紫外/超聲協同滅活隱孢子蟲的影響因素及機制

李紹峰, 徐宏平,, 冉治霖, 張可方, 張朝升

1.深圳職業技術學院, 深圳市工業節水及城市污水資源化技術重點實驗室, 廣東 深圳 518055 2.廣州大學土木工程學院， 廣東 廣州 510006 3.深圳信息職業技術學院交通與環境學院， 廣東 深圳 518172

紫外/超聲協同滅活隱孢子蟲的影響因素及機制

李紹峰1, 徐宏平1,2, 冉治霖3, 張可方2, 張朝升2

1.深圳職業技術學院, 深圳市工業節水及城市污水資源化技術重點實驗室, 廣東 深圳 518055 2.廣州大學土木工程學院， 廣東 廣州 510006 3.深圳信息職業技術學院交通與環境學院， 廣東 深圳 518172

為研究UVUS(UltravioletUltrasonic, 紫外超聲)協同對水中隱孢子蟲的滅活機制，采用UV燈(功率為14 W)與US發生器(頻率為20 kHz，功率為150 W)組合裝置協同滅活隱孢子蟲，考察pH、溫度、濁度和HA(腐殖酸)對UVUS協同滅活隱孢子蟲的影響，并通過SEM(掃描電鏡)、蛋白質試驗和瓊脂糖凝膠電泳檢測對滅活機制進行了探討. 結果表明：pH對UVUS殺滅隱孢子蟲的影響不大，堿性條件下滅活率略高于中性和酸性條件；溫度對滅活率有一定影響，5 ℃下滅活率較低，隨溫度的上升，滅活率逐漸提高，25 ℃下10 min滅活率可達99%以上；懸浮物抑制隱孢子蟲的滅活，濁度為40 NTU時,UVUS作用25 min的滅活率僅為93.88%；HA對滅活的影響表現為低濃度促進,高濃度抑制;ρ(HA)高于10 mgL時，繼續增大ρ(HA)對隱孢子蟲滅活率影響不大. 研究顯示: UVUS協同作用對隱孢子蟲的滅活機制主要是使其卵囊破裂，同時損傷了隱孢子蟲胞內的DNA.

隱孢子蟲； 超聲； 紫外； 影響因素； 滅活機制

隱孢子蟲是一種可寄生于人與動物體腸道的寄生蟲，屬原蟲類病原體，可通過食物、水源和動物傳播來感染宿主，呈全球性分布，并且常引起隱孢子蟲病群體性暴發事件[1- 3]. 人對隱孢子蟲病普遍易感，患者易產生腹痛、反胃、痙攣等多種不良癥狀[4- 5]. 隱孢子病威脅公眾健康，甚至影響經濟發展，受到全球的關注，因此研究隱孢子蟲對臨床和公共衛生以及維護社會穩定都有重大意義[6].

多數隱孢子蟲卵囊屬厚壁型卵囊，傳統的氯系水處理消毒劑(如液氯、二氧化氯、氯胺等)對其作用效果不佳[7]，大劑量殺菌劑的加入還會引起致癌性消毒副產物的生成，影響水質安全與衛生. UV(Ultraviolet，紫外)光作為目前在各水廠尤其是城市污水處理廠廣泛應用的消毒方法，對細菌、病毒及微藻有著良好的殺滅效果[8- 12]，消毒過程無副產物，而且污染物遺傳特性不增強[13]. 另外也有研究[14- 18]表明，UV可以用于滅活隱孢子蟲，但所需滅活時間較長，單一UV滅活并不經濟. 而US(Ultrasonic，超聲)技術在滅活領域的高效性及具有不產生消毒副產物的優點，被認為是一項新的有效消毒方法[19- 20]，但也存在著滅活耗能高等缺點[21]. 有研究利用US作為UV消毒前預處理進行污水處理，借助US破碎水中大顆粒懸浮物，使微生物失去依附，從而更易被UV殺滅，增強了UV消毒效果[22].

該研究根據UV和US各自不同作用特點和機制，以UV燈與US發生器組合裝置協同滅活隱孢子蟲，考察pH、溫度、濁度、有機物等因素對UVUS滅活隱孢子蟲的影響，同時利用掃描電鏡觀察、蛋白質試驗和瓊脂糖凝膠電泳成像來對UVUS滅活隱孢子蟲的機理進行探討，以期為UVUS技術用于兩蟲的滅活提供依據.

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

試驗裝置如圖1所示. US發生器為150 W、20 kHz；低壓UV燈為美國KADINDUV燈管，功率14 W，型號GPH287T5L；置有含隱孢子蟲卵囊原水的玻璃管，直徑4 cm；水槽及暗箱(外部封有錫紙)均為PVC材料.

