土沉香根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的病原鑒定

蘇圣淞, 周?chē)?guó)英, 李 河, 王 姣, 何苑皞, 劉君昂

(中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中南林業(yè)科技大學(xué)森林有害生物防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長(zhǎng)沙 410004)

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土沉香根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的病原鑒定

蘇圣淞, 周?chē)?guó)英*, 李 河, 王 姣, 何苑皞, 劉君昂

(中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中南林業(yè)科技大學(xué)森林有害生物防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長(zhǎng)沙 410004)

本研究對(duì)海南省澄邁縣土沉香根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病危害與發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)查與研究,并采用比較形態(tài)學(xué)結(jié)合rDNA-ITS序列分析的方法對(duì)病原進(jìn)行了分離鑒定,確定了發(fā)生在澄邁縣土沉香苗木上的根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)為象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)MeloidogyneenterolobiiYang & Eisenback。這是首次報(bào)道海南省澄邁地區(qū)土沉香上發(fā)生象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng),為進(jìn)一步分析土沉香病原根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)種群及該病的防治研究奠定了基礎(chǔ)。

土沉香; 象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng); rDNA-ITS

土沉香Aquilariasinensis,亦稱(chēng)白木香,俗稱(chēng)女兒香、莞香,屬瑞香科Thymelaeaceae沉香屬Aquilariaspp.,其木材因飽含樹(shù)脂而質(zhì)量大,遇水即沉,且芳香之極。土沉香是我國(guó)特有的珍貴樹(shù)種,也是生產(chǎn)中藥沉香的唯一植物資源[1],現(xiàn)已被列為國(guó)家珍稀瀕危三級(jí)保護(hù)植物[2]及國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物[3]。土沉香主要分布于我國(guó)華南地區(qū),以海南、廣東、云南、福建、廣西、臺(tái)灣等省區(qū)為主,其中海南種植面積最廣,已成為我國(guó)沉香的代表性產(chǎn)區(qū)[4]。土沉香的人工種植在海南已經(jīng)十余年,種植面積已超過(guò)2 000 hm2,遍布海南省各個(gè)市縣。

2013年在海南省19個(gè)市(縣)對(duì)包括土沉香在內(nèi)的10個(gè)鄉(xiāng)土樹(shù)種的主要病蟲(chóng)害進(jìn)行了調(diào)查,結(jié)果表明海口、屯昌、五指山、定安、東方、澄邁、保亭、萬(wàn)寧、昌江、三亞等地的土沉香均受到根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的危害而呈現(xiàn)植株長(zhǎng)勢(shì)差、葉片失綠黃化、易感葉部病害等癥狀,尤其是部分苗圃基地的苗木感病嚴(yán)重,死亡率極高,達(dá)40%～60%。

我們?cè)谡{(diào)查土沉香根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)發(fā)生情況的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對(duì)土沉香病原根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行分離、鑒定。通過(guò)對(duì)澄邁縣主要土沉香育苗基地受根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的危害情況調(diào)查及其病原根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的分離鑒定,對(duì)土沉香苗木根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的發(fā)病癥狀進(jìn)行了較為詳細(xì)的闡述,并確定了澄邁地區(qū)一種新的土沉香病原根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)。

1 材料與方法

1.1 材料

病株樣品:在海南省澄邁地區(qū)主要土沉香育苗基地(以海南國(guó)營(yíng)澄邁林場(chǎng)為主)采集染病袋裝苗連同基質(zhì)一起放入封口袋內(nèi),做好標(biāo)記帶回實(shí)驗(yàn)室。

供試番茄苗:市場(chǎng)采購(gòu)的普通櫻桃番茄種子,在滅菌土中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 土沉香根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的調(diào)查及供試蟲(chóng)源準(zhǔn)備

在海南省澄邁縣土沉香主要育苗基地對(duì)土沉香苗木根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的發(fā)生情況展開(kāi)調(diào)查。在顯微鏡下從采集的染病袋裝苗上挑取單卵塊接種在滅菌土中,將剛長(zhǎng)出兩片真葉的番茄幼苗移入接種土中培養(yǎng),進(jìn)行種群純化培養(yǎng)與活體保存[5]。

1.2.2 土沉香根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的獲得

雌蟲(chóng)的分離與收集:經(jīng)單卵塊接種后的番茄苗培養(yǎng)40 d后,取侵染的番茄根用清水洗凈,在體視顯微鏡下用鑷子或解剖針針尖將根結(jié)表皮輕輕挑開(kāi),剖面出現(xiàn)的乳白色的光滑梨形物即為根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的雌蟲(chóng),用解剖針輕輕撥出,放入水中待用。

