陰陽離子聚氨酯/羥基磷灰石復合微球的制備及其自組裝

賴 欣 侯 毅 李玉寶 黃 敏 任 欣 張 利

陰陽離子聚氨酯/羥基磷灰石復合微球的制備及其自組裝

賴 欣 侯 毅 李玉寶 黃 敏 任 欣 張 利＊

(四川大學納米生物材料研究中心，分析測試中心，成都 610064)

分別以2，2-雙羥基丙酸(DMPA)和N-甲基二乙醇胺(MDEA)作擴鏈劑，采用自乳化法成功制備出帶有正、負電荷的陽、陰離子聚氨酯/羥基磷灰石(PU/HA)微球，并考察HA的復合比例對微球形貌、理化性能的影響。在此基礎上，通過微球間的靜電作用力，將制備出的陰、陽離子復合微球自組裝形成凝膠體系，并對其力學性能進行探究。SEM、ζ電位和激光粒度結果顯示成功制備出具有一定形貌的帶電微球，其中當擴鏈劑含量為15%(n/n)、HA含量為10%(w/w)時，微球形貌較佳且粒度分布均勻；X射線衍射、熱分析結果表明，微球確為一定比例的HA與PU復合產物；自組裝體系的流變學測試結果表明，微球組裝后的產物呈類凝膠狀態，具有較高的彈性模量，并有一定的可注射性。同時，骨髓間充質干細胞(BMSCs)可在組裝材料表面粘附、鋪展，生長良好。

陰離子PU/HA微球；陽離子PU/HA微球；自乳化；自組裝；可注射凝膠

近年來，微創治療因其創口小、并發癥少、療效確切等優點在臨床治療上得到廣泛應用[1-2]。可注射性凝膠作為微創治療的一類重要材料，自然成為生物醫學材料領域的一大研究熱點[3-9]。這類材料具有生物相容性好、形狀可塑、理化性能可調控等優點，但其功能相對單一、穩定性相對較弱等缺陷嚴重限制了其發展。近年來，有研究者[10-19]以微/納米球材料為基本結構單元，利用微球間的靜電力、磁場力和空間位阻等作用力誘導自組裝構建微球基可注射水凝膠材料，如Wang等[10]設計制備出分別帶正/負電荷的微米級或納米級高分子微球，并利用微球間靜電作用力驅使帶相反電荷的微/納米微球，通過“自下而上”的制備方式自組裝構建出更大尺寸的穩定凝膠態材料；Cheng等[11]利用聚合物微球鏈之間的相互作用，也是通過“自下而上”的制備方式自組裝構造3D多孔支架。與其他凝膠體系相比，微球基自組裝凝膠體系表現出較高的力學強度，優良的可注射性和可塑性。此外，通過物理作用力組裝形成的微球基凝膠體系可避免化學交聯過程中有毒副作用的化學物質引入，更適于生物醫學方面的應用，有望彌補目前凝膠材料的不足。

聚氨酯(Polyurethane，PU)因其良好的生物相容性、機械性能和易加工性，在醫學材料領域有著廣泛的應用[20-23]。其分子主鏈是由玻璃化溫度低于室溫的軟段和玻璃化溫度高于室溫的硬段嵌段組成，在聚氨酯材料的制備過程中，可通過調節軟硬段的成分、比例，使其具有不同化學結構、力學性能等理化性質[24-26]，以滿足不同的應用需求。通過自乳化法制備PU荷電微球，可在制備過程中引入含陰、陽離子基團的親水鏈端，使帶有相反電荷的PU微球在靜電引力作用下實現自組裝。

羥基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)是一類化學成分和結構與生物體骨組織相似，具有良好生物活性和生物相容性的材料[27]，且無毒、無免疫原性，具有良好的骨傳導能力，因此在骨修復領域已有著廣泛的應用。但HA在單獨使用時存在脆性大、可塑性差、易團聚等缺點，為改善其使用性能，研究者們通常將HA與高分子基體復合，制備兼有HA優良生物相容性和高分子材料良好力學性能的有機/無機復合材料[28-31]。

