一次性系統溶出物/析出物驗證方法

文/ 彭瑛，唐燕，石茜茹，邢春秀，楊曉慧，李小香

實驗與分析

一次性系統溶出物/析出物驗證方法

文/ 彭瑛，唐燕，石茜茹，邢春秀，楊曉慧，李小香

溶出物/析出物評估是制藥領域中過濾器和一次性系統工藝特定驗證的重要組成部分——以考察設備（包括過濾器和一次性系統）在特定工藝中的適用性。本文針對溶出物/析出物的驗證試驗，闡述了溶出物/析出物的分析方法選擇、分析方法的開發確認，同時介紹了溶出物/析出物試驗，為制藥領域過濾器和一次性系統用戶提供參考。

在制藥領域，采用一次性系統（Single Use Technology，SUT）有助于快速建立生產線、節約投資成本、靈活調整工藝以適用于不同產品的生產，同時可以避免交叉污染、減少清洗投入，為終端用戶提供了很大便利，因此一次性系統在制藥工業中的應用日趨廣泛[1]。出于藥品質量、效能和安全的考慮，對可能引入藥物制劑中的雜質進行研究不僅非常重要，而且十分必要。對此，國內外的法規和行業機構都有類似要求[2,3]：“…與料液接觸的表面不得因與產品發生反應、釋放物質或吸附作用而對產品質量造成不利影響…”[4]，溶出物（Extractables）/析出物（Leachables）驗證可以確認可能遷移至藥物制劑中的化合物，用以評估一次性系統對藥品質量、效能和安全的影響。

明確溶出物和析出物的定義以及兩者的區別非常重要，以避免混淆。溶出物指的是在夸大的時間和溫度下，從任何與產品接觸的材料遷移到合適溶劑中的化合物，代表了絕大多數可能的析出物[5]，其來源可能為過濾器或一次性系統材質中聚合物的單體、寡聚物、降解產物、相關添加劑（如抗氧化劑、潤滑劑、穩定劑、增塑劑、改性劑等加工助劑）以及生產過程中的溶劑殘留等等。析出物是指在實際的工藝條件下，從任何直接與產品接觸的材料，包括彈性體、塑料、玻璃、不銹鋼或者涂層材料遷移進入藥物制劑的化合物，并可能存在于最終藥品中，直接反映對藥品可能產生的影響，通常是溶出物的一個子集[5]。對于一次性系統來說，評估“工藝析出物”的含量是很重要的，“工藝析出物”是指那些從接觸設備遷移進入生產工藝線的化合物，不一定能通過后續的工藝步驟去除，比如層析、切向流或丟棄起始產品。當夸大條件下的溶出物研究結果表明一次性系統對藥品質量產生干擾時，需要考慮進行析出物研究。

為獲得產品中的析出物數據，使用藥物產品直接進行析出物研究似乎是最直觀的做法。然而藥物產品中往往含有高濃度非揮發性物質，且成分復雜。相對而言，析出物的濃度很低，其分析會受到藥物組分的干擾（比如掩蓋析出物），從而造成不準確、甚至假陰性的結果。因此，目前公認比較科學的做法是：首先檢測合理最差條件下的溶出物數據，用溶出物數據評估析出物水平，然后基于藥物每人每日攝入劑量進行安全評估；如果評估結果顯示有潛在風險，再在溶出物的基礎上進行析出物研究[5]。

與藥物產品兼容并直接接觸藥物的過濾器或一次性系統，影響其溶出物 / 析出物的因素有兩類：一類為工藝條件，如時間、溫度、滅菌條件和接觸面積；另一類為產品特性，如產品中的有機溶劑、表面活性劑、產品pH值等。

溶出物驗證試驗可分為兩步進行：首先根據產品特性和工藝條件，確定試驗流體（如模型溶劑）和試驗條件（如溫度、時間、料液pH值、接觸面積、預處理步驟等），與過濾器或一次性系統充分接觸（如循環、靜態浸泡、振搖等），獲得溶出物樣品；然后對樣品作必要的預處理，再進行定性和定量分析，檢測其中化合物的種類和含量[6,7,8]。

