急慢性ITP患兒外周血調節性T細胞及相關細胞因子的表達及意義

高鳳艷，郝國平

(1.山西醫科大學，山西 太原 030001；2.山西省兒童醫院，山西 太原 030013)

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急慢性ITP患兒外周血調節性T細胞及相關細胞因子的表達及意義

高鳳艷1，郝國平2*

(1.山西醫科大學，山西 太原 030001；2.山西省兒童醫院，山西 太原 030013)

目的：檢測急性原發性免疫性血小板減少癥(AITP)、慢性原發性免疫性血小板減少癥(CITP)患兒外周血CD4+CD25+CD127-調節性T細胞(Treg細胞)、轉化生長因子(TGF-β1)、白介素-10(IL-10)的變化，探討三者在ITP發病機制中的作用。方法：流式細胞術(FCM)分別檢測35 例AITP、31 例CITP患兒及20 例健康對照兒童外周血Treg細胞百分率及血清IL-10含量，酶聯免疫吸附測定(ELISA)法檢測血清中TGF-β1含量，進行比較及相關性分析。結果：急性組Treg細胞百分率(4.23±0.82)%顯著低于對照組的(5.05±0.90)%(P<0.01)；慢性組Treg細胞百分率(3.47±0.63)%顯著低于急性組的(4.23±0.82)%(P<0.01)。急性組TGF-β1水平(189.36±66.71) pg/mL低于對照組的(231.45±113.89) pg/mL(P<0.05)，急性組IL-10含量(34.07±11.57) pg/mL低于對照組的(43.83±10.96) pg/mL(P<0.05)。TGF-β1水平及IL-10含量慢性組低于急性組，差異有統計學意義(P<0.01)。ITP患兒外周血Treg細胞百分率與TGF-β1含量呈正相關(r=0.75，P<0.01)。ITP患兒外周血IL-10含量與Treg細胞百分率、TGFβ1含量則無相關性。結論：ITP患兒Treg細胞減少及相關細胞因子含量降低可能與ITP的細胞免疫紊亂有關，免疫紊亂在慢性組尤其明顯，這可能也是慢性患兒治療效果不佳，呈現長病程的原因之一。

血小板減少癥；調節性T細胞；轉化生長因子β1；白介素10；流式細胞術

原發性免疫性血小板減少癥(ITP)是一種兒童中常見的良性出血性疾病，以免疫紊亂介導的血小板減少為特征。近年越來越多學者關注細胞免疫異常在ITP發病機制中的作用。該研究檢測ITP患兒外周血中CD4+CD25+CD127-調節性T細胞(Treg細胞)百分率及其相關細胞因子轉化生長因子(TGF-β1)與白介素-10(IL-10)含量，進一步驗證并分析Treg細胞、TGF-β1及IL-10與ITP發病的關系及可能機制。同時對ITP患兒急性者與慢性者外周血中Treg細胞百分率、TGF-β1及IL-10變化進行比較，綜合分析三者在疾病不同狀態的數量變化及其意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月—2016年6月山西省兒童醫院血液科住院和門診治療的ITP患兒66 例，均符合ITP診斷標準[1]。將初診的未使用人免疫球蛋白及糖皮質激素治療的ITP患兒納入急性原發性免疫性血小板減少癥(AITP)組，共35 例，男20 例，女15 例，年齡0.5～10 歲，中位年齡5.5 歲；將病程大于12 個月的ITP患兒納入慢性原發性免疫性血小板減少癥(CITP)組，共31 例，男17 例，女14 例，年齡3～12 歲，中位年齡7.5 歲，均符合CITP診斷標準[1]；正常對照組來自山西省兒童醫院2016年1月—3月體檢中心健康體檢者20 例，男7 例，女13 例，年齡3～10 歲，中位年齡6.5 歲。所有受試者均取得患兒家長的知情同意，并簽署知情同意書。

排除標準：長期口服抗癲癇藥所致血小板減少患兒；系統性紅斑狼瘡及其他自身免疫性疾病患兒；嚴重心肺腹及神經系統疾病患兒。

1.2 試劑和儀器

鼠抗人CD4-FITC單克隆抗體、CD25-PE單抗、CD127-APC單抗及同型對照IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC及人血清白介素10(IL-10)均為貝克曼庫爾特公司產品；酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑TGF-β1購自博士德生物公司。流式細胞儀為貝克曼庫爾特公司產品(型號：FC 500)。

1.3 試驗步驟

1.3.1 外周血CD4+CD25+CD127-Treg百分率檢測

取患兒治療前EDTA抗凝血100 μL，依次加入抗CD4-FITC、抗CD25-PE的單抗各20 μL及CD127-APC單抗5 μL，對照組加入IgG1-FITC，IgG1-PE各20 μL及IgG1-APC 5 μL，分別混勻后避光孵育25～30 min，加入紅細胞裂解液2 mL，室溫避光孵育10 min，液體澄清透明后，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，再加入2 mLPBS洗滌液混勻，同法離心棄上清，細胞則懸浮于0.5 mL PBS中，混勻后上機檢測。