2齡幼蟲(chóng)的收集:2齡幼蟲(chóng)由單卵塊孵化獲得,參照王曦茁等的方法[6]。

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察

雌成蟲(chóng)與2齡幼蟲(chóng)的主要形態(tài)特征觀察:包括雌成蟲(chóng)頭部、口針特征等;2齡幼蟲(chóng)頭部、尾部特征等。分別測(cè)量20條成蟲(chóng)與2齡幼蟲(chóng)的體長(zhǎng)、最大體寬、口針長(zhǎng)和DEGO(背食道腺開(kāi)口至口針基部球的距離)等形態(tài)指標(biāo)。

雌成蟲(chóng)會(huì)陰花紋的制作與觀察:參照張紹升的方法[7],從新鮮的染病番茄根組織挑取成熟雌蟲(chóng),置于滴有40%乳酸溶液的載玻片上,在體視顯微鏡下,用解剖針和雙面刀切取下尾端(蟲(chóng)體后部約1/4處),將尾端的體內(nèi)組織用發(fā)針去掉,并切除尾端表皮多余部分,把會(huì)陰花紋部分轉(zhuǎn)移至滴有純甘油的載玻片上展平,制成臨時(shí)玻片在顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定

根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)DNA提取,參照王曦茁等[6]與章淑玲等[8]的方法,稍作修改:配制線(xiàn)蟲(chóng)裂解液(10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0,1 mmol/L EDTA pH 8.0, 0.25 mmol/L NaCl pH 8.0, 1% SDS),5℃保藏,待用。在體視顯微鏡下挑取單條成熟雌成蟲(chóng),置于滴有無(wú)菌水的載玻片上,用無(wú)菌水沖洗3次后,轉(zhuǎn)移至滅菌的1.5 mL離心管中,加入10 μL無(wú)菌水,4 μL預(yù)冷的裂解液,用滅菌解剖針將雌蟲(chóng)刺破,加入2 μL的1 mg/mL 蛋白酶K(天根公司),并迅速放入-20℃冰箱中過(guò)夜。然后置于65℃水浴鍋中1 h,95℃水浴10 min使蛋白酶變性,最后以12 000 r/min離心2 min,取其上清用于PCR擴(kuò)增或于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

基因選擇及目的片段擴(kuò)增與測(cè)序:參照王曦茁等[6]、Shi 等[9]的研究結(jié)果,對(duì)所分離篩選獲得的根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng),選擇核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序,PCR擴(kuò)增引物為 V5367: 5′-TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT-3′和26S: 5′-TTT CAC TCG CCG TTA CTA AGG-3′[9],由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)體系及條件參見(jiàn)王曦茁等的方法[6]。PCR產(chǎn)物委托上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

ITS基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建:將本試驗(yàn)分離的根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)ITS序列(編號(hào)為HN150805),與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)ITS序列進(jìn)行比對(duì)分析,分別選取南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)M.incognitaITS序列(KP751204、KP179223),北方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)M.haplaITS序列(LC030362、LC030358),花生根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)M.arenariaITS序列(LC03035、LC030356),爪哇根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)M.javanicaITS序列(AF387094、AY829375),西班牙根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)M.hispanicaITS序列(EU443614、EU443612),象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)ITS序列(KT354573、KP411227、KJ146863、KF418369),以秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)Caenorhabditiselegans(X03680)的ITS序列作為外群,共16個(gè)序列,采用MEGA 5.1軟件通過(guò)鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),以自展法(bootstrap)進(jìn)行1 000次循環(huán)檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土沉香根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)發(fā)病癥狀

調(diào)查發(fā)現(xiàn)澄邁縣的部分土沉香育苗基地的土沉香1年生小苗或2年生大袋苗出現(xiàn)植株矮小,葉片黃化失綠,生長(zhǎng)緩慢,甚至植株枯死的現(xiàn)象,且罹病苗木易患其他葉部病害,嚴(yán)重苗圃死亡率達(dá)40%～60%。受害土沉香苗木根部會(huì)形成許多大小形狀不定、表面粗糙的根結(jié),有的連接成塊,隨著病情的加重,根部壞死表現(xiàn)為疏松多孔,大部分2年生的罹病大袋苗的根頸部會(huì)形成畸形的瘤塊,有的瘤塊處的直徑是正常處2倍多,表皮縱裂。取根結(jié)在體視顯微鏡下切開(kāi)能看見(jiàn)白色梨形雌蟲(chóng),或取受害土沉香苗土用貝曼漏斗處理約24 h,鏡檢會(huì)觀察到大量線(xiàn)形幼蟲(chóng)或雄蟲(chóng)。

