殼聚糖衍生物手性固定相的制備及其分離性能

梁 爽，賓 琴，柏正武，陳 偉

武漢工程大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430205

殼聚糖衍生物手性固定相的制備及其分離性能

梁 爽，賓 琴，柏正武，陳 偉*

武漢工程大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430205

為研制新的手性分離材料，分別合成了殼聚糖-二（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）-（苯甲酰胺）和殼聚糖-二（4-甲基苯基氨基甲酸酯）-（苯甲酰胺）兩個(gè)衍生物.發(fā)現(xiàn)在殼聚糖的苯甲酰化中，當(dāng)酸酐用量為殼聚糖結(jié)構(gòu)單元摩爾數(shù)的6倍時(shí)，能制得完全苯甲酰化殼聚糖.將這兩個(gè)殼聚糖衍生物涂覆于氨丙基硅膠表面制得兩種手性固定相.以12個(gè)手性化合物為分析物在正己烷∕異丙醇，正己烷∕乙醇，正己烷∕甲醇∕乙醇流動(dòng)相條件下，用高效液相色譜對兩種手性固定相的分離性能進(jìn)行了評價(jià)，分離結(jié)果表明，這兩種手性固定相對所用的分析物有較好的手性識別性能.同時(shí)根據(jù)分離結(jié)果探討了流動(dòng)相組成對手性分離的影響.

殼聚糖；苯甲酰化；手性分離材料；高效液相色譜；手性識別

以手性固定相（chiral stationary phase，CSP）為基礎(chǔ)的高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）目前是拆分手性化合物對映體最有效的方法之一.其不僅能用于對映體含量的檢測，還能用于制備級的分離［1-3］.涂覆型多糖類固定相的手性分離能力強(qiáng)、負(fù)載量高，因而成為應(yīng)用最廣泛的手性分離材料［1］.其中由Okamoto等研制的纖維素和直鏈淀粉衍生物涂覆型固定相被公認(rèn)為具有最好的分離性能［4-6］.但因纖維素和直鏈淀粉衍生物在乙酸乙酯、氯仿、四氫呋喃等有機(jī)溶劑中易溶解或高度溶脹，這類涂覆型手性固定相不能在含上述有機(jī)溶劑的流動(dòng)相中使用，因此其在手性分離中的應(yīng)用受到較大程度的限制［7-9］.甲殼素與纖維素的結(jié)構(gòu)十分相似，都是由β-D-葡萄糖通過1，4-β糖苷鍵連接而成，其高分子鏈均形成規(guī)整的螺旋結(jié)構(gòu)［7］.經(jīng)脫乙酰后，甲殼素可轉(zhuǎn)化為殼聚糖.據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，甲殼素及殼聚糖衍生物在有機(jī)溶劑中的溶脹率小，難溶于有機(jī)溶劑，況且有些衍生物也有很好的手性識別能力，所以近年來，一些課題組相繼報(bào)道了新的殼聚糖衍生物及其固定相，并且這些固定相在流動(dòng)相中有很好的耐受性［10-13］.在手性分離材料的研究領(lǐng)域中，仍需解決的問題是研制分離性能好且對有機(jī)溶劑有較強(qiáng)耐受性的手性選擇體（chiral selector，CS），并闡明其手性識別的機(jī)制.

本文使用超高脫乙酰度殼聚糖為原料，合成了兩種新的殼聚糖衍生物，即殼聚糖-二（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）-（苯甲酰胺）和殼聚糖-二（4-甲基苯基氨基甲酸酯）-（苯甲酰胺），分別將其涂覆于氨丙基硅膠表面，制備成手性固定相，使用一系列手性化合物評價(jià)其手性分離性能，并根據(jù)分離結(jié)果探討了流動(dòng)相組分對手性分離的影響（見圖1）.

圖1 N-苯甲酰殼聚糖衍生物手性固定相的制備Fig.1 Preparation scheme of CSPs of N-benzoylated chitosan derivatives

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

Alltech 1666色譜柱填充泵（美國Alltech公司）；Vario EL III CHNOS元素分析儀（德國Ele?mentar公司）；不銹鋼空色譜柱250 mm×4.6 mm（美國熱電集團(tuán)）；Agilent DD2 400 MHz核磁共振儀（美國安捷倫公司）；Nicolet 5DX FT-IR紅外光譜儀（美國尼高力公司）；高效液相色譜儀系統(tǒng)（美國Waters公司）.7 μm球形大孔硅膠（日本Daiso公司）；甲殼素（濰坊海之源生物制品有限公司，工業(yè)級）；苯甲酸酐（阿拉丁試劑有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%）；正戊醇、硼氫化鈉、N，N-二甲基乙酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、甲苯、三乙胺、丙酮、甲醇、無水氯化鋰、氫氧化鈉等均為分析純，與用作色譜流動(dòng)相的有機(jī)溶劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；3-氨丙基三乙氧基硅烷（百靈威科技有限公司，分析純）；異氰酸酯（濮陽市宏達(dá)圣導(dǎo)新材料有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%）.

