直投式發酵辣椒復合菌劑的制備

沈暢萱 王修俊 朱隆繪 黃 珊

(1. 貴州大學發酵工程與生物制藥省級重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2. 貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025)

?

直投式發酵辣椒復合菌劑的制備

沈暢萱 王修俊 朱隆繪 黃 珊

劉佳慧LIUJia-hui尹 爽YINShuang田 多TIANDuo

(1. 貴州大學發酵工程與生物制藥省級重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2. 貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025)

為開發發酵辣椒復合菌劑，提高發酵辣椒工業生產效率，對從自然發酵辣椒中篩選鑒定出的菌株進行產酸能力、耐酸性、耐鹽性和安全性等發酵能力測定，選擇出發酵菌劑的備選菌株為植物乳桿菌、乳酸乳球菌和枯草芽孢桿菌。通過接種配比試驗和對發酵條件的優化，得出復合菌劑的最佳配方：菌液(枯草芽孢桿菌∶乳酸乳球菌∶植物乳桿菌)體積比為1∶4∶1，接種量6%，發酵時間66 h，鹽濃度4%。該條件下得出的發酵辣椒產酸量為0.77%；感官評定分數17.525。

發酵辣椒；直投式；復合菌劑；發酵能力

自然發酵辣椒是中國傳統調味品。但由于自然菌群情況隨機多變，故其品質不易控制，安全性不穩定，且傳統發酵辣椒，多采用高鹽分腌制，使得發酵辣椒制品在色、香、味等各方面的感官大打折扣且不利于健康。目前發酵辣椒產業因工業化水平較低，存在發酵過程難以控制、受自然條件影響較大等劣勢，使得產品質量較低，難以大規模生產。

當前，中國對于發酵食品菌劑的研究多為單一菌劑的開發，王雪雅等[4]通過對10株乳酸菌進行產酸性、抑菌性等性能的篩選，選出產酸量為0.020 8 g/100 g的發酵乳桿菌和產酸量為0.020 3 g/100 g的食果糖乳桿菌；盧翰等[5]以純菌種發酵為基礎，探究出辣椒醬最適發酵工藝，發酵時間6 d，發酵結束后含酸量0.59%；崔小利等[6]對市售鲊辣椒中微生物進行分離、鑒定，并對得到的菌種產酸性等性能以及發酵成品的感官進行鑒定，得出鲊辣椒自然發酵過程中的主發酵菌是乳酸菌，純種發酵的適合菌種是植物乳桿菌；王微等[7]用純種發酵得到鲊辣椒的發酵時間為4 d。以上研究所得到的產品生產時間相對過長，在發酵過程中有很多不可控因素，發酵時間越長，其對產品品質影響越大。因此，縮短發酵時間有助于提高發酵辣椒的品質。關于快速發酵的研究，孟憲剛等[8]對西北酸菜高效復合發酵菌種進行篩選，選出分別具有產酸速度最快、醇香味適中、降解亞硝酸和發酵風味接受度最高的4種菌株，但未對復合后的菌劑進行鑒定；衛玲玲等[9]研究了用于發酵甘藍的微生物復配，配方為短乳桿菌與植物乳桿菌按1∶1復配，總接種量為2%～3%，發酵效果最好；張良等[10]對四川泡菜乳酸發酵菌劑進行研究，以四川老泡菜水為原料，分離、鑒定、篩選菌種，比較發酵劑發酵與傳統家庭泡菜的差異，針對葉菜類泡菜、茄果類泡菜和塊莖類泡菜研制不同的發酵菌劑配方。

本試驗擬以貴州遵義地區所產辣椒為原料，對自然發酵辣椒中篩選出的多個優勢菌株進行能力鑒定和復配的探究，以期解決生產發酵辣椒調味品生產過程中的關鍵技術問題。

1 材料和方法

1.1 試劑與設備

新鮮紅椒、生姜、大蒜、食鹽、紅星二鍋頭(52%Vol)：購于貴陽市沃爾瑪超市；

戊醇、鹽酸：分析純，重慶川江化學試劑廠；

MRS瓊脂培養基、MRS肉湯培養基、LB液體培養基、胰酪胨大豆液體培養基、肉湯瓊脂培養基：中國醫藥上海化學試劑公司；

抗生素紙片：杭州天和微生物試劑有限公司；

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、植物乳球菌(Lactococcusplantarum)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)：實驗室工作人員從自然發酵的辣椒中分離、篩選、鑒定后保留[11]；