1.3.2 外周血TGF-β1含量檢測

收集外周全血2 mL(采血管為黃色，即含有分離膠和促凝劑)，3 000 r/min離心5 min，取上清凍存于-70 ℃，用ELISA方法測TGF-β1含量(具體實驗過程詳見說明書)。

1.3.3 外周血IL-10含量檢測

收集外周全血2 mL，3 000 r/min離心5 min，取上清凍存于-70 ℃，用流式細胞術測IL-10含量。(IL-10的檢測是偏向于ELISA的流式細胞術)。

1.3.3.1 實驗原理

流式高通量多因子檢測技術(AimPlex)是依據一系列熒光強度不同的微球包被有特異性捕獲抗體，與待測樣本孵育后，加入檢測抗體。流式細胞儀檢測熒光，從而實現對蛋白抗原的檢測；結合抗原標準品的標準曲線，可實現對蛋白抗原的定量檢測。

1.3.3.2 標本的采集

取患兒治療前外周全血1 mL，室溫凝固30 min后，離心1 000×9 15 min，收集血清凍存于-70 ℃。

1.3.3.3 準備標準品：

取一8聯管，標記1～8號，把標準品用2 000×9離心10 s，再加樣品稀釋液250 μL，充分混勻并冰浴5 min，8號管中加入標準品原液60 μL，1～8號管中加入樣品稀釋液120 μL，充分混勻，1號管中加入樣品稀釋液60 μL，從8號管開始依次取管液60 μL到上一管，直到2號管，則完成梯度稀釋。

1.3.3.4 操作步驟

第一，取混合微球加入各孔45 μL，把孔內液體用抽濾器抽掉。第二，取標準品加入各孔45 μL，蓋上封板膜，室溫避光振蕩60 min，把孔內液體用抽濾器抽掉。第三，取洗滌緩沖液加入各孔100 μL，浸泡約1 min后棄液，拍干，共重復3 次。第四，取生物素標記的檢測抗體工作液加入各孔25 μL，蓋上封板膜，室溫避光振蕩30 min。第五，同第三。第六，取用鏈霉親和素標記的PE工作液加入各孔25 μL，蓋上封板膜，室溫避光振蕩20 min。第七，同第三。第八，取讀數緩沖液加入各孔150 μL，備用。第九，取洗滌緩沖液400 μL加入剩余微球中，充分混勻后倒入流式管，上流式細胞儀調整射門。第十，各孔內液體需充分吹吸，懸浮微球后轉入流式管，上流式細胞儀測定。

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 AITP組、CITP組、對照組Treg細胞百分率、TGF-β1、IL-10檢測結果比較

AITP組Treg細胞百分率明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，TGF-β1含量低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，IL-10含量低于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，CITP組Treg細胞百分率明顯低于AITP組，差異有統計學意義(P<0.01)，TGF-β1含量低于AITP組，差異有統計學意義(P<0.01)，IL-10含量低于AITP組，差異有統計學意義(P<0.05)(見表1)。

表1 三組Treg細胞百分率、TGF-β1、 IL-10檢測結果比較

2.2 Treg細胞百分率、TGF-β1、IL-10三者相關性分析

ITP患兒外周血Treg細胞百分率與TGF-β1含量呈正相關(r=0.75，P<0.01)；ITP患兒外周血IL-10含量與Treg細胞百分率、TGF-β1含量則無相關性。

3 討 論

ITP是一種以血小板抗體產生為特征的自身免疫性出血性疾病，抗體也許通過網狀內皮系統導致血小板的破壞[2]。Seddiki等[3]研究發現CD4+T細胞活化后高表達CD127，而真正的Treg則低表達CD127(CD4+CD25+CD127dim)，所以CD127可以幫助區別Treg與活化的T細胞。王會平等[4]也認為CD4+CD25+CD127low標記可以識別理想的Treg細胞，且并不影響T細胞活性。本研究采用CD4+CD25+CD127-三標記法進行檢測Treg細胞百分率，可以提高真正Treg細胞的檢出率。

