喀斯特土壤固氮微生物群落與植被、土壤的關(guān)系

劉 璐,何尋陽(yáng),杜 虎,王克林,*

1 中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長(zhǎng)沙 410125 2 湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心,長(zhǎng)沙 410125

?

喀斯特土壤固氮微生物群落與植被、土壤的關(guān)系

劉 璐1,2,何尋陽(yáng)1,杜 虎1,王克林1,*

1 中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長(zhǎng)沙 410125 2 湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心,長(zhǎng)沙 410125

固氮微生物作為土壤中重要的功能微生物群之一,其與地上植物群落、土壤環(huán)境之間的關(guān)系尚不清楚。在桂西北的環(huán)江縣、都安縣和大化縣選取喀斯特典型植被類型(草叢、灌叢、次生林)建立樣方,通過(guò)植被調(diào)查、測(cè)定土壤理化性質(zhì)和構(gòu)建克隆文庫(kù)的方法,研究了土壤固氮微生物群落的結(jié)構(gòu)與組成,分析了固氮微生物群落與植物群落、土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系。結(jié)果表明：研究區(qū)典型植被類型土壤中的優(yōu)勢(shì)固氮微生物為慢生根瘤菌。Mantel相關(guān)性分析表明植物群落與固氮微生物群落顯著相關(guān)(r=0.6116,P=0.011)；結(jié)合PCoA分析和Venn圖可看出,植物群落組成與結(jié)構(gòu)越相似,土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)與組成也越相似。CCA分析前兩軸的解釋率之和僅為22.72%,其中總氮、有效態(tài)鉀、有效態(tài)鈣對(duì)固氮微生物群落的影響顯著,這表明本研究涵蓋的土壤理化性質(zhì)指標(biāo)并不能完全解釋固氮微生物群落的變異,需要補(bǔ)充更多的土壤數(shù)據(jù)進(jìn)行更深入的研究。由此可見(jiàn),在喀斯特生態(tài)恢復(fù)過(guò)程中,不僅要關(guān)注地上植被群落的恢復(fù)與重建,同時(shí)也應(yīng)重視地下功能微生物群落的恢復(fù)與重建。

固氮微生物群落；nifH基因；植被恢復(fù)；喀斯特

固氮微生物是生態(tài)系統(tǒng)中一類重要的功能菌群,它在土壤氮素循環(huán)中發(fā)揮著不可取代的作用,其群落結(jié)構(gòu)組成對(duì)土壤氮素固定及維持氮素循環(huán)平衡具有重要意義[1- 2]。固氮微生物中均含有編碼鐵蛋白的nifH基因,基于該基因的分子生物學(xué)分析為固氮微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的探索提供了一個(gè)較傳統(tǒng)培養(yǎng)更為靈敏和準(zhǔn)確的分析方法[3- 4]。大量研究表明,固氮微生物群落的結(jié)構(gòu)與組成受土地利用方式、施肥制度、土壤理化性質(zhì)(如pH、SOC、TN)等因素的影響,如長(zhǎng)期施加氮肥會(huì)使土壤固氮微生物的競(jìng)爭(zhēng)力下降,進(jìn)而改變其多樣性、群落結(jié)構(gòu)與組成[5- 7]。越來(lái)越多的研究表明,地上植物群落與土壤微生物群落存在著不可分割的相互聯(lián)系,地上植物群落通過(guò)凋落物和根系分泌物影響土壤微生物的種類和豐度,而土壤微生物通過(guò)改變土壤環(huán)境、影響?zhàn)B分礦化過(guò)程等方式影響地上植物群落的多樣性、群落結(jié)構(gòu)及生產(chǎn)力[8-10]。然而,目前對(duì)固氮微生物群落與地上植物群落相互聯(lián)系的研究相對(duì)較少,它們之間是否存在緊密的相關(guān)性尚不清楚。