1.2 手性選擇體的制備

按 m（甲殼素）∕m（NaOH）∕m（正戊醇）=1∕5∕11（質(zhì)量比）的比例將20.20 g干燥甲殼素置于500 mL三口瓶中，加入101 g NaOH和222.2 g正戊醇，加熱至150℃，機(jī)械攪拌，回流3 h，過濾，洗至中性，烘干得14.25 g脫乙酰化的殼聚糖，產(chǎn)率：89%，參照文獻(xiàn)［14］，測得粘均分子量為 2.8×105；1H NMR（CF3COOD，δ∕化學(xué)位移）：3.50～5.20（m，殼聚糖骨架H），2.25（CH3CO-）；EA%：Calcd（C6H11NO4·0.5H2O）nC：43.57，H：6.99，N：8.41；Found C：43.20，H：7.18，N：7.70.脫乙酰度（degree of deacetylation，DD）為98%.

取1 g苯甲酸和30 g蒸餾水于250 mL的三口燒瓶中，加熱攪拌至苯甲酸完全溶解，稱取1.50 g殼聚糖于苯甲酸水溶液中，待其溶解.溶解后，邊攪拌邊加入80 mL甲醇，最后在25℃下加入19.45 g苯甲酸酐和70 mL甲醇，7 h后，反應(yīng)結(jié)束，將所得反應(yīng)液傾入500 mL的28.05 g∕L KOH-乙醇溶液中，攪拌2 h，靜置過夜，過濾.用乙醇將產(chǎn)物洗至中性，干燥得2.25 g N-苯甲酰殼聚糖，產(chǎn)率：91%；1H NMR（CF3COOD，δ∕化學(xué)位移）：7.56～7.85（t，5H，Ph-H），3.86-5.10（m，7H，殼聚糖骨架H）；EA%：Calcd（C13H15NO5·1.0H2O）nC：54.94，H：6.06，N：4.97；Found C：54.89，H：6.32，N：5.19.

稱取1.20 g干燥的LiCl和15 mL干燥的DMAc加于100 mL三口燒瓶中，加熱至80℃使LiCl完全溶解，再加入1.0 g干燥的N-苯甲酰殼聚糖（3.9 mmol），溶解過夜.最后加入催化量的DMAP及 2.4 mL（20.0 mmol）4-甲基苯基異氰酸酯，于87℃下反應(yīng)30 h.反應(yīng)結(jié)束后，趁熱逐滴加入至200 mL甲醇中得到沉淀物，過濾，干燥.將粗產(chǎn)物溶于15 mL DMF中，再在200 mL甲醇中進(jìn)行重沉淀.如此重復(fù)操作4次，至濾液經(jīng)薄層色譜檢測不到有機(jī)物為止.干燥至恒重，得1.76 g殼聚糖-二（4-甲基苯基氨基甲酸酯）-（苯甲酰胺），即CS1，產(chǎn)率為：93%；IR（KBr，cm-1）υ：3 292～3 417（－NH），2857（－CH3），1732（－CO2－），1659（－CONH－），3 014～3 081，1 607（－Ph），1 524（－CONH－，－ Ph）；EA% ：Calcd（C29H29N3O7·1.25H2O）nC：62.78，H：5.74，N：7.60；Found C：62.94，H：5.94，N：7.70.

以3，5-二甲基苯基異氰酸酯代替4-甲基苯基異氰酸酯，按上述方法制得殼聚糖-二（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）-（苯甲酰胺），即CS2，產(chǎn)率：88%；IR（KBr，cm-1）υ：3 401（－NH），2 860（－CH3），1720（－CO2－），1649（－CONH－），3 052～3 103，1 614（－Ph），1 540（－CONH－，－Ph）；EA%：Calcd（C31H33N3O7·0.5H2O）nC：65.41，H：6.04，N：7.41；Found C：65.70，H：6.27，N：7.22.

1.3 手性固定相的制備和填裝

參照文獻(xiàn)中的方法制備氨丙基硅膠［11］.將CS1或CS2涂覆于氨丙基硅膠表面，干燥至恒重，即為CSP1或CSP2，涂敷量為16%.所得CSP1和CSP2均采用勻漿法裝柱，頂替液為正己烷.