析出物試驗跟溶出物試驗步驟類似，主要有兩點區別，一是采用產品溶液作為試驗流體，二是采用實際工藝參數作為試驗參數。如果產品溶液中的組分比較復雜，定性和定量分析前的預處理方法可能也跟溶出物的預處理方法不一樣。

溶出物/析出物的分析方法

分析方法選擇

對于單個一次性組件或簡單的一次性系統，溶出物/析出物的提取方法相對比較容易，而對于溶出物/析出物分析，其方法的開發需要更多資源。隨著分析技術的快速發展，對溶出物/析出物的分析檢測也日趨深入。由于溶出物/析出物的組分十分復雜，單一的分析方法難以檢測所有的目標化合物。國內外各行業機構推薦的方法主要包括：液相色譜質譜聯用分析法（Liquid Chromatography/Photodiode Array/Mass Spectrometry，LC/ PDA/MS）、氣相色譜質譜聯用分析法（Gas Chromatography/ Mass Spectrometry，GC/MS）、電感耦合等離子體質譜法（Inductively Coupled Plasma/Mass Spectrometry，ICP/MS）、離子色譜法（Ion Chromatography，IC）、紫外光譜法 （Ultraviolet Spectroscopy， UV）、傅里葉紅外光譜法（Fourier Transform Infrared Spectroscopy，FTIR）、核磁共振波譜分析（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）、非揮發性殘留物（Non-volatile Residue，NVR）、總有機碳（Total Organic Carbon，TOC）、pH 值、電導率等等[8,9]。其中 LC/MS、GC/MS、ICP/MS 和IC均可用于定性和定量分析，UV、FTIR、NMR 主要用于定性分析，NVR 用于常規定量分析，TOC、pH和電導率則作為輔助分析。

液相色譜質譜聯用分析（LC/ PDA/MS）

液相色譜（LC）主要進行溶出物 / 析出物的色譜分離，通過二極管陣列檢測器（Photodiode Array，PDA）和質譜檢測器（Mass Spectrometry，MS）檢測一定波長和質荷比（m/z）范圍內的非揮發性和部分半揮發性化合物。二極管陣列檢測器檢測可獲得具有紫外吸收的化合物信息，質譜檢測則可獲得化合物的分子量及結構信息，與標準品的保留時間（Retention Time，RT）和質譜匹配進行化合物的鑒別，并根據標準曲線對化合物定量。使用大氣壓化學電離（Atmosphere Pressure Chemical Ionization，APCI）和電噴霧（Electrospray Ionization，ESI）兩種離子源方式，可互相補充，更全面的分析溶出物/析出物。對于高鹽、高 pH、低 pH、含表面活性劑或含蛋白質的樣品，進行液相色譜分析前需對樣品預處理[11]。

氣相色譜質譜聯用分析（GC/MS）

質譜檢測器（MS）與氣相色譜（GC）聯用，通過頂空進樣氣相色譜質譜聯用（Headspace-GC/ MS）和直接進樣氣相色譜質譜聯用（Direct Injection-GC/MS）兩種不同的進樣方式分別檢測揮發性和半揮發性化合物。對于一次性系統的溶出/析出樣品分析，采用兩種GC/MS方法分別進樣分析，可以更加全面檢測出樣品中的揮發性和半揮發性物質。溶出或析出樣品可直接通過頂空進樣 GC/ MS進行分析，檢測其中所含的揮發性化合物。通常，這些化合物產生于伽馬滅菌過程，而且可能隨著放置時間增加而減少。因此必須在滅菌結束后盡快分析。揮發性化合物在較早取樣點的樣品中通常相對較多。直接進樣GC/ MS能夠檢測到一系列半揮發性化合物。一些溶出或析出樣品能夠直接用GC/MS色譜柱進樣分析，然而對大多數水溶液樣品，分析其中的半揮發性化合物需要進行液液萃取，比如使用與色譜柱和分析方法兼容的二氯甲烷溶劑進行萃取，然后再進行分析。