西南喀斯特地區(qū)是我國(guó)生態(tài)環(huán)境最脆弱的地區(qū)之一,強(qiáng)烈的人為干擾(如火燒、放牧、樵采等)導(dǎo)致原有植被大面積破壞,水土流失加劇,石漠化嚴(yán)重,生態(tài)恢復(fù)與重建迫在眉睫[11-12]。前期研究表明,氮素是喀斯特植被恢復(fù)的重要限制性因素之一,生物固氮作為自然生態(tài)系統(tǒng)氮素輸入的主要來(lái)源,是解決退化生態(tài)系統(tǒng)氮素限制的最好方式[13- 15]。長(zhǎng)期以來(lái),研究者多從地上植物的角度(自然封育和人工造林)提出喀斯特退化生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)措施,對(duì)喀斯特生態(tài)恢復(fù)過(guò)程中植被與土壤環(huán)境的耦合關(guān)系已有較深入的認(rèn)識(shí)[16- 17]。目前,對(duì)喀斯特生態(tài)系統(tǒng)的地下生物過(guò)程,尤其是對(duì)土壤功能微生物(如固氮微生物、叢枝真菌)的研究相對(duì)較少,缺乏對(duì)植被恢復(fù)過(guò)程中固氮微生物群落的變化及與地上植物群落、土壤環(huán)境之間關(guān)系的認(rèn)識(shí)。

本文以桂西北3個(gè)縣(都安、大化、環(huán)江)為研究區(qū)域,選取喀斯特典型植被類型(草叢、灌叢、次生林),建立動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)樣地,進(jìn)行植被調(diào)查,采集土壤樣品,運(yùn)用PCR-克隆-測(cè)序技術(shù),明確了喀斯特典型植被類型的固氮微生物群落組成特征,探討了固氮微生物群落與地上植物群落之間的相互關(guān)系,揭示了土壤環(huán)境對(duì)固氮微生物群落的影響,以期能為喀斯特地區(qū)生物固氮潛力的開(kāi)發(fā)及生態(tài)恢復(fù)與重建提供參考數(shù)據(jù)和科學(xué)指導(dǎo)。

1 研究區(qū)域與研究方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于桂西北河池市(23°41′—25°37′ N, 106°34′—109°09′ E),具有典型喀斯特地貌,土壤量少且分布零散,巖石裸露率較高。2011年8月,選取研究區(qū)內(nèi)的典型生態(tài)系統(tǒng)(草叢、灌叢、次生林),分別在環(huán)江縣大才鄉(xiāng)、都安縣三只羊鄉(xiāng)、大化縣七百弄鄉(xiāng)建立樣方(每個(gè)地點(diǎn)同植被類型樣方各3個(gè)重復(fù)),各樣方的面積為20 m × 30 m,坡位、坡向和地質(zhì)背景基本一致。

大才鄉(xiāng)概況 位于環(huán)江毛南族自治縣東南部,24°44′N,108°19′E附近。該區(qū)屬亞熱帶季風(fēng)氣候,年平均氣溫16.5—20.5℃,年平均降水量1389.1 mm,降水分布不均,雨季4—9月降水占年總降水量的70%。該區(qū)為典型的喀斯特峰叢洼地,土壤量少且分布零散。

三只羊鄉(xiāng)概況 位于都安瑤族自治縣北部,24°26′N,108°02′E附近。該區(qū)屬亞熱帶季風(fēng)氣候,多年平均氣溫19.6℃,年平均降水量1492.2 mm,年平均蒸發(fā)量1644.9 mm,相對(duì)濕度74%,>10℃年積溫平均值7289.5℃,年日照平均值1395.5 h。逐月降水分布不均,雨季5—8月降水占年總降水量的67.8%,春旱、秋旱較頻繁。地貌類型以典型的高峰叢洼地為主,土壤量少且分布零散,境內(nèi)原生植被極少,森林覆蓋率不足10%。

圖1 研究區(qū)域分布情況Fig.1 The location of study area

七百弄鄉(xiāng)概況 地處大化瑤族自治縣西北部,24°08′N,107°40′E附近。該鄉(xiāng)屬亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū),年均氣溫17.4—19.6℃,年降雨量1500—1600 mm,雨水多集中于夏季。該區(qū)屬最典型的峰叢洼地巖溶類型,大面積巖石裸露,石漠化嚴(yán)重,植被稀少,以灌木叢為主,森林覆蓋率在5%以下。研究區(qū)域見(jiàn)圖1。