本文分別以2，2-雙羥基丙酸(DMPA)和N-甲基二乙醇胺(MDEA)作為擴鏈劑，采用自乳化法制備陰、陽離子PU微球，在此基礎上復合一定量的HA，在改善材料生物相容相性、生物活性的同時提高材料的力學性能。通過對制備工藝條件的調節，探究擴鏈劑、HA對PU、PU/HA微球成球性、表面形態及理化性能等的影響，尋求最佳合成條件。最后在靜電力的作用下，將制得的陰、陽離子PU/HA復合微球自組裝成凝膠體系，并對其力學性能及可注射性進行分析、探究，為微球基可注射凝膠材料的研究奠定一定的理論基礎。

1 實驗部分

1.1 實驗原料

異氟爾酮二異氰酸酯 (IPDI)，聚四氫呋喃(PTMG-2000)，異辛酸亞錫，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，2，2-雙羥基丙酸 (DMPA)，N-甲基二乙醇胺(MDEA)，冰乙酸，丙酮均來自Aladdin試劑公司。三乙胺，無水乙醇，四水合硝酸鈣(Ca(NO3)2·4H2O)，十二水合磷酸三鈉(Na3PO4·12H2O)均來自成都科龍化工試劑廠。去離子水，實驗室自制。

在聚氨酯聚合反應中，異氰酸酯會與原料中含有的水分發生副反應，為避免這一情況發生，在實驗前需對部分原料進行脫水處理。PTMG-2000在120℃烘箱中干燥2 h，丙酮、TEA用3A分子篩提前一周處理。

1.2 陰、陽離子PU微球的制備

將26.67 g IPDI，24 g PTMG-2000加入到 100 mL三口燒瓶中，置于82℃的油浴鍋中，加入2滴異辛酸亞錫，低速攪拌，進行預聚反應。3 h后，降溫至52℃，將溶有物質的量分數為5%、10%、15%的DMPA/MDEA的DMF(8 mL)溶液加入到反應體系中，進行擴鏈反應。上述過程中，根據反應體系的粘度情況，加入適量的丙酮(約10～30 mL)，用以降低反應體系粘度。反應進行2 h后，分別將0.71、1.52、2.33 g三乙胺/0.42、0.90、1.38 g乙酸分散到 400 g去離子水中配制中和液，室溫高速攪拌下緩慢將聚氨酯預聚物滴入中和液中進行中和反應，剪切乳化2 h得PU微球。將得到的產物多次清洗、離心、凍干，以備后用。

1.3 載HA陰陽離子聚氨酯微球的制備

1.3.1 HA的制備

稱取114.06 g Na3PO4·12H2O溶于1 000 mL去離子水中，稱取 118.08 g Ca(NO3)2·4H2O溶解于1 000 mL去離子水中，完全溶解后，將硝酸鈣溶液置于70℃水浴條件下，通過分液漏斗，將磷酸三鈉溶液逐滴滴入硝酸鈣溶液中，并加入聚乙二醇作為分散劑，約1 h滴完，同時以1 000 r·min-1的轉速進行攪拌。滴完后繼續保持攪拌20 min，并在此期間滴加4 mol·L-1的NaOH溶液，調節其pH值至9～10。洗滌至pH值為中性，凍干后，留做備用。

1.3.2 載HA陰、陽離子PU微球的制備

將26.67 g IPDI，24 g PTMG-2000加入到100 mL三口燒瓶中，置于82℃的油浴鍋中，加入2滴異辛酸亞錫，低速攪拌，進行預聚反應。3 h后，降溫到52℃，分別將溶有物質的量分數為5%、10%、15%的DMPA/MDEA的DMF(8 mL)溶液加入到反應體系中，進行擴鏈反應，同時將一定比例的HA粉末(HA的質量分數分別為5%、10%、15%)加入預聚體中，進行充分的攪拌混合。根據反應體系的粘度情況，加入適量的丙酮(約10～30 mL)用以降低反應體系粘度。反應進行2 h后，分別將0.71、1.52、2.33 g三乙胺/0.42、0.90、1.38 g乙酸分散到400 g去離子水中配制中和液，中和液與擴鏈后的聚合物進行中和反應，劇烈攪拌2 h。將得到的產物多次清洗、離心、凍干，以備后用。