將100 mL濃度為2×104mL-1的蟲樣置于反應裝置中，控制溫度為(22±1)℃，pH為7.0±0.2. US發生器選用150 W、20 kHz，與UV聯合作用25 min，分別在1、3、5、10、15、20和25 min時用1.5 mL離心管取樣1 mL進行活性檢測或相關試驗.

注：1—US反應器；2—進水口；3—US傳感器；4—反應器；5—水浴槽；6—出水口；7—UV燈.圖1 UVUS反應裝置Fig.1 Experiment apparatus of ultraviolet synergistic ultrasonic

1.2 試驗材料

所用隱孢子蟲(Cryptosporidium)卵囊為C.baileyi.HauC株，提取自患隱孢子蟲病雞的排泄物. 蟲樣低溫(4 ℃)存放于2.5%重鉻酸鉀懸浮液中. PI(普匹碘胺)、DAPI(4,6-二脒基- 2-苯基-吲哚)及Hanks 平衡鹽溶液均為美國Sigma產品.

1.3 分析方法

1.3.1 熒光活性染色法

隱孢子蟲活性檢測采用熒光活體染色法[23]. 取1 mL樣品于4 ℃、10 000 rmin下離心5 min，用Hanks平衡鹽溶液清洗3次；棄上清液至200 μL，加100 μL DAPI、100 μL PI使用液，37 ℃避光水浴1 h. 再用平衡溶液清洗3次，將樣品中多余的DAPI與PI洗凈. 涂片后在400倍熒光顯微鏡(OLYMPUS，BX- 51)下鏡檢，滅活率(η)計算公式：

式中：DAPI+為細胞壁外側呈淡藍色，細胞內部未被染色的隱孢子蟲個數；DAPI-為細胞壁外側和細胞內部均未染上淡藍色的隱孢子蟲個數；PI+為細胞核被染色紅色的隱孢子蟲個數；PI-為細胞內部未被染色，細胞壁也未被染成紅色的隱孢子蟲個數.

其中，“兩蟲”檢測數量≥300個.

1.3.2 掃描電鏡(SEM)

利用型號為S4700的掃描電鏡(HITACHI, Japan)進行形態學觀察. 采用2.5%的戊二醛固定樣品后，用50%、75%、90%、100%的乙醇進行多次脫水，再分別用1∶1(體積比)的100%乙醇與醋酸異戊酯混合液進行置換，置換后的樣品用針頭或槍頭挑出，放入稱量紙疊成的小盒中干燥12 h. 最后使用離子濺射鍍膜儀噴金.

1.3.3 體系溶解蛋白的檢測

采用超微量分光光度計Nanodrop 2000(Thermo)檢測體系中ρ(溶解蛋白). 蛋白質分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基使其在280 nm處具有UV吸收，吸光度與ρ(溶解蛋白)成正比[24].

1.3.4 基因組DNA檢測

純化后的隱孢子蟲卵囊樣品經液氮凍融3次，分別加入270 μL的裂解緩沖液和30 μL、20 mgmL的蛋白酶K，期間多次混勻并消化，55 ℃水浴12 h. 再加等體積CHCl3混勻離心(10 000 rmin)10 min，取上清液至另一離心管中，加入0.7倍體積的異丙醇沉淀20 min，離心10 min，去上清液后用70%的乙醇洗滌，再離心并去上清液一次，將沉淀物干燥10 min，用50 μL TE溶液(pH8.0)進行溶解，加入1 μL RNase A(10 mgmL)消化RNA，作用時間10 min，電泳檢測結果.

2 結果與討論

控制溫度為(22±1)℃，濁度為1 NTU條件下，考察pH分別為5、6、7、8和9對UVUS滅活隱孢子蟲的影響. 由圖2可見，隨pH的增加，滅活率有所提高. pH分別為5、7和9時，UVUS作用15 min的滅活率分別為93.33%、94.87%和95.45%. 在滅活時間為25 min時，不同pH下的滅活率均達到了99.99%. 堿性條件下滅活率略高于中性和酸性條件，但總體而言pH對USUV滅活隱孢子蟲的影響不大.

pH：1—5；2—6；3—7；4—8；5—9.圖2 pH對UVUS滅活隱孢子蟲的影響Fig.2 Influence of pH on inactivation of Cryptosporidium under UV US

溫度℃：1—5；2—15；3—25；4—35.圖3 溫度對UVUS滅活隱孢子蟲的影響Fig.3 Influence of temprature on inactivation of Cryptosporidium parvum under UVUS

在pH為7，濁度1 NTU條件下，考察溫度分別為5、10、15、20和25 ℃時USUV滅活隱孢子蟲的情況. 由圖3可見，在溫度為5和15 ℃時，作用時間為10 min時滅活率分別為81.82%和88.37%；當溫度升至25 ℃時，滅活率增至92.86%，說明溫度高，有利于滅活. 在35 ℃下滅活率達到90%以上所需時間少于10 min，而5 ℃條件下滅活率達到90%以上則需作用20 min. 這主要是因為溫度升高會導致空化泡的閥域值降低，空化泡更易發生[25- 26]，另一方面，在較低溫度下尚有部分隱孢子蟲處于休眠狀態，代謝率低，不易被殺滅.