紫外分光光度計：UV-2550型，上海元析儀器有限公司；

恒溫培養箱：SPX-150C型，上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 植物乳桿菌、植物乳球菌、乳酸乳球菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌分別用MRS 瓊脂培養基斜面活化。條件：(37±1) ℃，48 h，活化3 次[9]。

1.2.2 產酸能力試驗 取5 mL菌種接入100 mL培養基中，植物乳桿菌、植物乳球菌和乳酸乳球菌接入到MRS肉湯培養基，枯草芽孢桿菌接種到LB液體培養基，短小芽孢桿菌接種到胰酪胨大豆瓊脂培養基，于37 ℃培養48 h，每隔6 h取樣測定產酸量。

1.2.3 產酸量的測定 按GB 12456—2008中酸堿滴定法執行。

1.2.4 耐酸性試驗 將5 mL待測菌種接種于不同pH值(分別為2.0，3.0，3.5，4.0，5.0)的培養基中，所用培養基同1.2.2，于(37±1) ℃恒溫培養48 h。用紫外分光光度計測定波長為480 nm時，培養前、后的OD值，以二者的差值表示各菌種耐酸性(OD值之差越大則菌種的耐酸性越強)[12]。

1.2.5 耐鹽性試驗 將待測菌接種到1.2.2所述培養基，分別加入5%，9%，13%的氯化鈉，于(37±1) ℃恒溫培養48 h。用紫外分光光度計測定波長為480 nm時，培養前、后的OD值，以二者的差值表示各菌種耐鹽性(OD值之差越大則菌種的耐鹽性越強)[13]。

1.2.6 安全性試驗

(1) 硫化氫(H2S)試驗：取100 mL肉湯瓊脂培養基與2.5 mL現配的10%硫代硫酸鈉溶液滅菌后混合，冷卻至60 ℃，加入3 mL 10%醋酸鉛溶液，混合均勻，無菌分裝于試管中至5～6 cm，浸于冷水中冷凝成瓊脂膏。用接種針蘸取純培養物，沿管壁作穿刺，培養于37 ℃，1～2 d后觀察，培養基變黑色者為陽性，陰性應繼續培養至7 d。

(2) 產吲哚(靛基質)試驗：將被檢菌株接種于蛋白胨水培養基中于(36±1) ℃培養2 d后，加入3滴乙醚，搖動數次，靜置1 min，待乙醚上升后，沿試管壁緩緩加入2滴吲哚試劑，在乙醚和培養液之間產生紅色環狀物為陽性反應。

(3) 抗生素敏感性試驗：將抗生素貼紙貼附于已涂布被檢菌的培養基表面，于(32±1) ℃培養48 h后，測量記錄抑菌圈直徑。抗敏性有3種：① 敏感(S)，在常規藥量條件下試驗菌株可被所用抗菌藥物殺死或抑制；② 中介度(I)，為了消除因試驗條件及人工讀數等不可避免誤差而引起的試驗偏差，在“S”和“R”之間所設立的緩沖地帶；③ 耐藥(R)，在常規藥量條件下所用抗菌藥物并不能對受試菌株起到抑制作用。貼紙種類、藥物劑量和抑菌圈判斷標準見表1。

表1 藥敏試驗貼紙藥物劑量和紙片解釋結果?

? *表示青霉素藥物劑量單位為“U”。

(4) 產細菌素試驗：在培養基上涂布240 μL大腸桿菌和葡萄球菌，在無菌操作條件下將牛津杯垂直放入培養基中，之后將篩選出菌株的菌液在4 ℃下10 000 r/min離心15 min，將上清液倒入牛津杯中，在(37±1) ℃條件下培養48 h，用直尺直接測量抑菌圈大小，得到抑菌圈直徑減去牛津杯直徑做記錄。

1.2.7 發酵辣椒制備 挑選無雜質、無霉變、無腐爛的鮮紅辣椒洗凈晾干(不得摻入油)后，按比例加入鹽、白糖、酒、大蒜、生姜、復合發酵菌劑，存放于試驗要求溫度條件下約2 h，將拌有輔料的辣椒翻倒入壇，盛上壇沿水，蓋上壇蓋，于試驗要求溫度下發酵。

1.2.8 發酵菌劑的復配以及發酵條件的優化 根據1.2.2～1.2.5的試驗結果，選擇植物乳桿菌、乳酸乳球菌和枯草芽孢桿菌(菌懸液的濃度為107～108個/mL)作為發酵辣椒的復合發酵菌劑。以1.2.6方法制備發酵辣椒，通過單因素試驗和正交試驗，對菌種配比與發酵條件進行優化。