1.4 陰陽離子聚氨酯微球的自組裝

將上述制得的HA質量分數為0%、5%、10%、15%的陰、陽離子微球(擴鏈劑含量為15%(n/n))分別分散于去離子水中(固含量為0.15 g·mL-1)，數小時后將相同HA含量的陰、陽離子微球懸濁液混合使其進行自組裝。

1.5 細胞培養實驗

將4周齡的SD大鼠斷頸處死后迅速在無菌條件下取出雙側股骨和脛骨。用10 mL無菌注射器吸取α-MEM培養基沖出骨髓，所獲細胞用5 mLα-MEM培養基(含雙抗)制成細胞懸液。將細胞懸液直接種入玻璃培養瓶內，并于37℃、5%(V/V)CO2的培養箱內培養，24 h半換液，48 h全換液。待貼壁細胞融合到90%時，按1∶3比例傳代。取第3代骨髓間充質干細胞(BMSCs)用于與材料復合培養實驗。

將純PU、PU/HA(HA質量分數10%)組裝材料在無菌條件下分別置于24孔板中，將上述傳代培養的BMSCs按2×104/孔的濃度滴加在孔板中，每孔滴加1 mL，待細胞自然沉降在材料表面后，又于37℃的5%CO2細胞培養箱中培養，12、48 h取樣。樣品取出后用PBS沖洗,去除未貼壁細胞，經3%戊二醛固定2 h，50%～100%乙醇梯度脫水，臨界點干燥，干燥鍍金后用掃描電鏡觀察。

1.6 表征方法

本文采用掃描電子顯微鏡 (JSM-6510LV，日本JEOL公司)觀察微球形貌尺寸和分散性，以及細胞與組裝材料共培養后的生長形貌；樣品平均粒徑采用激光粒度儀(2000E,丹東百特儀器有限公司)進行測試分析；樣品的表面電荷通過ζ電位測試儀(ZS90型，英國馬爾文儀器有限公司)測試；用X射線衍射儀(DX-2500，丹東通達科技有限公司)表征樣品的物相成分，Cu Kα，λ=0.154 06 nm，U=40 kV，I=25 mA，2θ= 5°～80°；用熱分析儀(STA 499，德國耐馳公司)對樣品的熱穩定性進行分析，升溫范圍為25～500℃，升溫速率10℃·min-1；使用流變儀(DHR-2，美國TA公司)對組裝體材料的力學性能及可注射性進行測評。

2 結果與討論

2.1 PU微球和PU/HA復合微球的SEM照片

采用SEM對不同擴鏈劑含量的陰、陽離子PU微球形貌進行觀察，如圖1所示。從圖1a和圖1d可以看出，當擴鏈劑含量為5%(n/n)時，制備產物粘連在一起，無明顯形狀。當擴鏈劑含量為10%(n/n) (圖1b和圖1e)時，制備產物大多呈球狀，但微球粒徑分布相對不均，且微球表面粗糙。隨著擴鏈劑含量的不斷增加，當擴鏈劑含量為15%(n/n)(圖1c和圖1f)時，制備產物球形度相對較好，粒徑分布均勻，且表面光滑。這可能是由于隨著擴鏈劑含量增加，親水基團增多，使得擴鏈后的產物親水性增強，易于在水溶液中乳化成球；水分子進入聚氨酯分子鏈間的速度加快，乳化形成微球的過程所需時間減少，因此每個微球形成的時間間隔就越小，微球也就越均勻[32]。

圖1 不同擴鏈劑含量的陰、陽離子PU微球的SEM圖Fig.1 SEM images of anionic(a～c)and cationic(d～f)PU microspheres with different chain extenders contents(n/n)of(a,d)5%,(b,e)10%,(c,f)15%

基于上述實驗，優化擴鏈劑含量為15%(n/n)的微球制備工藝參數，制得PU/HA復合微球。SEM照片可以看出，當HA質量分數為5%(圖2a，圖2d)時，微球表面相對粗糙，有少量HA附著于微球表面；同時，由于大部分HA與PU混合，占據了微球內部一定空間，使得微球粒徑相對增大。隨著HA含量增加，微球表面有更多HA顆粒暴露(圖2b，圖2e)，可顯著提高材料的生物活性；而當HA質量分數達15%時，如圖2c、2f所示，產物球形度相對較差，出現粘連現象，可能是隨著HA含量不斷增加，大量HA粉末團聚，未能與PU預聚體均勻混合，影響了聚合物的乳化，進而影響了產物形態。