在25 ℃下，以V（正己烷）∕V（異丙醇）（90∕10，體積比）為流動(dòng)相，流速為1 mL∕min的條件下分別使用聯(lián)苯和1，3，5-三（叔丁基）苯為檢測物，測定柱效和死時(shí)間（t0）.容量因子 k=（tR-t0）∕t0，其中，tR為樣品組分的保留時(shí)間，t0為1，3，5-三叔丁基苯的保留時(shí)間；分配因子α=k2∕k1，k1和 k2分別為兩個(gè)對映體的容量因子，當(dāng)α＞1，即為手性識別；Rs=2（tR2-tR1）∕（w1+w2），其中tR為對映體色譜峰的保留時(shí)間，w為色譜峰的峰底寬，當(dāng)RS≥1.50，兩個(gè)對映體達(dá)到了基線分離.

2 結(jié)果與討論

2.1 N-苯甲酰殼聚糖的制備

一般認(rèn)為脫乙酰度為95%以上的殼聚糖為超高脫乙酰度殼聚糖［15］.本文基于殼聚糖核磁共振氫譜上的積分面積比計(jì)算殼聚糖的脫乙酰度，計(jì)算結(jié)果顯示D.D.約為98%.根據(jù)殼聚糖的脫乙酰度為98%計(jì)算出其元素分析的理論值.考慮到殼聚糖分子容易與水形成氫鍵從而吸附水分子，其元素分析計(jì)算結(jié)果實(shí)際上是加上水分子后的擬合值，在計(jì)算苯甲酰化殼聚糖和殼聚糖-二（甲基苯基氨基甲酸酯）-（本甲酰胺）元素分析的理論值時(shí)，也有相同的情況，即殼聚糖的D.D.為98%，每個(gè)結(jié)構(gòu)單元結(jié)合了一定數(shù)量的水分子.其實(shí)D.D.為98%的殼聚糖和D.D.為100%的殼聚糖元素分析理論值非常接近，如前者的元素分析理論值分別是：C：43.57，H：6.99，N：8.41.而后者的則是 C：44.72，H：6.88，N：8.69.所以，在殼聚糖及其衍生物的表征中，元素分析的理論值是基于殼聚糖脫乙酰度為100%情況下的計(jì)算結(jié)果。

圖2 是不同取代度的N-苯甲酰殼聚糖的1H NMR譜圖.出當(dāng)酸酐按照與殼聚糖結(jié)構(gòu)單元等摩爾量投料時(shí)，所制備得到N-苯甲酰殼聚糖的1H NMR譜圖如圖2a所示，殼聚糖骨架氫質(zhì)子個(gè)數(shù)與苯基質(zhì)子個(gè)數(shù)的理論值之比應(yīng)為7∕5，所以由圖2a可知，苯甲酰基的實(shí)際取代度大約只有50%.當(dāng)酸酐按照殼聚糖結(jié)構(gòu)單元摩爾個(gè)數(shù)的6倍投料時(shí)，所制備的N-苯甲酰殼聚糖的1H NMR譜圖如圖2b所示，取代度達(dá)到100%，殼聚糖的氨基全部被苯甲酰化.而觀察苯甲酰化殼聚糖的紅外光譜圖，發(fā)現(xiàn)沒有明顯的酯基峰，表明殼聚糖上的氨基被選擇性地苯甲酰化，而羥基則沒有被苯甲酰化生成相應(yīng)的酯.

2.2 CSP1和CSP2的手性分離性能評價(jià)

使用聯(lián)苯在V（正己烷）∕V（異丙醇）（90∕10，體積比）中測得CSP1的柱效為3.8×104理論塔板數(shù)，相應(yīng)色譜峰的對稱因子為1.07；CSP2的柱效為3.4×104，色譜峰的對稱因子為1.09.

CSP1和CSP2的柱效都較為理想，均適用于色譜分離.圖3為本文所使用的12個(gè)手性樣品結(jié)構(gòu)式，CSP1和CSP2對這些手性化合物的分離結(jié)果如表1所示.從表1可知，CSP1和CSP2對本文中選用手性樣品都有較好的手性識別能力，兩種固定相都識別了10個(gè)手性化合物，其中CSP1基線分離了3個(gè)，CSP2基線分離了5個(gè).相對而言，CSP2的手性分離性能更好.此外，從表1中的數(shù)據(jù)還可以看出，CSP1和CSP2在一定程度上能起到互補(bǔ)的作用.如5號和8號樣品均被CSP2識別而未被CSP1識別，在三種流動(dòng)相條件下2號樣品在CSP1上只能識別，而在CSP2上均能被基線分離；相反地，4號和10號樣品只被CSP1識別，且10號樣品在CSP1上能被基線分離.