(1) 菌種比例對產酸的影響：食鹽濃度3%，發酵菌劑接種量5%，發酵時間60 h，發酵溫度(32±1) ℃，菌液(枯草芽孢桿菌∶乳酸乳球菌∶植物乳桿菌)體積比=1∶1∶1，2∶1∶1，1∶2∶1，1∶1∶2，1∶2∶2時，酸堿直接滴定測產酸量。

(2) 接種量對產酸的影響：食鹽濃度3%，菌液(枯草芽孢桿菌∶乳酸乳球菌∶植物乳桿菌)體積比1∶2∶1，接種量分別1%，3%，5%，7%，9%，發酵溫度(32±1) ℃，發酵時間60 h，測產酸量。

(3) 鹽濃度對產酸的影響：食鹽濃度分別1%，3%，5%，7%，9%，菌液(枯草芽孢桿菌∶乳酸乳球菌∶植物乳桿菌)體積比1∶2∶1，接種量5%，發酵溫度(32±1) ℃，發酵時間60 h，測產酸量。

(4) 發酵時間對產酸的影響：食鹽濃度3%，菌液(枯草芽孢桿菌∶乳酸乳球菌∶植物乳桿菌)體積比1∶2∶1，接種量5%，發酵溫度(32±1) ℃，發酵時間分別為24，36，48，60，72 h，測定產酸量。

(5) 溫度對產酸的影響：鹽濃度3%，菌液(枯草芽孢桿菌∶乳酸乳球菌∶植物乳桿菌)體積比1∶2∶1，接種量5%，溫度分別為30，32，34，36，38 ℃，發酵時間60 h，測得產酸量。

(6) 發酵工藝的優化：在菌液體積比(枯草芽孢桿菌∶乳酸乳球菌∶植物乳桿菌)、接種量、發酵時間和鹽濃度的單因素試驗基礎上，進行正交試驗。本試驗選取以上4個因素，采用L9(34)正交表。為全面考量產品，以感官鑒定為指標對發酵辣椒的工藝條件進行優化。正交試驗結果的分析采用軟件SPSS 20.0。

1.2.9 感官評定方法 感官鑒定依據見表2，由20人評分，感官指標評定方法采用模糊數學綜合評定方法，選取因素集U={形態，色澤，氣味，口味，脆度}，對應的評價集為V={差(5)，較差(10)，良(15)，優(20)}，上述因素的權重集為x={0.05，0.10，0.30，0.35，0.20}。

表2 發酵辣椒感官評定標準

2 結果與分析

2.1 菌種發酵能力測定

2.1.1 產酸能力測定 由圖1可知，乳酸乳球菌產酸能力最強，植物乳桿菌相對植物乳球菌后期產酸稍強，短小芽孢桿菌幾乎不產酸，枯草芽孢桿菌產酸能力較弱。故優先考慮乳酸乳桿菌、植物乳桿菌。枯草芽孢桿菌為好氧菌，可迅速消耗掉發酵辣椒環境中的氧氣，為乳酸菌提供一個良好的無氧環境，故將其列入備選菌種。

圖1 乳酸菌產酸能力試驗折線圖

2.1.2 耐酸性試驗 由圖2可知，乳酸乳球菌和植物乳桿菌的耐酸性較強，在pH 2.0時仍能生長，但相對較高pH值，生長明顯受到抑制；植物乳球菌和枯草芽孢桿菌耐酸性相對較弱，在pH 2.0時幾乎不生長；短小芽孢桿菌耐酸性最差，在pH 3.0時其OD差值為負數，可能是短小芽孢桿菌在pH 3.0的條件下出現死亡，細胞裂解自溶。通過此項測試，發現植物乳桿菌和乳酸乳球菌的耐酸性較強，故將此兩菌列為復合菌劑菌種首選。

2.1.3 耐鹽性試驗 一般市場和家庭自用的發酵辣椒口感較好的食鹽含量在7%～8%。由圖3可知，隨著食鹽濃度升高，待檢的菌株OD差值逐漸下降，即待檢菌株菌數逐漸減少，但所篩選的菌株都能在食鹽含量7%左右生長，均能達到發酵辣椒產品需求。