圖2 不同HA含量陰、陽離子PU/HA微球的SEM圖Fig.2 SEM images ofanionic(a～c)and cationic(d～f) PU/HA microspheres(15%(n/n)chain extenders contents)with HA contents(w/w)of(a,d)5%; (b,e)10%;(c,f)15%

2.2 平均粒徑及ζ電位測試

HA含量不同的陰、陽離子PU/HA微球的激光粒度測試、ζ電位測試結果如表1、2所示。

表1 不同HA含量的陰、陽離子PU/HA微球平均粒徑

Table 1 Average particle size of oppositely charged PU/HA microspheres

Mass fractin of HA/%(w/w) Average particle size/μm Anionic PU microspheres Cationic PU microspheres 0 10.72±0.90 10.76±0.88 5 12.17±0.54 12.69±0.72 10 16.80±0.24 16.37±1.15 15 11.69±0.57 12.87±0.70

表2 不同HA含量的陰、陽離子PU/HA微球的ζ電位Table 2 ζpotential of oppositely charged PU/HA microspheres

由表1可以看出，隨著HA含量增加(0%～10% (w/w))，復合微球粒徑逐漸增大，大部分HA粉末包裹于微球內部，僅少量附著于微球表面。而當HA的含量增加到15%(w/w)時，微球粒徑減小，這是由于反應中過多的HA粉末未能很好地分散在反應體系中，易于發生團聚，且影響了整個體系的粘度，影響了乳化過程中微球的形成。該測試結果也驗證了上述SEM觀察的結果。

由表2看出，隨著HA含量增加，陰離子微球的ζ電位絕對值逐漸減小，而陽離子微球的ζ電位絕對值逐漸增大，這是由于附著在微球表面的HA本身帶有一定的正電，進一步影響了陰、陽離子PU微球的帶電情況。當HA質量分數增加到15%時，由于大量HA暴露，附著于微球的外部，所以導致樣品帶電量變化較大。

2.3 XRD衍射分析

不同HA含量陰、陽離子PU/HA微球的XRD圖如圖3A、B所示。其中，a、b、c分別表示HA質量分數為5%，10%，15%的PU/HA復合微球。

圖中2θ為20°處的強衍射峰是聚氨酯的結晶衍射峰。從圖中a、b、c可以看出，2θ為26°和34°處出現了HA晶體(002)和(211)晶面的特征衍射峰，在40°、47°和50°處還可以觀察到HA的其他特征衍射峰，與標準卡片JCPDS 09-0432相吻合。隨著HA含量增加，衍射峰逐漸增強，說明HA和聚氨酯微球是物理結合。

圖3 不同HA含量的陰離子(A)、陽離子(B)PU/HA微球的XRD圖Fig.3 XRD patterns of anionic(A)and cationic(B)PU/HA microspheres with HA contents(w/w)of(a)5%,(b)10%,(c)15%

2.4 熱重分析

從圖4中可以看出，PU/HA微球的分解主要分為兩個階段，分別對應著聚氨酯中硬段和軟段的分解。在25～250℃范圍內，分解速度較為緩慢，主要是聚氨酯分子鏈中的氨基甲酸酯分解為異氰酸酯和多元醇，進而分解成二氧化碳等物質；當溫度升至250℃后，多元醇開始分解，釋放出小分子的物質。460℃以后PU完全分解，由于HA的分解溫度為1 330℃，因此550℃時剩下還未分解的HA。如圖4A、B中曲線a、b、c所示，反應結束后剩余物質的質量分數分別為5.95%、11.55%、16.34%(圖4A)，以及5.10%、11.27%、14.81%(圖4B)，與實驗設計的5%、10%、15%有較小偏差，可能是由實驗過程中少量雜質引入或其他操作誤差引起。

圖4 不同HA含量的陰離子(A)、陽離子(B)PU/HA微球的TG曲線Fig.4 TG curves ofanionic(A)and cationic(B)PU/HA microspheres with HA contents(w/w)of(a)5%,(b)10%,(c)15%