通過GC/MS圖譜獲得化合物的分子量及結構信息后，對照標準品的保留時間和質譜匹配對化合物進行鑒別，并利用化合物響應（通常是峰面積）對比標準曲線進行定量。必要時可采用其他檢測器，如氮磷檢測器、氫火焰離子化檢測器等。對于高鹽、含表面活性劑或含蛋白質以及極端pH值的樣品，進行直接進樣氣相色譜分析前通常需對樣品預處理，進行頂空進樣色譜分析的樣品則一般無此要求[11]。

電感耦合等離子體質譜法（ICP/MS）/電感耦合等離子體發射光譜法（ICP/OES）

這是一種用來測定元素含量的方法，具有靈敏度高、速度快、檢測限低等優點。其原理是被測元素通過一定形式進入高頻等離子體電離成離子，產生的離子經過離子光學透鏡聚焦后進入四極桿質譜檢測器，按照荷質比進行分離。適用于環境、地球化學、半導體、核工業、食品藥品、生物制品等不同領域幾乎所有金屬元素含量的分析，也可以分析絕大部分非金屬元素。此外，如果能夠達到符合要求的專屬性及檢測限值，電感耦合等離子體發射光譜（ICP/OES）作為另一種檢測方法，同樣可用于檢測元素含量[11,12, 13]。

離子色譜（IC）

離子色譜是利用被測物質的離子特性進行分離和檢測的一種液相色譜法，主要用于測定各種離子的含量。 根據分離原理的不同，可分為離子交換色譜、離子排斥色譜和離子對色譜，其中以離子交換色譜最為常用。離子交換色譜采用低容量離子交換樹脂為固定相進行分離，通過電導檢測器連續檢測流出物電導變化來分析陽離子和陰離子。除電導檢測器外，離子色譜還有直流安培、脈沖安培和積分安培等電化學檢測器以及紫外-可見和熒光檢測器。

在 SUT 的溶出物和析出物分析中，各種分析方法的互補特性幾乎可以涵蓋絕大多數化合物的分析，因此 IC 應用較少。

紫外光譜法（UV）

紫外光譜法（UV）可分析溶出物/析出物中帶有紫外發色基團的化合物，通常為含不飽和化學鍵和含孤電子對的化合物。有些樣品中的溶質或溶劑在特定波長下也具有較強的紫外吸收信號，可能會覆蓋溶出物/析出物的吸收峰。分析溶出物/析出物時，采用LC/PDA/MS分析方法能夠覆蓋紫外光譜法，因此可不單獨進行紫外檢測。

非揮發性殘留物（NVR）

非揮發性殘留物（NVR）是一種定量評估溶出物的分析方法。作為試驗流體的揮發性模型溶劑蒸發后，將非揮發性溶出物烘干所獲得的物質稱為非揮發性殘留物，通過稱重的方法來確定最差條件下從藥品生產設備遷移到模型溶劑中的非揮發性殘留物的量，從而代表在工藝條件下可能從生產設備遷移進入到藥物產品中的非揮發性殘留物的最大可能數量。非揮發性殘留物通常來源于高分子材質的寡聚物、添加劑及降解產物等。由于藥物產品中往往也含有非揮發性組分，干擾非揮發性殘留物總量分析，因此該方法不適用于析出物分析。

傅里葉紅外光譜法（FTIR）

紅外光譜法（FTIR）是一種強有力的基本定性分析工具，通過與特定的圖譜匹配來表征功能基團以及化合物種類。將紅外光譜圖與相同化合物進行比較，可推斷出溶出物中部分非揮發性殘留物（NVR）的種類信息。然而，為獲得單一化合物的定性與定量信息，則必須借助LC/PDA/MS 或GC/MS的分析方法才能實現。

總有機碳（TOC）、pH 值、電導率

總有機碳（TOC）的測定是一項非常重要的分析方法，能夠直接、快速、真實、靈敏地反映溶出物水平，然而，其局限在于僅適用于電導率相對較低的無機溶液。因此，常與pH值、電導率共同作為三項常規的輔助分析方法，用于考察一次性系統與試驗流體接觸前后的變化情況，這些參數的變化通常是由溶出物/析出物所造成，因此這些數值對評估一次性系統是否影響藥物產品有一定幫助。

