酵溫度分別控制在26，28，30，32，34 ℃，進行桑葚果醋醋酸發酵，考察發酵溫度對果醋中產酸量的影響，結果見圖3。

圖3 發酵溫度對果醋中產酸量的影響

由圖3可知，隨著發酵溫度的升高，桑葚果醋中產酸量呈先增加后降低的趨勢，在溫度32 ℃時達到最大，溫度過低過高都將影響醋酸菌的正常生長，導致菌體不能很好地分泌代謝產物，因此本試驗選擇發酵溫度32 ℃較為適宜。

2.2.5 醋酸發酵正交試驗設計

為了進一步確定醋酸發酵的最佳條件，在單因素試驗結果的基礎上，選取AS1.41醋酸菌接種量、滬釀1.01醋酸菌接種量、初始酒精度、發酵溫度4個因素，進行了四因素三水平的正交試驗，試驗設計及結果見表9和表10。

表9 桑葚果醋醋酸發酵試驗因素水平表Table 9 Factors and levels of orthogonal experiment for mulberry fruit vinegar acetic acid fermentation

由表9可知，A因素中A2水平即滬釀1.01醋酸菌接種量為10%， B因素中B3水平即AS1.41醋酸菌接種量為9%，C因素中C3水平即初始酒精度為9%，D因素中D2水平即發酵溫度控制在32 ℃時，所得的醋酸量相較其他水平高，因此本試驗最佳醋酸工藝組合為A2B3C3D2。

表10 桑葚果醋醋酸發酵工藝參數正交試驗結果Table 10 Results of orthogonal experiment for mulberry fruit vinegar acetic acid fermentation technological parameters

由表10可知，影響酒精發酵工藝因素的主次為B>A>C=D，即滬釀1.01醋酸菌接種量對果醋產酸量的影響最大，其次是AS1.41醋酸菌接種量，初始酒精度和發酵溫度對醋酸發酵工藝影響最小。

在正交試驗直觀分析的基礎上進一步對各數據進行方差分析，結果見表11。

表11 桑葚果醋醋酸發酵正交試驗方差分析Table 11 Analysis of variance of orthogonal experiment for mulberry fruit vinegar acetic acid fermentation

通過比較各因素的F比和F臨界值可以看出A，B因素的顯著性最高，即滬釀1.01醋酸菌接種量和AS1.41醋酸菌接種量對醋酸發酵工藝的影響較大，這與表10結果基本一致。

2.3 產品指標

從感官品質、理化指標[12]及微生物指標[13-15]3個方面對發酵好的果醋進行測評，具體結果如下。

2.3.1 感官品質

色澤：色澤鮮亮，光澤度好；香氣：果香濃郁，醋香純正；風味：酸味柔和，無其他異味；體態：醋體澄清，無其他沉淀。

2.3.2 理化指標

果醋總酸含量(以醋酸計)為5.95 g/dL，可溶性固形物含量為5.27 g/dL，鉛含量為0.21 mg/L，砷含量為0.14 mg/L，pH為3.2。

2.3.3 微生物指標

細菌總數為32 cfu/mL，大腸菌群為1 MPN/100 mL，未檢出致病菌。

該工藝下生產出的果醋感官品質良好，理化指標及微生物指標均符合GB/T 18187-2000，GB/T 2719-2003等標準。

3 結論

桑葚果醋釀造過程中，酒精發酵的最佳工藝參數為：酵母接種量10%，糖度15%，桑葚果汁pH值4.5，發酵溫度30 ℃，在該組合條件下桑葚果酒中酒精度達到6.03%。果醋醋酸發酵的最佳工藝參數為：初始酒精度9%，AS1.41醋酸菌接種量10%，滬釀1.01醋酸菌接種量9%，發酵溫度32 ℃，在該組合條件下桑葚果醋中的產酸量最終達到5.95 g/dL，果醋感官品質較好，理化指標及微生物指標檢測均符合相關國標的要求。

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Research on Technology of Mulberry Fruit Vinegar Fermented with Double Strains

WANG Xiao-lin

(Jiangsu Food & Pharmaceutical Science College,Huai'an 223003,China)

Use mulberry as raw material, the alcohol fermentation and acetic acid fermentation are studied in the production process of mulberry fruit vinegar, the optimum technological conditions are determined in the production process of fruit vinegar by single-factor and orthogonal test, in the alcohol fermentation stage: the initial sugar content is 15%, fruit juice pH is 4.5, the yeast inoculum dosage is 10%, the fermentation temperature is 30 ℃, the alcohol content reaches 6.03% under these conditions; in the acetic acid fermentation stage:the initial alcohol content is 9%, AS1.41 acetic acid bacteria inoculation amount is 10%, Huniang 1.01 acetic acid bacteria inoculation amount is 9%, the fermentation temperature is 32 ℃, the mulberry fruit vinegar acidity eventually reaches 5.95 g/dL, the fruit vinegar has strong aroma and pure taste, and it is the best product among many kinds of fruit vinegar products.

mulberry vinegar; multi-strains; alcohol fermentation; acetic acid fermentation

2017-01-17

汪曉琳(1979-)，女，講師，碩士，研究方向：食品加工。

TS201.5

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.07.021

1000-9973(2017)07-0100-06