2.5 自組裝凝膠體系的流變學性質分析

將相同HA含量，固含量為0.15 g·mL-1的陰、陽離子PU/HA微球分別組裝在一起，自組裝產物的擠出狀態照片如圖5所示。

從圖中可以看出，HA質量分數為0%，5%，10%的3組材料基本組裝成型，且擠出物具有一定的形狀和粘彈性，這是由于組成組裝體的陰、陽離子PU/ HA微球的電位絕對值相對較高，且電量絕對值相差較小，因此帶電微球在較強的靜電力作用下組裝良好。而HA質量分數為15%的陰、陽離子PU/HA微球組裝體難以成形，呈現流體狀態，這可能由于PU聚合體的包覆能力有限，且較大含量的HA易于團聚，因此HA未能與PU均勻混合，難以成球，進而影響了微球表面的帶電情況，使得陰、陽離子微球的電位絕對值相差較大，難以匹配。

如圖6所示，將HA質量分數為10%、固含量為0.15 g·mL-1的陰、陽離子PU/HA微球溶液和帶相反電荷微球的混合物加入離心管倒置1 min后，陰、陽離子微球溶液仍具有很強的流動性，而對應相同固體含量的帶相反電荷PU/HA微球混合物組裝沉積滯留于原位，說明其形成了穩定的凝膠。為觀察凝膠的微觀形貌，對其進行掃描電鏡觀察，如圖7所示，從圖中可看出微球之間相互堆積連接，形成三維多孔結構，進一步證實凝膠是通過微球間的靜電作用力自組裝形成。

圖5 載不同HA含量的陰陽離子PU/HA微球自組裝產物擠出狀態Fig.5 Extrusion state of gel system self-assembled by oppositely charged PU/HA microspheres with HA contents(w/w)of(a)0%,(b)5%,(c)10%, (d)15%

圖6 HA質量分數為10%、固含量為0.15 g·mL-1的陰、陽離子PU/HA微球溶液和帶相反電荷微球混合物的樣品靜置(A)和倒置(B)后的照片Fig.6 Photographs of anionic and cationic PU/HA microspheres(10%(w/w)HA content,15% solid content)and mixtures ofoppositely charged microspheres before(A)and after(B) an inverted-vialtest

圖7 HA質量分數為10%、固含量為0.15 g·mL-1的陰、陽離子PU/HA微球自組裝形成凝膠的SEM圖像Fig.7 SEM images of gel system self-assembled byoppositely charged PU/HA microspheres(10% (w/w)HA content,0.15 g·mL-1solid content)

圖8 不同HA含量的陰、陽離子PU/HA微球自組裝產物的彈性模量Fig.8 Elastic modulus of gel system self-assembled by oppositely charged PU/HA microspheres with HA contents(w/w)of(a)0%,(b)5%,(c)10%,(d) 15%

使用流變儀對組裝材料的彈性模量、粘彈性、剪切降粘性質進行測試，結果如圖8、9、10所示。由圖8可看出，當HA質量分數為0%、5%和10%時，組裝材料的彈性模量逐漸增大，當HA質量分數達到15%時，其彈性模量顯著降低。說明加了適量HA (5%或10%(w/w))的組裝體材料表現出較好的粘彈性，這是由于加入的HA起到了增強作用，復合材料的彈性相應增強；當加入更多HA(15%(w/w))時，會導致成球效果差，在自組裝過程中，因微球成形相對較差、大量HA散落且表面所帶電荷絕對值相差較大，陰陽離子微球難以組裝成形，材料表現出明顯的流動性，但卻犧牲了較多的彈性模量。從圖9中可以發現4組自組裝產物的tanδ值均小于1，暗示在HA質量分數為0～15%范圍內，陰、陽離子PU/HA微球自組裝產物表現出彈性模量大于粘性模量。

圖9 不同HA含量的陰陽離子PU/HA微球自組裝產物的粘彈性Fig.9 Viscoelasticity of gel system self-assembled by oppositely charged PU/HA microspheres with HA contents(w/w)of(a)0%,(b)5%,(c)10%, (d)15%

圖10 不同HA含量的陰陽離子微球自組裝產物的剪切降粘行為Fig.10 Shear bonding behavior of gel system selfassembled by oppositely charged PU/HA microspheres with HA contents(w/w)of (a)0%,(b)5%,(c)10%,(d)15%