分析方法開發

為了保證分析方法的可靠性，以準確定性和定量溶出物/析出物，應當預先對分析方法進行開發和驗證，同時應設立一定的接受標準[10]。藥品生產設備的供應商，應該建立靈敏的色譜方法，從而更好鑒別可能引入藥品生產工藝線中的聚合物、聚合物中的添加劑以及聚合物相關的降解產物。通常一次性系統供應商更能理解、控制并鑒別一次性系統生產時所使用的聚合材料。下文以LC/MS和GC/MS為例，簡單介紹分析方法的開發和驗證。

專屬性（Specificity）

專屬性是指在其他成分可能存在時，采用的方法能正確測定出被測物質的特性。一次性系統的供應商難以全面控制所有生產一次性系統的原材料信息，比如樹脂生產商沒有公開的配方或是一次性系統中所用的半成品材料。然而，有的供應商已經較好地建立了源于一次性系統材料并可能出現在藥品中的化合物的保留時間和標準品譜庫。在分析溶出物/析出物時，上述標準品庫中的特定標準品與被測物質在相同情況下進樣分析，識別被測物質，可以獲得很高的置信水平，從而驗證其專屬性。如果僅僅通過出版的化合物數據或譜庫提供的信息與被測物質的保留時間或質譜片段進行比較，不能準確識別被測物質。

靈敏度（Sensitivity）

靈敏度通常以檢測限（Limit of Detection，LOD）和定量限（Limit of Qualification，LOQ）來表征。檢測限（LOD）指樣品中被測物質能被檢出的最低量，定量限（LOQ）指樣品中被測物質可被準確定量的最低量。

信噪比（Signal to noise, S/ N）法常常被采用來測定靈敏度。比較已知濃度標準品測出的信號與空白樣品測出的信號，分別將信噪比為3:1（S/N=3:1）和10:1（S/N=10:1）時的相應濃度確定為LOD和LOQ。不同的一次性系統組件，其溶出物 / 析出物不盡相同，宜選擇具有代表性的化合物作為標準品，獲得其LOD和LOQ值以表征靈敏度。分析溶出物 / 析出物時，對于某個具體方法， 報告其通用的LOD和LOQ值（比如低于0.1 ppm）是不恰當的，因為化合物類型和基質不同，其響應因子和離子化效能會發生變化，因此，應當報告該類化合物具體的LOD和LOQ值。

準確度（Accuracy）

準確度是測定結果與真實值的接近程度，一般用實際測得的數值與配制的真實濃度值的百分比（%）表示，比如85%。將標準品直接加入基質中計算出該百分比以考察方法的準確度，其結果應符合一定的接受標準。

分析溶出物時，一般選用一次性系統中容易或經常遷移出來、并且在相應分析方法中具有代表性的化合物作為標準品來考察準確度；分析析出物時，準確度則通過溶出物試驗中識別出的化合物作為標準品來衡量。不論分析溶出物或者析出物，進樣分析前常常需要對樣品進行預處理。這是因為有的溶劑（如水）不適合直接進樣氣相色譜，有的藥物組分（如蛋白質或表面活性劑）會污染或堵塞色譜柱。預處理雖然費時，但是可以獲得具有代表性的分析數據并避免傷害分析儀器。常見的預處理方法包括液液萃取、固相萃取、蛋白沉降等方法，通過考察所添加的標準品的回收率來確認預處理方法是否恰當并且幫助評估溶出物及析出物的量。由于模型溶劑組分相對簡單，對于溶出物樣品較易確定預處理方法。這有利于日后確定析出物樣品的預處理方法，并且由溶出物數據提供佐證，可以更準確地識別析出物中含量較低的化合物，避免漏檢化學物質或造成假陰性結果，影響后續安全評估的客觀性。

對比產品對照和析出物的譜圖（圖1和圖2），很容易識別出部分析出物，如位于RT=0.52 min， 2.27 min和3.24 min處的吸收峰。產品對照的譜圖中，RT=1.65 ～ 2.00 min處有一個很強的吸收峰，不能確定該處是否存在析出物。對比溶出物譜圖（圖3），RT=1.89 min處存在吸收峰，是潛在的析出物，對析出物進一步進行離子掃描分析（圖4），確認該物質屬于析出物。再對該物質進行定性和定量分析，得到準確的分析結果。