圖1 土沉香苗木根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)危害狀Fig.1 Symptoms of damage by root-knot nematode in Aquilaria sinensis seedlings

圖2 土沉香根部罹病壞死Fig.2 Necrosis of the susceptible Aquilaria sinensis root

圖3 土沉香病原根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)感染的番茄幼苗Fig.3 Tomato seedlings infected by root-knot nematodes collected from Aquilaria sinensis seedlings

2.2 形態(tài)學(xué)特征

雌蟲(chóng):乳白色,呈梨形,頸明顯突出,頭區(qū)無(wú)環(huán)紋,唇盤(pán)圓盤(pán)狀,略突起,口針細(xì)長(zhǎng),基部球粗大,椎體部與桿部等長(zhǎng)。

2齡幼蟲(chóng):蠕蟲(chóng)形,體環(huán)清晰,頭區(qū)略縊縮,口針細(xì)長(zhǎng),基部球大而圓,體部與桿部分界明顯,尾部透明區(qū)明顯,尾尖鈍圓。

會(huì)陰花紋:為近圓的六邊形至卵圓形,線(xiàn)紋較緊密,呈波浪形,連續(xù)或間斷,背弓較高,側(cè)線(xiàn)不明顯,尾端區(qū)通常有刻點(diǎn)。

表1 土沉香象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)雌蟲(chóng)和2齡幼蟲(chóng)的測(cè)量值1)

Table 1 Measurement of female and second-stage juvenile ofMeloidogyneenterolobiionAquilariasinensis

蟲(chóng)態(tài)Stage體長(zhǎng)/μmBodylength體寬/μmBodywidth口針/μmStyletDEGO/μm尾長(zhǎng)/μmTaillength雌蟲(chóng)Female(n=20)764.3(637.6～823.5)635.2(512.6～756.3)15.7(14.3～17.5)5.2(4.4～6.0)-2齡幼蟲(chóng)Second-stagejuvenile(n=20)458.3(427.8～484.1)15.4(14.3～16.7)12.4(11.2～13.6)4.3(3.1～5.1)53.5(44.3～57.6)

2.3 分子生物學(xué)特征

利用通用引物V5367和26S對(duì)樣品HN150805的rDNA-ITS區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增,得到約750 bp的片段,經(jīng)雙向測(cè)序及拼接得到694 bp,通過(guò)BLAST比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)該序列(NCBI序列號(hào)為KU321697)與象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)(KT354573、KP411227、KJ146863、KF418369)完全相同。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示樣品HN150805,與象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)位于同一分支,支持率為100%。

圖5 根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)不同種群ITS序列的聚類(lèi)分析(NJ)Fig.5 NJ tree of 16 Meloidogyne isolates based on ITS sequences of Meloidogyne enterolobii

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)海南省澄邁縣土沉香主要育苗基地的土沉香苗木感染根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的情況進(jìn)行了調(diào)查,發(fā)現(xiàn)這些地區(qū)的土沉香苗圃均受到根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)不同程度的危害,試驗(yàn)對(duì)土沉香苗木患根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的癥狀作了較為詳細(xì)的描述,對(duì)土沉香苗木根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的診斷與防治有一定的指導(dǎo)意義。在此基礎(chǔ)上本研究運(yùn)用形態(tài)學(xué)結(jié)合rDNA-ITS序列分析的方法,將采自澄邁縣罹病土沉香苗木上的線(xiàn)蟲(chóng)鑒定為象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng),為該病原線(xiàn)蟲(chóng)的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

1994年吳影梅等[10]認(rèn)為廣東、海南兩省的白木香病原根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)有南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)和爪哇根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)兩種;2011年,許天委等[11]認(rèn)為海南省白木香受到南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)、爪哇根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)、花生根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)等3種病原線(xiàn)蟲(chóng)的危害。均認(rèn)為海南省的土沉香根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)是復(fù)合侵染型,而本研究?jī)H鑒定出象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)1種病原。我們認(rèn)為這樣的結(jié)果并不矛盾,本試驗(yàn)在之前形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上結(jié)合了分子生物學(xué)特征的分析,試驗(yàn)結(jié)果具有更高的準(zhǔn)確性;且有報(bào)道稱(chēng)象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)已成為海南省蔬菜作物上一個(gè)主要的根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病原種,在海南全島普遍發(fā)生[12-13]。本試驗(yàn)之所以只鑒定出1個(gè)病原種,可能是因?yàn)橄蠖垢Y(jié)線(xiàn)蟲(chóng)已成為該地區(qū)土沉香的優(yōu)勢(shì)病原根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng),在挑取卵塊于番茄上純化分離時(shí),挑取的恰好是象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)卵塊。在此基礎(chǔ)上,我們已開(kāi)展了土沉香病原根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)種群結(jié)構(gòu)分析研究與生物防治研究。