圖2 不同投料比制備的N-苯甲酰殼聚糖的1H NMR譜圖Fig.2 1H NMR spectra of N-benzoylated chitosans prepared by various fed ratios of benzoic anhydride

圖3 手性分析物的結(jié)構(gòu)式Fig.3 Structures of chiral analytes

2.3 流動(dòng)相組成對手性分離性能的影響

從表1中的分離結(jié)果可以得出，CSP1和CSP2均在正己烷∕異丙醇這類流動(dòng)相中能識別最多的手性樣品，都能識別9個(gè)手性化合物，且保留時(shí)間最長.而在正己烷∕甲醇∕乙醇流動(dòng)相中識別樣品的數(shù)目均最少，CSP1只能識別5個(gè)，CSP2能識別8個(gè).這可能是由于流動(dòng)相中幾種醇的極性和黏度的不同，使得手性樣品在不同的流動(dòng)相中的保留時(shí)間和擴(kuò)散系數(shù)不同，從而導(dǎo)致同一手性樣品在不同流動(dòng)相組分中分離度不同［10］.且醇中烴基的大小對手性選擇體與手性樣品之間的相互作用會(huì)有一定的影響，從而導(dǎo)致同一樣品在相同CSP上的識別情況不同.如在CSP1上，4號樣品只在正己烷∕異丙醇中被識別，而在CSP2上，6號樣品只在正己烷∕甲醇∕乙醇中被識別.總而言之，對于CSP1和CSP2來說，由正己烷∕異丙醇組成的混液是最適合的流動(dòng)相.

表1 CSP1及CSP2的手性分離比較Tab.1 Comparison of CSP1 and CSP2 in enanoseparation

3 結(jié) 語

本文將殼聚糖2-位上的氨基選擇性地苯甲酰化，再用兩種不同異氰酸酯修飾苯甲酰化殼聚糖上的羥基，分別制得殼聚糖-二（4-甲基苯基氨基甲酸酯）-（苯甲酰胺）和殼聚糖-二（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）-（苯甲酰胺）兩種衍生物.探索了苯甲酰化反應(yīng)中酸酐的用量對產(chǎn)物取代度的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)酸酐的用量為殼聚糖結(jié)構(gòu)單元摩爾數(shù)的6倍時(shí)，能制得完全苯甲酰基化的殼聚糖.將上述兩種殼聚糖衍生物涂覆于氨丙基硅膠表面，得到兩種手性固定相CSP1和CSP2.分離結(jié)果表明，CSP1和CSP12能識別相同數(shù)量的手性樣品對映體，而CSP1能基線分離更多的手性樣品.再則，這兩種固定相在手性分離方面能起到相互補(bǔ)充的作用.通過比較這兩種CSP在不同組分流動(dòng)相中的分離結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，由正己烷和異丙醇組成的混合液是這兩種固定相的最適流動(dòng)相，而在由正己烷、甲醇和乙醇組成的流動(dòng)相中，這兩種固定相的手性識別性能則相對較差.

［1］CAVAZZINI A，PASTI L，MASSI A，et al.Recent applications in chiral high performance liquid chromatography： areview ［J］. Analytica Chimica Acta，2011，706：205-222.

［2］OKAMOTO Y， IKAI T， SHEN J.Controlled immobilization of polysaccharide derivatives for efficient chiral separation［J］. Israel Journal of Chemistry，2011，51：1096-1106.

［3］魏文娟，張君毅，尹傳奇，等.兩種聚合物型手性固定相的分離特性［J］.武漢工程大學(xué)學(xué)報(bào)，2008（3）：1-3.WEIW J， ZHANG JY， YIN C Q， etal.Enantioseparation properties of two polymer type chiral stationary phases［J］.Journal of Wuhan Institute of Technology，2008（3）：1-3.

［4］OKAMOTO Y.Helical polymers for efficient enantiomer separation［J］.Advances in Polymer Science，2013，261：391-414.

［5］KURKA O，KUCERA L，BEDNAR P.Analytical and semipreparative chiral separation of cis-itraconazole on cellulose stationary phases by high-performance liquid chromatography［J］.Journal of Separation Science，2016，39：2736-2745.

［6］翁西倫，鮑宗必，羅飛，等.纖維素類手性色譜固定相的制備及其應(yīng)用［J］. 化學(xué)進(jìn)展，2014，26（ 2 ∕3）：415-423.WENG X L，BAO Z B，LUO F，et al.Preparation and application ofimmobilized chiralstationary phase bonded cellulose［J］.Progress in Chemistry，2014,26（2 ∕3）：415-423.