1.2 野外調(diào)查與樣品采集

植被調(diào)查：每塊樣方分成6個(gè)10 m× 10 m的小樣方調(diào)查植被組成。對(duì)于草叢樣方,在每個(gè)小樣方中選取1個(gè)2 m× 2 m的樣方進(jìn)行調(diào)查；對(duì)于灌叢樣方,在每個(gè)小樣方中選取1個(gè)4 m× 4 m的樣方進(jìn)行調(diào)查；對(duì)于次生林樣方,則調(diào)查全部面積。分3層調(diào)查植被多樣性：對(duì)于喬木層,記錄物種名、胸徑、數(shù)量；對(duì)于灌木層,記錄物種名、基徑、數(shù)量；對(duì)于草本層,記錄物種名、數(shù)量。目測(cè)各物種的蓋度和高度。

土壤采集：在每個(gè)樣方內(nèi),沿“S”型采集0—20 cm表層土壤15個(gè)點(diǎn),混合成一個(gè)樣品。在滅菌牛皮紙上除去大石塊和動(dòng)植物殘?bào)w,并混合均勻后,用四分法分取100 g左右的土,用錫箔紙包好后放入滅菌布袋中,立刻投入液氮罐中速凍,帶回實(shí)驗(yàn)室經(jīng)冷凍干燥、磨細(xì)分裝后放入-70℃冰箱保存,用于提取微生物DNA；剩下的土壤風(fēng)干,磨碎過(guò)篩后裝入自封袋中,用于土壤理化性質(zhì)的測(cè)定。

1.3 樣品測(cè)定與分析

1.3.1 土壤固氮微生物分析

土壤樣品中微生物DNA提取方法參照Porteous等的SDS-GITC-PEG方法[18]。采用PolF(5′-TGCGAYCCSAARGCBGACTC- 3′)和PolR(5′- ATSGCCATCATYTCRCCGGA- 3′)擴(kuò)增土壤微生物總DNA中的nifH基因片段[3]。每個(gè)樣品重復(fù)擴(kuò)增3次,將3次的擴(kuò)增產(chǎn)物混合均勻以消除單次擴(kuò)增的偏向性。20 μL PCR反應(yīng)體系為：2 × EasyTaq PCR Super Mix 10 μL,引物各1 μL(2.5 μmol/L),DNA模板約40 ng,補(bǔ)充ddH2O 至20 μL。擴(kuò)增條件為：94℃ 3 min；94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。

采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根,中國(guó))進(jìn)行凝膠回收純化。將回收獲得的nifH基因片段連接到pMD19-T載體上(寶生物,大連),轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α高感受態(tài)細(xì)胞,將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布到含有氨芐青霉素/IPTG/X-Gal的LB培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)16—24 h,每個(gè)樣品挑取200個(gè)白色克隆子,采用菌落PCR的方法,用引物PolF/PolR擴(kuò)增外源插入片段,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)篩選陽(yáng)性克隆,構(gòu)建基因克隆文庫(kù)。

1.3.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤pH的測(cè)定采用電位法(水土比2.5∶1)；土壤全碳、全氮的測(cè)定采用碳氮元素分析儀(Elementar,Germany)；土壤有效態(tài)P、K、Fe、Ca、Mg采用Orr等的Mehlich 3法浸提,浸提液過(guò)濾后直接上機(jī)(ICP-MS,GBC)測(cè)定[5]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

(1)重要值計(jì)算

草本層重要值：IV=(相對(duì)多度+相對(duì)頻度+相對(duì)蓋度)/3

灌木層重要值：IV=(相對(duì)多度+相對(duì)頻度+相對(duì)顯著度)/3

喬木層重要值：IV=(相對(duì)多度+相對(duì)頻度+相對(duì)顯著度)/3

相對(duì)顯著度=(樣方中該種個(gè)體胸面積和/樣方中全部個(gè)體胸面積總和)×100%。

相對(duì)多度=(樣方中該種的個(gè)體數(shù)/所有種的總個(gè)數(shù))×100%。

相對(duì)頻度=(樣方中該種的頻度/所有種的頻度總和)×100%。

相對(duì)蓋度=(樣方中該種的分蓋度/樣方中全部個(gè)體蓋度之和)×100%。

(2)克隆文庫(kù)序列分析

測(cè)得的序列首先去除載體和嵌合體序列,將最后所得序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中已知種類的序列進(jìn)行比對(duì),以確定各序列的種屬信息。按93%序列相似性劃分OTU,用Mothur軟件(http://www.mothur.org/)生成OTUs的分類,進(jìn)行聚類分析和繪制Venn圖。采用覆蓋度(C)來(lái)表征克隆文庫(kù)的代表性,計(jì)算公式為C=1-n/N,n為克隆文庫(kù)中僅出現(xiàn)過(guò)一次的OTUs數(shù),N為克隆文庫(kù)總克隆子數(shù)目。