圖10 是HA質量分數為0～15%的陰陽離子微球基凝膠粘度隨剪切速率變化的關系。HA質量分數為0～10%的微球基凝膠在低的剪切速率下具有高粘度，且試驗中組裝產物都表現出剪切變稀行為(Shear-thinning behavior)[33]，即樣品的粘度隨著剪切速率的增加而減弱，這是因為在高剪切速率下，原本與周圍顆粒形成能量壁壘的納米微球在不斷加速的剪切力下發生位移，使得物理交聯的網絡無法瞬間重建，因而造成了材料表現出低粘度，這與Wang等報道的PLGA納米微球體系表現出相似的特性[34]。

2.6 細胞相容性

將骨髓間充質干細胞(BMSCs)與陰、陽離子純PU(擴鏈劑物質的量分數15%)、PU/HA微球(擴鏈劑物質的量分數15%，HA質量分數10%)組裝材料共培養12 h、48 h后，通過掃描電鏡(SEM)觀察細胞生長狀況，如圖11所示。與材料共培養12 h后，材料表面均附著有細胞，純PU微球組裝材料表面粘附的細胞呈梭形，PU/HA組裝材料表面細胞呈多邊形伸展粘附在材料表面，且有偽足伸出；48 h后，兩組材料表面均附著有更多的細胞，與純PU組裝材料相比，PU/HA組裝材料表面的細胞鋪展狀態更好，組裝材料上細胞間偽足相連，形成單細胞層。這說明PU/HA組裝材料具有更好的細胞相容性，有利于成骨細胞的增殖，有望在骨缺損治療領域得以應用。

圖11 骨髓間充干細胞(BMSCs)與純PU(a,b)或PU/ HA(c,d)組裝材料共培養 (a,c)12 h、(b,d)48 h后的SEM圖像Fig.11 SEM images of BMSCs co-cultured with PU(a,b) or PU/HA(c,d)self-assembled material for(a,c) 12 h and(b,d)48 h

3 結 論

本實驗采用自乳化法成功制備出陰、陽離子PU/HA復合微球，在靜電力作用下進行自組裝，并對組裝體材料的理化性能進行探究。研究結果表明，當擴鏈劑物質的量分數為15%，HA質量分數為10%時微球成球性好，粒度分布均勻，具有良好的分散性，組裝材料的彈性模量增強，且具有良好的粘彈性。剪切降粘行為表明，在高剪切速率下樣品粘度降低，即樣品具有一定的可注射性。該自組裝凝膠體系具有優良的細胞相容性，為凝膠材料的研究奠定了一定的理論基礎，未來有望在骨缺損微創治療領域得到應用。

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Preparation and Self-Assembly of Oppositely Charged Polyurethane/Hydroxypatite Microspheres

LAI Xin HOU Yi LI Yu-Bao HUANG Min REN Xin ZHANG Li＊
(Analytical&Testing Center,Research Center for Nano-biomaterials,Sichuan University,Chengdu 610064,China)

Oppositely charged polyurethane/hydroxyapatite (PU/HA)microspheres were successfully prepared by using the self-emulsifying method,in which 2,2-Bis(hydroxymethyl)propionic acid(DMPA)and N-Methyldiethanolamine (MDEA)was used as chain extender,respectively.The self-assembled gel system was formed by electrostatic force between oppositely charged microspheres.The physicochemical properties of these microspheres were characterized and analyzed by means of SEM,Laser particle size analyzer,ζpotentiometer, XRD and TG,and the rheological properties of the self-assembled system was also studied by rheological test. The results confirm that oppositely charged microspheres are successfully prepared and the best morphology is obtained when the chain extender is 15%(n/n)and HA is 10%(w/w);XRD and TG results show thatthe inorganic phase of HA is successfully incorporated into PU microspheres.The rheological test demonstrate that the selfassembly gel system have higher elastic modulus and injectability.In addtion,the bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)can adhere,spread and grow well on the surface ofthe material.

anionic PU/HA microspheres;cationic PU/HA microspheres;self-emulsifying;self-assembly;injectable gel

TB33

A

1001-4861(2017)080-1403-08

10.11862/CJIC.2017.164

2017-02-28。收修改稿日期：2017-06-02。

國家自然科學基金(No.51673131，31370971)資助項目。

＊通信聯系人。E-mail：zhangli9111@126.com