圖5 液相色譜圖

可見，溶出物數據有利于發現潛在的析出物，可以最大程度地識別出析出物種類，避免析出物漏檢或假陰性。同時在極少數情況下，析出物抽提液中可能還含有遷移出的化學物質與藥物組分反應產生的微量反應產物。以溶出物譜圖作為參照，可以識別出可能的額外反應產物，從而得到更準確的析出物數據，使后續的安全評估更加客觀真實，降低風險。

精密度（Precision）

精密度是指在規定的測試條件下，同一個被測樣品經多次取樣測定所得結果之間的接近程度，一般用偏差、標準偏差或相對標準偏差表示。

相同條件下，同一個分析人員測定結果的精密度稱為重復性。同一個實驗室，分析時間、分析人員和分析設備這三個因素（甚至包括試劑、溫度、進樣方法等可能引起試驗結果偏差的所有因素）當中，變動其中任何因素，其測定結果之間的精密度稱為中間精密度。不同實驗室、不同分析人員之間測定結果之間的精密度稱為重現性。

樣品分析前，須考察系統適用性，如檢測限、定量限、精密度、準確度等等，以確保儀器運行正常、狀態良好、結果穩定可靠。作為系統適用性的考察項目之一，每次分析溶出物/ 析出物樣品前，用標準品溶液連續多次進樣，根據保留時間和峰面積分別確定其相對標準偏差，并且在樣品運行過程中用已知濃度的標準品溶液考察其響應值的偏差，以確認分析結果的有效性。

線性和范圍（Linearity and Range）

線性是指在一定范圍內，測試結果與被測物質濃度直接呈正比關系的程度。范圍是指能達到一定精密度、準確度和線性，測試方法使用的高低限濃度的區間。通常標準曲線應當包含至少5個濃度點，并保證樣品濃度落在標準曲線范圍內，最低濃度點為定量限濃度水平。通常，如果使用相關的一類物質時，半定量分析是一種可以接受的方法。其優點在于可在較短時間內消耗較少的資源，獲得化合物大致的濃度結果。此外，當不能通過商業途徑獲得標準品時，采用半定量分析不失為一個比較合理的選擇。如果需要更加準確的結果評估高風險工藝，則需要將標準品加入基質當中，獲得線性范圍內不同濃度的標準曲線，從而進行定量分析。

由于不同化合物在儀器中的響應因子（即峰面積與濃度的比值）不同，半定量分析不能確定化合物的準確濃度。如圖5所示，液相色譜圖中3個吸收峰A、B、C分別代表3個不同的化合物。分別采用A、B、C的標準品進行定量分析以及采用另一個化合物D對其進行半定量分析，兩種定量結果見表1和表2。在多數情況下，定量分析比半定量分析的結果更準確。從結果來看，三個化合物的半定量分析結果分別比實際濃度高23%、67%和66%，而定量分析結果的偏差僅1%。由此可知，定量分析的結果比半定量分析準確得多。選擇定量（完全定量或半定量）方法時應當慎重，在尋求更準確的結果與所需要投入的資源（比如時間和費用）中取得平衡。

表1 定量結果

表2 半定量結果

耐用性（Robustness）

耐用性是指在測定條件有小的變動時，測定結果不受影響的承受程度。為了使方法可用于日常檢驗，在分析方法開發階段，應研究其耐用性，如有苛刻的測試條件，應在方法中注明。對GC/MS和LC/MS而言，典型的變動因素有：待測溶液的穩定性、流動相的組成和pH值、固定相、不同品牌或批號的同類型色譜柱、柱溫、流速、進樣口和檢測器溫度等。

溶出物/析出物驗證

溶出物/析出物驗證是為了考察過濾器和一次性系統在特定工藝中的適用性，以證明其應用不會影響藥品的質量和效能，并且不會帶來安全風險。該驗證過程主要分為以下六個步驟：

（1） 確定直接接觸藥品的一次性系統；（2） 了解其材料組成、與藥品的接觸方式、接觸條件及生產工藝過程；（3） 對一次性系統進行溶出物試驗，根據溶出物預測潛在的析出物，進行風險評估；（4） 用藥物產品對一次性系統進行析出物試驗，獲得析出物數據；（5）根據析出物數據進行安全性評估；（6） 總結一次性系統對藥品的影響，得出適用性結論。