描述性統(tǒng)計(jì)和方差分析在Excel 2010和SPSS 18.0軟件中進(jìn)行。采用Canoco 5軟件中的主坐標(biāo)分析法來(lái)分析植物群落結(jié)構(gòu)與組成的差異；采用CCA分析土壤理化因子對(duì)固氮微生物群落的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 典型植被類型的植物群落組成及差異

圖2 植物群落結(jié)構(gòu)與組成的PCoA分析 Fig.2 PcoA analysis of plant community composition and structure 形狀代表植被類型。圓形：草叢；菱形：灌叢；正方形：次生林;顏色代表區(qū)域。橙色：環(huán)江地區(qū)；綠色：都安地區(qū)；紫色：大化地區(qū)

各樣方的植物群落優(yōu)勢(shì)種名錄見(jiàn)表1。環(huán)江地區(qū),草本層以五節(jié)芒(Miscanthusfloridulus)、翠云草(Selaginellauncinata)等為優(yōu)勢(shì)種；灌木層以檵木(Loropetalumchinense)、豹皮樟(Litseacoreana)、四籽海桐(Pittosporumtonkinense)等為優(yōu)勢(shì)種；喬木層以青岡櫟(Cyclobalanopsisglauca)、檵木等為優(yōu)勢(shì)種。都安地區(qū),草本層以類蘆(Neyraudiareynaudiana)、石山棕(Guihaiaargyrata)等為優(yōu)勢(shì)種；灌木層以紅背山麻桿(Alchorneatrewioides)、灰毛漿果楝(Cipadessabaccifera)等為優(yōu)勢(shì)種；喬木層以瓊楠(Beilschmiediaintermedia)、假玉桂(Celtistimorensis)等為優(yōu)勢(shì)種。大化地區(qū),草本層以五節(jié)芒、腎蕨(Nephrolepiscordifolia)等為優(yōu)勢(shì)種；灌木層以廣西密花樹(shù)(Myrsinekwangsiensis)、紅背山麻桿等為優(yōu)勢(shì)種,喬木層以化香(Platycaryastrobilacea)為優(yōu)勢(shì)種。不同植被類型的植物群落組成存在較明顯的差異(圖2)。其中,都安、大化地區(qū)同類型植被的群落結(jié)構(gòu)較為相似,聚集在一起,而環(huán)江地區(qū)植被與都安、大化地區(qū)植被存在明顯的差異。

表1 各樣方的優(yōu)勢(shì)群落組成

括號(hào)中為該物種在各樣方中的重要值; GL: grassland; SL: scrubland; SF: secondary forest. H: herbaceous; S: shrub; A: arborous;扭肚藤(Jasminumelongatum),天仙果(Ficuserecta),粗絲木(Gomphandratetrandra),紫葉秋海棠(Begoniapurpureofolia),粗毛懸鉤子(Rubusalceifolius),毛蕨(Cyclosorusinterruptus),烏斂莓(Cayratiajaponica),子凌蒲桃(Syzygiumchampionii),綢緞藤(Bauhiniahypochrysa),箬竹(Indocalamustessellatus),剛莠竹(Microstegiumciliatum),蘭香草(Caryopterisincana),一葉萩(Flueggeasuffruticosa),棕竹(Rhapisexcelsa),陰香(Cinnamomumburmannii)

2.2 典型植被類型土壤的基本理化性質(zhì)

研究區(qū)域土壤接近于中性土,pH介于6.4—7.8之間。隨著植被從草叢向次生林的演變,土壤養(yǎng)分狀況也隨之發(fā)生了明顯的改變,其中土壤總N明顯增加(表2)。方差分析結(jié)果表明,土壤總C、總N、有效態(tài)Fe、Mg、Ca均受植被類型和地理區(qū)域的共同影響,且植被與地理區(qū)域存在交互效應(yīng)(表3)。其中,土壤有效態(tài)K主要受植被類型的影響(F=7.71,P=0.004),地理區(qū)域?qū)ζ錈o(wú)顯著影響(F=0.05,P=0.95)；而土壤pH、有效態(tài)P主要受地理區(qū)域的影響(F=4.08,P=0.035；F=4.51,P=0.026),但植被類型對(duì)其無(wú)顯著影響(F=2.29,P=0.13；F=0.87,P=0.435)。