濁度NTU：1—1；2—4；3—15；4—25；5—40.圖4 濁度對UVUS滅活隱孢子蟲的影響Fig.4 Effect of turbidity on inactivating Cryptosporidium under UVUS

pH為7、溫度為(22±1)℃條件下，考察不同濁度(1、4、15、25和40 NTU)下USUV對隱孢子蟲的的滅活率. 由圖4可見，當濁度為1 NTU時，15 min的滅活率為95.07%. 研究[27]表明，控制溫度為(20±1)℃, 僅US(151 W、19.8 kHz)作用15 min，濁度為0與1.13 NTU(此時滅活率最高)時隱孢子蟲的滅活率分別為92.5%、94.7%. 忽略溫度微弱差異的影響，對比可見UVUS滅活率高于US滅活率. 濁度為4和15 NTU時，要使隱孢子蟲滅活率達到95%以上所需的滅活時間分別為20和25 min. 在濁度為40 NTU時，UVUS作用25 min后的滅活率僅為93.88%. 究其原因，①低濁度時溶液中的微粒會造成空化作用，產生的氣泡發生不對稱潰陷，變為更多更微小的氣泡，增強了空化作用的強度[28- 29]；②濁度過大時溶液中的懸浮物吸收了聲波和UV光輻照的能量[30]，導致了隱孢子蟲滅活率下降.

HA(Humic Acid，腐殖酸)是一種廣泛存在的天然高分子有機物，以HA為代表有機物考察其對USUV 滅活隱孢子蟲的影響. 溫度為(22±1)℃，濁度為1 NTU時，不同ρ(HA)(0.5、1、2、5、10、20和50 mgL)下隱孢子蟲滅活率見圖5. 試驗中不對水樣的pH調節以免緩沖溶液對試驗結果造成干擾. 由圖5可見，同一作用時間下，隱孢子蟲滅活率隨ρ(HA)的增加先升再降. 在ρ(HA)為0～1 mgL時，滅活率逐漸上升，并且ρ(HA)為1 mgL條件下(滅活時間25 min)隱孢子蟲滅活率為99.99%.ρ(HA)高于2 mgL時，繼續增大ρ(HA)，隱孢子蟲滅活率開始下降，在ρ(HA)達到50 mgL時，滅活率降至90.91%.

作用時間min：1—5；2—10；3—20；4—25.圖5 ρ(HA)對UVUS滅活隱孢子蟲的影響Fig.5 Effect of HA on inactivating Cryptosporidium under UVUS

研究[27]顯示，ρ(HA)為50.0 mgL時US作用15 min滅活率為78.4%，顯然USUV作用效果優于單獨US. 在ρ(HA)大于10 mgL時，滅活率下降不多，即此時再增大ρ(HA)，對隱孢子蟲滅活率影響不大，說明有機物對UVUS滅活隱孢子蟲的影響存在一個飽和閾值. HA對隱孢子蟲滅活率影響的原因可能是低質量濃度(小于1 mgL)的HA促進了US的空化作用，高質量濃度的HA則主要表現為與隱孢子蟲形成競爭關系，造成隱孢子蟲滅活率下降. 同時HA是UV線的強吸收體，吸收了部分UV光的能量，削弱了對隱孢子的滅活效果.

UV照射細菌后，其體內DNA分子上的兩個相鄰的胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)之間會形成胸腺嘧啶二聚體(CPDs)，該結構的形成是核酸的功能受到損傷和破壞，微生物死亡的主要原因[31- 32]. 但由于微生物自身的修復機制使處理水中的細菌及病原體產生光復活，導致實際工程中微生物指標不能達到要求. US對生物體的表面結構有所破壞，其機械作用能夠改變水中顆粒污染物的粒徑組成；US的空化作用所產生的高速微射流的機械剪切作用與自由基的氧化作用，能夠破壞微生物的細胞壁、細胞膜，從而使細胞質流出，使細胞酶及轉運系統受到破壞[27,33]. US的協同能夠在一定程度上對光復合現象產生抑制效果. 該研究通過掃描電鏡觀察、蛋白質試驗以及瓊脂糖凝膠電泳檢測探究UVUS對隱孢子蟲的表面結構和核酸(主要DNA)的破壞或損傷.