CD4+CD25+Treg來源于胸腺，在調節多種疾病的免疫反應中起到重要作用，如過敏性疾病、惡性腫瘤、感染、自身免疫紊亂等方面[5]。Treg的數量和功能的異常在ITP發病中起到了一定的作用[6-7]。更有學者認為Treg數量減低打破了自身耐受，Treg將成為未來ITP治療的依據，并且可能在兒童慢性ITP的自然病程和長期結局的鑒別中成為診斷性指標[8]。研究Treg細胞在ITP患者免疫調節功能紊亂發病機制中的作用有重要意義。本研究顯示急性組CD4+CD25+CD127-Treg細胞百分率較對照組明顯減低，慢性組較急性組明顯減低，表明Treg細胞數量減少可能與ITP的發生及疾病呈現慢性發展有關，可能與ITP患者體內存在的免疫調節功能紊亂有關，慢性ITP患兒則存在更嚴重的免疫紊亂。TGF-β是一種具有多種生物學功能的蛋白質，在組織損傷修復、組織細胞增殖分化、間質形成等方面起重要作用[9]。TGF-β作為機體重要的顆粒蛋白，其在免疫調節中的重要性也逐步被認識。IL-10是公認的執行免疫抑制功能的細胞因子，可被多種細胞分泌[10]。本研究顯示ITP患兒外周血中Treg數量減少，TGF-β1、IL-10含量明顯降低，且Treg百分率與TGF-β1含量呈正相關，Treg百分率與IL-10含量無相關性。Treg被激活后通過細胞相互接觸和(或)分泌IL-10、TGF-β、IL-4等細胞因子發揮作用[11-12]。用相應抗體中和此類細胞因子則其體內免疫抑制作用降低，說明這些抑制性細胞因子可以輔助Treg細胞功能的實現。本實驗結果與Meloy等[13]的結論一致。IL-10、TGF-β在Treg細胞的產生、增殖及介導免疫耐受中發揮重要作用，主要通過其可抑制抗原遞呈細胞及拮抗效應T細胞的功能來實現[14-15]。Treg百分率與IL-10含量無相關性，可能與多種細胞均可分泌IL-10有關。

本研究表明Treg細胞數量減少或功能障礙及其相關細胞因子含量降低可能與ITP患者體內存在的免疫調節功能紊亂有關，而慢性組中免疫功能的改變表現更為明顯，這可能也是慢性患兒治療效果不佳呈現長病程的原因之一。

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ExpressionandsignificanceofregulatoryTcellsandtheirrelatedcytokinesinperipheralbloodofchildrenwithacuteandchronicprimaryimmunethrombocytopenia

GAO Fenyan1，HAO Guoping2

(1.Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China；2.The Children′s Hospital of Shanxi，Taiyuan 030012，China)

Objective：To detect the proportion of CD4+CD25+CD127-regulation T cell，transforming growth factor β1(TGF-β1)，interleukin 10(IL-10) in children peripheral blood in acute primary immune thrombocytopenia(AITP) and chronic primary immune thrombocytopenia(CITP)，and to explore their role in the pathogenesis in primary immune thrombocytopenia (ITP).Methods：The proportion of CD4+CD25+CD127-regulation T cell and the content of IL-10 were detected by flow cytometry(FCM) in peripheral blood in AITP children of 35 cases，CITP children of 31cases and healthy children of 20 cases in control group.The content of TGF-β1was analyzed by ELISA.To compare the proportion of CD4+CD25+CD127-regulation T cell and their related cytokines in the three groups and to analyze the relationships between them.Results：The proportion of CD4+CD25+CD127-regulation T cell in acute group(4.23±0.82)% was significantly lower than that in control group(5.05±0.90)%(P<0.01)，the proportion of CD4+CD25+CD127-regulation T cell in chronic group (3.47±0.63)% was significantly lower than that in acute group(4.23±0.82)%(P<0.01).The amount of TGF-β1in acute group(189.36±66.71) pg/mL was significantly lower than that in control group(231.45±113.89)pg/mL(P<0.05).The amount of IL-10 in acute group (34.07±11.57) pg/mL was significantly lower than that in control group(43.83±10.96) pg/mL(P<0.05)，the amount of TGF-β1and IL-10 in chronic group were significantly lower than that in acute group(P<0.01).There were psitive correlations between proportion of CD4+CD25+CD127-regulation T cell and TGF-β1in peripheral blood in ITP children(r=0.75，P<0.01).The content of IL-10 had no correlation with proportion of CD4+CD25+CD127-regulation T cell and TGF-β1in peripheral blood in ITP children.Conclution：The decrease of CD4+CD25+CD127-regulation T cell and related cytokines in peripheral blood in ITP may be connected with cellular immumune disorder of ITP，the immumune disorder in chronic group was obvious，and it may be one reason of why the children of CITP with poor therapeutic effects and long course.

Thrombopenia；regulation T cell；transforming growth factor β1；interleukin 10；flow cytometry

1671-8631(2017)07-0493-05

*本文通訊作者：郝國平

R725.5

：A

2016-11-11

(本文編輯：張榮梅)

高鳳艷(1991— )，女，山西省呂梁市人，在讀碩士，主要從事小兒血液科工作。