表2 各樣方的土壤理化性質(zhì)

表3 植被類型和地點(diǎn)對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

2.3 典型植被類型的固氮微生物群落差異

由于各克隆文庫(kù)的克隆子數(shù)目相差較大,因此從每個(gè)克隆文庫(kù)中隨機(jī)挑取70個(gè)克隆子(3個(gè)重復(fù)),保證3個(gè)區(qū)域克隆文庫(kù)的克隆子數(shù)量基本相同(約200個(gè))。每個(gè)克隆文庫(kù)的覆蓋度均超過(guò)60%,表明克隆文庫(kù)能夠基本代表該區(qū)域的土壤固氮微生物群落的多樣性。在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)土壤中的優(yōu)勢(shì)固氮微生物為慢生根瘤菌。

按照93%序列相似性劃分OTU,根據(jù)Bray-curtis指數(shù)計(jì)算距離,得到相似性矩陣,進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)差異分析。由Venn圖可見(jiàn)(圖3),3個(gè)地區(qū)共有的OTUs數(shù)目?jī)H為9個(gè),其中都安、大化地區(qū)共有的OTUs數(shù)目為39,而都安和環(huán)江、大化和環(huán)江之間共有的OTUs數(shù)目分別為19、21個(gè),表明都安、大化地區(qū)的土壤固氮微生物群落組成更相似,由此可見(jiàn),植物群落結(jié)構(gòu)更相似,土壤固氮微生物群落也更相似。Mantel相關(guān)性分析進(jìn)一步表明植物群落與固氮微生物群落顯著相關(guān)(r=0.6116,P=0.011)。同樣地,不同植被類型下土壤固氮微生物群落也發(fā)生了明顯的變化,其中草叢與灌叢、灌叢與次生林、草叢與次生林共有的OTUs數(shù)目分別為30、31、19個(gè),這表明：隨著植被的正向演替,土壤固氮微生物群落的改變有個(gè)漸變的過(guò)程。

圖3 固氮微生物的群落差異分析Fig.3 The variance analysis of nitrogen-fixing microbial communityDA：都安縣；DH：大化縣；HJ：環(huán)江縣;GL：草叢；SL：灌叢；SF：次生林

圖4 固氮微生物群落與土壤理化性質(zhì)的CCA分析 Fig.4 CCA analysis of diazotroph communities and soil properties 帶箭頭的實(shí)線表示土壤理化因子(解釋變量),三角形代表固氮微生物群落

由圖4可見(jiàn),CCA分析前兩軸的解釋率之和僅為22.72%,這表明本研究涵蓋的土壤理化性質(zhì)指標(biāo)并不能很好的解釋固氮微生物群落的變異。但總氮、有效態(tài)鉀、有效態(tài)鈣對(duì)固氮微生物群落影響顯著(P<0.05)。總體來(lái)說(shuō),土壤固氮微生物群落受植物群落與土壤條件的共同影響。

3 討論

本文采用克隆文庫(kù)的方法,研究了區(qū)域尺度上不同植被類型下土壤固氮微生物群落差異。nifH基因是研究固氮微生物的marker基因,它的系統(tǒng)發(fā)育分析與16S rDNA基因高度一致,因此常用于進(jìn)行固氮微生物多樣性的研究[19- 22]。對(duì)于16S rDNA基因,一般將序列相似性>97%歸為一個(gè)OTU(種),而對(duì)于功能基因如何劃分種無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。已有的研究表明,16S rDNA基因的序列相似性>97%,其nifH基因序列相似性可能低于95%,甚至低至85%,利用nifH基因序列只能估算物種多樣性,并不能真實(shí)反映樣品中固氮微生物的遺傳多樣性[4]。不同的研究者往往采用不同的序列相似性(93%—97%)來(lái)劃分OTU,本文參照Hsu等人的研究,按93%的序列相似性來(lái)劃分OTU并進(jìn)行后續(xù)的分析[21]。