圖2 篩選菌株耐酸性試驗結果分析柱形圖

2.1.4 菌株安全性試驗 按照1.2.2的方法測得結果見表3～5。

由表3可知，所篩選出來的菌株硫化氫和靛基質試驗均為陰性，即不產生硫化氫氣體、不產生吲哚。

圖3 所篩選菌株耐鹽性試驗結果分析柱形圖

菌種名稱硫化氫試驗靛基質試驗植物乳桿菌 --植物乳球菌 --乳酸乳球菌 --枯草芽孢桿菌--短小芽孢桿菌--

由表4可知，具有抗藥性情況為：乳酸乳球菌，2種；植物乳桿菌，3種；植物乳球菌，4種；枯草芽孢桿菌，7種；短小芽孢桿菌，7種。在產酸量和耐鹽性都比較理想的前提下，應盡量選擇對多種抗生素敏感度較好的菌株來制作微生物發酵菌劑，故優先考慮乳酸乳球菌和植物乳桿菌。

由表5可知，植物乳桿菌和乳酸乳球菌可產生抑菌圈，產生細菌素；植物乳球菌僅對大腸桿菌有抑菌效果。枯草芽孢桿菌雖然產生抑菌圈但都較小；短小芽孢桿菌不產生抑菌圈。故優先考慮植物乳桿菌和乳酸乳球菌。

綜上，選取產酸能力、耐酸性、耐鹽性、菌株安全性均較好的乳酸乳球菌與植物乳桿菌，且需要耐酸性、耐鹽性、菌種安全性相對較好的好氧細菌——枯草芽孢桿菌，為乳酸乳球菌與植物乳桿菌盡快提供無氧環境，提高發酵主菌種的發酵效率。

表4 抗生素敏感性試驗結果

表5 菌株產細菌素試驗結果?

? - 表示無抑菌圈。

2.2 發酵菌劑的制備

根據單因素試驗結果，確定在(36±1) ℃，按表6進行正交試驗，結果見表7，方差分析見表8、9。

由表7～9可知，影響產酸量的主次因素：菌液體積比>接種量>發酵時間>鹽濃度，菌液體積比、接種量有極顯著影響，發酵時間有顯著性影響，鹽濃度的影響不顯著；影響感官評定的主次因素：菌液體積比>接種量>鹽濃度>發酵時間，菌液體積比、接種量和鹽濃度對其有顯著性影響，發酵時間影響不顯著。最優配方：菌液(枯草芽孢桿菌∶乳酸乳球菌∶植物乳桿菌)體積比1∶4∶1，接種量6%，發酵時間66 h，鹽濃度4%。因A3B3C3D3未出現在正交試驗表當中，需驗證其優越性，以產酸量和感官評分為考察指標，做3次驗證實驗取平均值，得到試驗結果：產酸量0.77%，感官評分17.525，大于正交表中A3B3C2D1結果，故最優方案為A3B3C3D3，即菌液(枯草芽孢桿菌∶乳酸乳球菌∶植物乳桿菌)體積比1∶4∶1，接種量6%，發酵時間66 h，鹽濃度4%。

表6 優化復合菌發酵辣椒工藝條件的正交試驗因素與水平

Table 6 Optimization of mixed bacteria fermentation the pepper process conditions on orthogonal experimental factors and level

水平A菌液體積比B接種量/%C發酵時間/hD鹽濃度/%11︰2︰1454221︰3︰1560331︰4︰16664

3 結論

通過對所篩菌株進行發酵能力試驗，以及對發酵因素的正交優化，確定了最佳工藝條件：菌液(枯草芽孢桿菌∶乳酸乳球菌∶植物乳桿菌)體積比1∶4∶1，接種量6%，發酵時間66 h，鹽濃度4%。復合發酵菌劑明顯縮短了發酵時間，減少了發酵過程中不確定因素發生的幾率，降低了發酵過程品質控制的難度。在發酵辣椒菌劑中加入了好氧菌枯草芽孢桿菌，可以迅速消耗掉發酵辣椒環境中殘留的氧氣，為其它起主要產酸作用的乳酸菌提供了良好的無氧發酵環境，也可以控制發酵環境中有效成分的氧化，在一定程度上延長了產品的保質期。由于辣椒具有季節性，后續可嘗試用干辣椒進行乳酸發酵，以保證企業規模化生產的不間斷。

表7 優化復合菌發酵辣椒工藝條件的正交試驗結果

表8 復合菌發酵辣椒正交試驗結果的產酸量方差分析?