象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)于1983年由Yang和Eisenback[14]在中國(guó)海南島的青皮象耳豆樹(shù)Enterolobiumcontortisiliquum(Vell.) Morong根部首次發(fā)現(xiàn)并描述,定名為M.enterolobii;Rammah和Hirschmann[15]于1988年在波多黎各島從一種茄子SolanummelongenaL.上分離并描述,定名為M.mayaguensis。2004年,Brito等[16]在佛羅里達(dá)州分離的4個(gè)M.mayaguensis隔離種群的形態(tài)特征與1983年Yang & Eisenback 描述的象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)一致。2012年,Karssen 和Liao[17]對(duì)Rammah和Hirschmann 描述的M.mayaguensis與Yang 和Eisenback描述的M.enterolobii的雌蟲(chóng)、雄蟲(chóng)、2齡幼蟲(chóng)的形態(tài)特征進(jìn)行了全面、詳細(xì)的比較,揭示了這兩個(gè)原種描述上的差異,并最終確定此二者為同物異名,M.mayaguensis是次異名,統(tǒng)一使用M.enterolobii作為象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的拉丁文名。

象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)作為一種多寄主的病原根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng),具有強(qiáng)致病力而且還能克服線(xiàn)蟲(chóng)Mi抗性基因[18],對(duì)農(nóng)作物造成毀滅性的危害。自1983首次在青皮象耳豆樹(shù)上發(fā)現(xiàn)以后,其寄主范圍與發(fā)生地區(qū)以極快的速度不斷擴(kuò)大[19-22],尤其在福建[23]、海南和廣東[13,24]等熱帶、亞熱帶地區(qū),該線(xiàn)蟲(chóng)無(wú)越冬現(xiàn)象,常年危害作物,已成為熱帶和亞熱帶地區(qū)最重要的根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)之一。歐洲和地中海植物保護(hù)組織發(fā)布的資料顯示[25],除中國(guó)以外,四大洲的亞熱帶地區(qū)也有象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)發(fā)生,且其寄主包括大豆、咖啡、棉花、煙草等在內(nèi)的許多世界性農(nóng)作物與經(jīng)濟(jì)作物,EPPO已將其列為檢疫性線(xiàn)蟲(chóng)。

本研究詳細(xì)闡述了土沉香根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的發(fā)生癥狀,對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐中土沉香根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的識(shí)別與診斷有一定的參考價(jià)值。同時(shí)首次確認(rèn)了海南省澄邁地區(qū)土沉香的病原根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)是象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng),為土沉香根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的進(jìn)一步研究與防治提供了新的依據(jù)。鑒于土沉香根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的嚴(yán)重危害性,在明確其病原的基礎(chǔ)上,高效無(wú)公害的治療措施以及可持續(xù)的控制方法研究將是未來(lái)防治土沉香根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病乃至象耳豆根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的關(guān)鍵。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Identification of root-knot nematodeMeloidogyneenterolobiifromAquilariasinensisin Hainan Province

Su Shengsong, Zhou Guoying, Li He, Wang Jiao, He Yuanhao, Liu Jun’ang

(KeyLaboratoryforNon-woodForestCultivationandConservationofMinistryofEducation,HunanProvincialKeyLaboratoryforControlofForestDiseasesandPests,CollegeofForestry,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha410004,China)

The nematode species onAquilariasinensisin Chengmai County, Hainan Province was identified by morphological observation and rDNA-ITS sequence analysis. The results showed that the root-knot nematode occurred commonly onA.sinensiswasMeloidogyneenterolobiiYang & Eisenback. This is the first report ofM.enterolobiionA.sinensisin Hainan Province, which will be helpful to control the root-knot nematode ofA.sinensis.

Aquilariasinensis;Meloidogyneenterolobii; rDNA-ITS

2016-09-05

2016-09-21

林業(yè)公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201304402)

S 435.671

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.033

* 通信作者 E-mail:gyzhou2118@163.com