以往的研究,多關(guān)注固氮微生物群落對(duì)施肥制度、土地利用方式和植被變化的響應(yīng),對(duì)群落尺度上固氮微生物群落與植物群落相關(guān)性的研究較少[23-24]。 Tai等[19]研究表明小葉金露梅灌木群落和黑褐苔草牧草地的固氮微生物群落存在顯著差異,由此可見(jiàn)固氮微生物群落與地上植物群落密切相關(guān)。本研究從群落尺度水平上,采用Venn圖和Mantel相關(guān)性分析研究了固氮微生物群落與地上植物群落的關(guān)系。結(jié)果表明,兩者之間顯著相關(guān),植物群落結(jié)構(gòu)越相似,固氮微生物群落也越相似。研究區(qū)域內(nèi)的頂級(jí)植被群落屬于中亞熱帶石灰?guī)r區(qū)常綠落葉闊葉混交林,草叢、灌叢和次生林都是由于干擾程度不同退化而成[12]。都安、大化地區(qū)屬于深峰叢洼地,峰頂海拔多為800—1000 m,洼地、谷地海拔為600—800 m,地貌較為相似,因此其植被群落組成與結(jié)構(gòu)也較接近。環(huán)江地區(qū)屬低中山峰叢洼地,海拔介于442—637 m之間,其植被群落組成與結(jié)構(gòu)與都安、大化地區(qū)有明顯差異。地上植物群落結(jié)構(gòu)與組成的變化導(dǎo)致凋落物的質(zhì)量和根系分泌物存在差異,間接影響固氮微生物種間的競(jìng)爭(zhēng)力,從而使整個(gè)固氮微生物群落結(jié)構(gòu)與組成發(fā)生改變[25]。

土壤理化性質(zhì)是影響固氮微生物群落的另一重要因素。已有的研究表明,pH、全氮、全碳、全鉀、碳氮比和有效態(tài)磷都會(huì)顯著影響固氮微生物群落的多樣性與結(jié)構(gòu)[6, 19, 26]。本研究中,總氮、有效態(tài)鉀、有效態(tài)鈣顯著影響固氮微生物群落,這與之前的研究結(jié)論一致。固氮微生物在氮素缺乏的土壤中更具競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),土壤氮素含量的變化會(huì)影響固氮微生物與其它土壤微生物的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,從而影響固氮微生物的群落組成[27]；而土壤有效態(tài)鈣可能通過(guò)影響固氮酶活性來(lái)影響固氮微生物群落。綜上所述,地上植物群落、土壤環(huán)境、固氮微生物群落三者之間相互影響,存在協(xié)同演變機(jī)制。今后研究中,有必要從物種的水平上,具體分析固氮微生物與植物、土壤因子之間的耦合機(jī)制。

[1] Dixon R, Kahn D. Genetic regulation of biological nitrogen fixation. Nature Reviews Microbiology, 2004, 2(8): 621- 631.

[2] 楊成德, 龍瑞軍, 陳秀蓉, 薛莉. 土壤微生物功能群及其研究進(jìn)展. 土壤通報(bào), 2008, 39(2): 421- 425.

[3] Poly F, Ranjard L, Nazaret S, Gourbière F, Monrozier L J. Comparison ofnifHgene pools in soils and soil microenvironments with contrasting properties. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(5): 2255- 2262.

[4] Gaby J C, Buckley D H. A comprehensive alignednifHgene database: a multipurpose tool for studies of nitrogen-fixing bacteria. Database, 2014, doi: 10.1093/database/bau001.

[5] Orr C H, James A, Leifert C, Cooper J M, Cummings S P. Diversity and activity of free-living nitrogen-fixing bacteria and total bacteria in organic and conventionally managed soils. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(3): 911- 919.

[6] Mirza B S, Potisap C, Nüsslein K, Bohannan B J M, Rodrigues J L M. Response of free-living nitrogen-fixing microorganisms to land use change in the Amazon rainforest. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80(1): 281- 288.

[7] Wang J C, Zhang D, Zhang L, Li J, Raza W, Huang Q W, Shen Q R. Temporal variation of diazotrophic community abundance and structure in surface and subsoil under four fertilization regimes during a wheat growing season. Agriculture, Ecosystems & Environment, 2016, 216: 116- 124.