Table 8 Acid production’s orthogonal experimental results of analysis of variance on mixed fermentation chili

方差來源偏差平方和自由度F顯著性A0.011234.595**B0.007223.738**C0.00124.595*D0.00122.452誤差0.00318總和13.57727

? **表示該因素對試驗結果有極顯著影響；*表示該因素對試驗結果有顯著影響。

表9 復合菌發酵辣椒正交試驗結果的感官評定方差分析

Table 9 Sensory evaluation score’s orthogonal experimental results of analysis of variance on mixed fermentation chili

方差來源偏差平方和自由度F顯著性A132.0142520.088**B14.396256.714**C0.88323.478D3.152212.417**誤差2.28418總和152.72927

? **表示該因素對試驗結果有極顯著影響。

[1] WATARU A, YUJI N, TOSHIKAZU Y. Exercise and functional food[J]. Nutrition Journal, 2006, 5(15): 1-8.

[2] UTE Schweiggert, REINHOLD Carle, ANDREAS Schieber. Characterization of major and minor capsaicinoids and related compounds in chili pods(Capsicum frutescens L.)by high-performance liquid chromatography/atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta, 2006(557): 236-244.

[3] MACHO A. Non-pungent capsaicinoids from sweet pepper synthesis and evaluation of the chemopreventive and anticancer potential[J]. Eur Nutr, 2003, 42(1): 2-9.

[4] 王雪雅, 吳華麗, 丁筑紅, 等. 純種乳酸菌接種發酵辣椒綜合品質特性研究[J]. 中國釀造, 2016(9): 119-124.

[5] 盧翰, 蘇愛軍, 譚興和. 辣椒醬發酵工藝研究[J]. 食品與機械, 2006, 22(3): 126-129.

[6] 崔小利, 王薇, 闞建全. 鲊辣椒純種發酵的菌株優選[J]. 食品科學, 2014(21): 149-153.

[7] 王微, 闞建全. 響應面法優化鲊辣椒的純種發酵工藝[J]. 食品科學, 2014(7): 143-148.

[8] 孟憲剛, 唐瓔. 西北酸菜高效復合發酵菌種的篩選[J]. 食品科學, 2011(11): 222-227

[9] 衛玲玲, 應鐵進, 陳延, 等. 甘藍泡菜發酵菌種的復配研究[J]. 中國食品學報, 2012(8): 93-97.

[10] 張良, 向文良, 曾澤生, 等. 四川泡菜乳酸發酵菌劑的研究[J]. 食品科學, 2013(19): 200-206.

[11] 朱隆繪, 王修俊. 自然發酵辣椒中天然微生物的分離與鑒定[J]. 中國調味品, 2013, 38(2): 30-33.

[12] 燕平梅, 陳燕飛, 趙文婧, 等. 蔬菜發酵菌種的篩選及發酵特性[J]. 食品科學, 2015(3): 99-103.

[13] 胡博涵, 吳暉, 賴富饒, 等. 耐鹽乳酸菌的篩選及其在剁辣椒發酵中的應用[J]. 食品與機械, 2014, 30(1): 51-54, 70.

Preparation of complex microbial inoculants of fermented chilli’s Direct Vat Set (DVS)

SHEN Chang-xuan WANG Xiu-jun ZHU Long-hui HUANG Shan

(1.GuizhouProvincialKeyLaboratoryofFermentationEngineeringandBiopharmacy,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China; 2.SchoolofLiquorandFoodEngineering,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

For developing complex microbial inoculants of fermented chilli and improving production efficiency of fermented industry, the ability of produce acid, acid fastness, salt tolerance and safety of bacterial strains which were separated and identified from natural fermented chilli were determined. AndLactobacillusplantarum,Lactococcuslactis,Bacillussubtiliswere chosen to be alternatives for complex microbial inoculants. The best formula, obtained by experiment of inoculating ratios and majorization of ferment’s condition, were: the proportion ofvolumeofLactobacillusplantarum∶Lactococcuslactis∶Bacillussubtilis=1∶4∶1, the quantity of inoculation 6%, the time of fermentation 66 h, the concentration of salt 4%. It was showed that the inoculating ratio had significant influence on the production of acid content of complex microbial inoculants among the four factors. Under this condition, the fermented chilli’s yield of acid was 0.77%, and sensory evaluation score was 17.525.

fermented chilli; DVS complex microbial inoculants; combination of microbial strain; ability of ferment

貴州省農業攻關項目(編號：黔科合NY字[2012]3018號)；貴州省農業攻關項目(編號：黔科合NY字[2015]3025-1號)

沈暢萱，女，貴州大學在讀碩士研究生。

王修俊(1965—)，男，貴州大學教授。 E-mail：775298123@qq.com

2017—03—16

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.06.040