進行溶出試驗時，過濾器或一次性系統與試驗流體直接接觸過程中應盡量保持流體流動，最終獲得溶出物抽提液。對得到的溶出物抽提液進行定性和定量分析，從而獲得溶出物（即潛在析出物）種類和溶出量。在進行某些分析之前，可能需要對抽提液進行預處理，如前文所述，在預處理時應考察標準品的回收率，以驗證預處理方法，保證準確度。

獲得溶出物數據后，根據藥物生產批量和臨床用藥的日攝入量，計算出溶出物的日攝入量，再跟日允許暴露量（Permitted Daily Exposure，PDE）等數據進行比較，確認過濾器或一次性系統在工藝條件下產生的溶出物對藥物產品是否產生安全風險。

因為析出物通常是溶出物的子集，即溶出物中的化合物種類比相應的析出物多，溶出量比析出量大，因此一般認為溶出物代表了析出物的最差條件。如果溶出物沒有超過安全閾值，可以認為該一次性系統適用于該特定工藝條件；如果超過了安全閾值，可以考慮進行析出物試驗，結合藥品生產批量和藥品的每日攝入量，用析出物數據再行評估安全性。

總結

使用一次性系統進行生物制藥產品生產，在整個制藥行業引起廣泛的興趣和使用熱情，有著良好的應用前景。而隨著人們對健康和藥品質量的日益重視，針對一次性系統的應用可能帶來的風險，引起法規部門、標準協會、行業聯盟、供應商和終端用戶的高度關注，對此展開了深入的討論和研究，不斷出臺相關規定、技術文件和解決方案，以推進整個行業的發展。因此，對一次性系統進行溶出物/析出物驗證，既符合法規要求，也順應行業發展趨勢。技術上可參考行業推薦的方案和分析方法，對一次性系統的適用性進行全面評估。同時，分析技術的不斷發展，痕量物質的分析水平逐步提高，對溶出物/析出物的分析必將越來越精準。隨著法規的重視、方法和標準的完善、技術的提高，一次性系統對制藥行業必定帶來更深遠的影響。

[1] Bio-Process System Alliance, Implementing Single-Use Technology in Biopharmaceutical Manufacturing,Weibing Ding, Jerold Martin, Part One, 2008; Part Two, 2009; Part Three, 2010.

[2] Pall Life Science, Extractables and Leachables from Single-use Systems, USTR 2859, 2012.

[3] Toward Industry Standardization of Extractables Testing for Single-Use Systems: A Collective BPSA Perspective, 2015.

[4] 國家食品藥品監督管理總局，藥品生產質量管理規范（2010），附錄 1，無菌藥品。

[5] Bio-Process System Alliance (BPSA) Extractables and Leachables Subcommittee, Recommendation for Extractables and Leachables Testing, Part One, 2007; Part Two, 2008.

[6] 除菌過濾器驗證（三）：溶出物/析出物，洪海燕，唐燕，2011.

[7] Parenteral Drug Association (PDA), Sterilizing Filtration of Liquids, Technical Report No. 26, 2008.

[8] Parenteral Drug Association (PDA), Application of Single-Use Systems in Pharmaceutical Manufacturing, Technical Report No. 66, 2014.

[9] 化學藥品注射劑與塑料包裝材料相容性研究技術指導原則，2012.

[10] 中國藥典（2010），附錄 XIX，A 藥品質量標準分析方法驗證指導原則。

[11] Standardized Extractables Testing Protocol for Single-Use Systems in Biomanufacturing, Weibing Ding, 2014.

[12] United States Pharmacopoeia (USP) <233>, Element Impurities-Procedures. [13] Food and Drug Administration (FDA), Guidance for Industry: Analytical Procedures and Methods Validation for

本文由頗爾過濾器（北京）有限公司提供。