[8] Wardle D A, Bardgett R D, Klironomos J N, Set?l? H, Van Der Putten W H, Wall D H. Ecological linkages between aboveground and belowground biota. Science, 2004, 304(5677): 1629- 1633.

[9] Van Der Heijden M G A, Bardgett R D, Van Straalen N M. The unseen majority: soil microbes as drivers of plant diversity and productivity in terrestrial ecosystems. Ecology Letters, 2008, 11(3): 296- 310.

[10] Bever J D, Broadhurst L M, Thrall P H. Microbial phylotype composition and diversity predicts plant productivity and plant-soil feedbacks. Ecology Letters, 2013, 16(2): 167- 174.

[11] 彭晚霞, 王克林, 宋同清, 曾馥平, 王久榮. 喀斯特脆弱生態(tài)系統(tǒng)復(fù)合退化控制與重建模式. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2008, 28(2): 811- 820.

[12] 杜虎, 彭晚霞, 宋同清, 王克林, 曾馥平, 鹿士楊, 時(shí)偉偉, 唐成, 譚秋錦. 桂北喀斯特峰叢洼地植物群落特征及其與土壤的耦合關(guān)系. 植物生態(tài)學(xué)報(bào), 2013, 37(3): 197- 208.

[13] 周煉川, 陳效民, 李孝良, 楊新強(qiáng), 黃代民. 西南喀斯特地區(qū)典型石漠化階段土壤氮素變異研究. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 28(8): 1753- 1757.

[14] Johnson D W, Turner J. Nitrogen budgets of forest ecosystems: A review. Forest Ecology and Management, 2014, 318: 370- 379.

[15] Vitousek P M, Menge D N L, Reed S C, Cleveland C C. Biological nitrogen fixation: rates, patterns and ecological controls in terrestrial ecosystems. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 2013, 368(1621): 20130119.

[16] 劉成剛, 薛建輝. 喀斯特石漠化山地不同類型人工林土壤的基本性質(zhì)和綜合評(píng)價(jià). 植物生態(tài)學(xué)報(bào), 2011, 35(10): 1050- 1060.

[17] Lu X Q, Toda H, Ding F J, Fang S Z, Yang W X, Xu H G. Effect of vegetation types on chemical and biological properties of soils of karst ecosystems. European Journal of Soil Biology, 2014, 61: 49- 57.

[18] Porteous L A, Armstrong J L, Seidler R J, Watrud L S. An effective method to extract DNA from environmental samples for polymerase chain reaction amplification and DNA fingerprint analysis. Current Microbiology, 1994, 29(5): 301- 307.

[19] Tai X S, Mao W L, Liu G X, Chen T, Zhang W, Wu X K, Long H Z, Zhang B G, Zhang Y. High diversity of nitrogen-fixing bacteria in the upper reaches of the Heihe River, northwestern China. Biogeosciences, 2013, 10(8): 5589- 5600.

[20] 董志新, 孫波, 殷士學(xué), 隋躍宇. 氣候條件和作物對(duì)黑土和潮土固氮微生物群落多樣性的影響. 土壤學(xué)報(bào), 2012, 49(1): 130- 138.

[21] Hsu S F, Buckley D H. Evidence for the functional significance of diazotroph community structure in soil. The ISME Journal, 2009, 3(1): 124- 136.

[22] Izquierdo J A, Nüsslein K. Distribution of extensivenifHgene diversity across physical soil microenvironments. Microbial Ecology, 2006, 51(4): 441- 452.

[23] Patra A K, Abbadie L, Clays-Josserand A, Degrange V, Grayston S J, Guillaumaud N, Loiseau P, Louault F, Mahmood S, Nazaret S, Philippot L, Poly F, Prosser J I, Le Roux X. Effects of management regime and plant species on the enzyme activity and genetic structure of N-fixing, denitrifying and nitrifying bacterial communities in grassland soils. Environmental Microbiology, 2006, 8(6): 1005- 1016.

[24] 劉驍蒨, 涂仕華, 孫錫發(fā), 辜運(yùn)富, 張先琴, 張小平. 秸稈還田與施肥對(duì)稻田土壤微生物生物量及固氮菌群落結(jié)構(gòu)的影響. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2013, 33(17): 5210- 5218.