［7］IKAI T，YAMAMOTO C，KAMIGAITO M，et al.Immobilized-type chiral packing materials for HPLC based on polysaccharide derivatives［J］.Journal of Chromatography B，2008，875：2-11.

［8］狄斌，趙敬丹，馮芳，等.鍵合型纖維素手性固定相的制備及應(yīng)用［J］. 中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40（5）：431-434.DI B，ZHAO J D，F(xiàn)ENG F，et al.Preparation and application ofimmobilized chiralstationary phase bonded cellulos［J］.Journal of China Pharmaceutical University，2009，40（5）：431-434.

［9］涂鴻盛，范軍，譚藝，等.新型鍵合纖維素手性固定相的制備及其拆分性能評價(jià)［J］.色譜，2014，32（5）：452-457.TU H S，F(xiàn)AN J，TAN Y，et al.Preparetion of new immobilized cellulose-based chiral stationry phase and its enantioseparation behaviors［J］.Chinese Journal of Chromatography，2014，32（5）：452-457.

［10］王曉晨.甲殼素及殼聚糖衍生物手性固定相的制備與性能［D］.武漢：武漢工程大學(xué)，2015.

［11］WANG J，HUANG S H，CHEN W，et al.Eluent tolerance and enantioseparation recovery of chiral packing materials based on chitosan bis（phenylcarbamate） -（n-octyl urea） s for high performance liquid chromatography［J］.Molecules，2016，21：1528-1541.

［12］TANG S，BIN Q，CHEN W，et al.Chiral stationary phases based on chitosan bis（methylphenylcarbamate） - （isobutyrylamide） for high-performance liquid chromatography［J］.Jounal of Chromatography A，2016，1440：112-122.

［13］羅迎彬，王曉晨，陳偉，等.殼聚糖苯甲酰化衍生物固定相的制備及其手性識別［J］.高分子學(xué)報(bào)，2014（8）：1103-1109.LUO Y B，WANG X C，CHEN W，et al.Preparation and chiral recognition of chiral stationary phases derived from Benzoylated Chitosan［J］.Acta Polymerica Sinica，2014（8）：1103-1109.

［14］柏正武，付克勤，賓琴，等.不同分子量超高限度殼聚糖的制備［J］. 武漢工程大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，36（8）：16-19.BAI Z W，F(xiàn)U K Q，BIN Q，et al.Preparation of chitosan with various molecular weight and ultra-high degree of deacetylation［J］.Journal of Wuhan Institute of Technology，2014，36（8）：16-19.

［15］蔣挺大.殼聚糖［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

本文編輯：張 瑞

Preparation and Enantioseparation Performance of Chiral Stationary Phases Derived from Chitosan Derivatives

LIANG Shuang，BIN Qing，BAI Zhengwu，CHEN Wei*
School of Chemistry and Environmental Engineering，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430205，China

To develop new materials for enantioseparation，chitosan bis（3，5-dimethylphenylcarbamate）-（benzamide） and chitosan bis（4-methylphenylcarbamate）-（benzamide） were prepared.With regard to the benzoylation of chitosan，the complete benzoylation was achieved when benzoic anhydride was fed at six equivalences of the glucosamine.The two chitosan derivatives were coated on the surface of aminopropyl silica gel，then the corresponding chiral stationary phases were obtained.The enantioseparation performance of the two chiral stationary phases was evaluated with 12 chiral compounds by high performance liquid chromatography in the mobile phases of n-hexane∕isopropanol，n-hexane∕ethanol and n-hexane∕methanol∕ethanol.The results show that the chiral stationary phases possess good chiral recognition capability towards the analytes.Meanwhile，the influence of the composition of the mobile phase on enantioseparation was discussed according to the separation results.

chitosan；benzoylation；chiral separation material；high performance liquid chromatography；chiral recognition

O636.9

A

10.3969∕j.issn.1674?2869.2017.04.003

2017-05-09

國家自然科學(xué)基金（51373127）

梁 爽，碩士研究生.E-mail：398520795@qq.com

*通訊作者：陳 偉，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師.E-mail：50261295@qq.com

梁爽，賓琴，柏正武，等.殼聚糖衍生物手性固定相的制備及其分離性能［J］.武漢工程大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，39（4）：320-325.

LIANG S，BIN Q，BAI Z W，et al.Preparation and enantioseparation capability of chiral stationary phases derived from chitosan derivatives［J］.Journal of Wuhan Institute of Technology，2017，39（4）：320-325.

1674-2869（2017）04-0320-06