2.5.1ρ(溶解蛋白)及隱孢子蟲細胞形態變化

采用US發生器(150 W、20 kHz)耦合低壓UV燈(功率14 W，波長范圍為254 nm)，在pH為7、濁度為1 NTU、溫度為(22±1)℃的條件下，對濃度為2×104mL-1的隱孢子蟲懸浮液分別滅活1、5、15和25 min. 利用超微量分光光度計，檢測滅活體系中ρ(溶解蛋白)的變化，結果如圖6所示. 由圖6可見，UVUS作用5 min，體系中ρ(溶解蛋白)由0.357 mgmL 增至0.538 mgmL，5 min后ρ(溶解蛋白)的增加趨緩；UVUS作用時間增至25 min，體系中ρ(溶解蛋白)達到最大值(0.615 mgmL).

圖6 UVUS滅活隱孢子蟲體系ρ(溶解蛋白)的變化Fig.6 SEM photos and protein concentraion of Cryptosporidium inactivated by UVUS

圖7 UVUS滅活隱孢子蟲細胞形態變化Fig.7 SEM photos of Cryptosporidium inactivated by UVUS

通過SEM(掃描電鏡)10 000倍下對隱孢子蟲細胞形態結構的變化進行觀察，結果如圖7所示. 由圖7可見，UVUS作用5 min，體系中大部分隱孢子蟲已經外壁破裂死亡，囊內的可溶性蛋白流出溶解；而5 min 后，只有少部分抗性強的厚壁卵囊破壁流出蛋白；UVUS作用時間由1 min增至25 min，隱孢子蟲細胞結構和表面形態發生很大的變化，外壁先發生局部的裂隙然后到卵囊整體裂解，過程完整，最后導致蟲體死亡，這與體系中ρ(溶解蛋白)變化規律相一致.

2.5.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測

圖8 UVUS處理前后隱孢子蟲基因組DNA電泳圖譜Fig.8 Agarose gelelectrophoresis of Cryptosporidium genomic DNA by UVUS

3 結論

b) HA對耦合作用下的滅活是低濃度時促進，高濃度抑制，并且ρ(HA)高于10 mgL時，繼續增大ρ(HA)對隱孢子蟲滅活率影響不大.

c) 通過掃描電鏡(SEM)觀察、蛋白質試驗和瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，UVUS滅活隱孢子蟲的機制為US使隱孢子蟲卵囊破裂，細胞質流出死亡，UV同時損傷隱孢子蟲的DNA.

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Ultraviolet / Ultrasound Coordination for InactivatingCryptosporidiumparvum

LI Shaofeng1, XU Hongping1,2, RAN Zhilin3, ZHANG Kefang2, ZHANG Chaosheng2

1.Shenzhen Key Laboratory of Industrial Water Saving and Municipal Sewage Reclamation Technology, Shenzhen Polytechnic Institute, Shenzhen 518055, China 2.School of Civil Engineering, Guangzhou University, Guangzhou 510006, China 3.Department of Transportation and Environment, Shenzhen Institute of Information Technology, Shenzhen 518172, China

UV was coupled with US for inactivatingCryptosporidiumparvumin water, and the effects of pH, temperature, turbidity and humic acid (HA) were investigated. Furthermore, the inactivation mechanism was investigated by scanning electron microscopy, agarose gel electrophoresis and protein test detection. The results showed that pH had little discussed on the USUV inactivatingC.parvum. The inactivation rate at 5 ℃ was fairly low, and at 25 ℃ it required 20 min to achieve more than 99% inactivation rate. Suspended matter inhibited the inactivation rate under the coupling action; when turbidity was 40NTU, the inactivation rate of UVUS in 25 min was only 93.9%. The inactivation effect of coupling was promoted by HA at low concentration and inhibited by high content. When the dosage of HA was higher than 10 mgL, increasing the concentration of HA had little effect on theC.parvuminactivation rate. By scanning electron microscopy (SEM) observations, protein test and agarose gel electrophoresis, it was determined that UVUS madeC.parvumoocysts burst, whileCryptosporidium′s DNA was also damaged.

Cryptosporidiumparvum; ultrasound; ultraviolet; effect factors; inactivating mechanism

2016-09-24

2017-04-22

廣東省自然科學基金項目(2014A030313951)；廣東省千百十培養計劃項目；深圳市科技計劃項目(JCYJ20160226092135176)

李紹峰(1972-)，男，湖南邵東人，教授，博士，主要從事水污染控制及污水資源化技術研究，lshaofeng@szpt.edu.cn.

X703.1

1001- 6929(2017)08- 1310- 06

A

10.13198j.issn.1001- 6929.2017.02.55

李紹峰,徐宏平,冉治霖,等.紫外/超聲協同滅活隱孢子蟲的影響因素及機制[J].環境科學研究,2017,30(8):1310- 1315.

LI Shaofeng,XU Hongping,RAN Zhilin,etal.Ultraviolet/Ultrasound coordination for inactivatingCryptosporidiumparvum[J].Research of Environmental Sciences,2017,30(8):1310- 1315.