[25] 王邵軍, 阮宏華. 土壤生物對(duì)地上生物的反饋?zhàn)饔眉捌錂C(jī)制. 生物多樣性, 2008, 16(4): 407- 416.

[26] Teng Q H, Sun B, Fu X R, Li S P, Cui Z L, Cao H. Analysis ofnifHgene diversity in red soil amended with manure in Jiangxi, South China. The Journal of Microbiology, 2009, 47(2): 135- 141.

[27] 鄭棉海, 陳浩, 朱曉敏, 毛慶功, 莫江明. 礦質(zhì)養(yǎng)分輸入對(duì)森林生物固氮的影響. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2015, 35(24): 7941- 7954.

The relationships among nitrogen-fixing microbial communities, plant communities, and soil properties in karst regions

LIU Lu1,2, HE Xunyang1, DU Hu1, WANG Kelin1,*

1KeyLaboratoryofAgro-ecologicalProcessesinSubtropicalRegion,InstituteofSubtropicalAgriculture,ChineseAcademyofSciences,Changsha410125,China2HunanAgriculturalBiotechnologyResearchCenter,Changsha410125,China

Soil nitrogen-fixing microorganisms are one of the most important functional microorganisms; however, their relationship with plant communities and soil conditions is poorly understood. In the present study, three typical karst regions (Huanjiang, Du′an, and Dahua) were selected and quadrats were established in typical vegetation types (grassland, scrubland, and secondary forest). A total of 27 quadrats (3 replicates for each vegetation type) were established and the size of each quadrat was 20 m × 30 m. The composition and structure of plant communities were studied by vegetation surveys, soil properties were determined, and the structure and composition of soil nitrogen-fixing microorganisms were analyzed by building clone libraries and sequencing. Following that, the relationships between nitrogen-fixing microbial communities, plant communities, and soil conditions were explored. Principal coordinates analysis indicated that the composition and structure of the plant communities were obviously different between vegetation types. Comparing plant communities among the three regions, the Du′an and Dahua regions were found to have similar plant composition and structure. Soil properties also differed between vegetation types and regions. Total carbon, total nitrogen, and available Fe, Ca, and Mg were affected by vegetation type and region, while available K was mainly affected by vegetation type and pH, and available P was mainly affected by region. BLAST results indicated that the predominant nitrogen-fixing microbial species in our study area belonged to the genusBradyrhizobium. The composition of nitrogen-fixing microbial communities varied across both vegetation types and regions. There were only nine shared operational taxonomic units (OTUs) among the three regions, and only eleven shared OTUs in the three vegetation types. The number of shared OTUs between the Du′an and Dahua regions was 39, which was much higher than that of the Huanjiang region. This indicated that the composition and structure of plant communities were similar to each other, as were the composition and structure of the soil nitrogen-fixing microbial communities. Mantel correlation analysis also showed that soil nitrogen-fixing microbial communities and plant communities were significantly correlated (r= 0.6116,P= 0.011). From the canonical correspondence analysis, the cumulative explanation of the first two axes was only 22.72%, which could not fully explain the variation in the nitrogen-fixing microbial communities. Total nitrogen, available potassium, and available calcium had a significant effect on the nitrogen-fixing microbial communities. This suggests that further research is required to determine additional soil properties. In conclusion, soil nitrogen-fixing microbial communities, plant communities, and soil conditions were mutually affected by each other. Therefore, during the process of karst ecological restoration and reconstruction, it is important that both the aboveground vegetation and the belowground functional microbial communities are given equal attention.

nitrogen-fixing microbial community;nifHgene; re-vegetation; karst

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFC0502400)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31400412,31270551)

2016- 06- 14;

2017- 01- 16

10.5846/stxb201606141146

*通訊作者Corresponding author.E-mail: kelin@isa.ac.cn

劉璐,何尋陽(yáng),杜虎,王克林.喀斯特土壤固氮微生物群落與植被、土壤的關(guān)系.生態(tài)學(xué)報(bào),2017,37(12):4037- 4044.

Liu L, He X Y, Du H, Wang K L.The relationships among nitrogen-fixing microbial communities, plant communities, and soil properties in karst regions.Acta Ecologica Sinica,2017,37(12):4037- 4044.