銀杏不同部位黃酮、內(nèi)酯和銀杏酸含量分析

吳 竹，王秋萍，田漫漫，王黔陽，何 珺*

(1.貴州大學 藥學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省生化工程中心，貴州 貴陽 550025)

?

銀杏不同部位黃酮、內(nèi)酯和銀杏酸含量分析

吳 竹1，2，王秋萍1，2，田漫漫1，2，王黔陽2，何 珺2*

(1.貴州大學 藥學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省生化工程中心，貴州 貴陽 550025)

為分析銀杏不同部位黃酮、內(nèi)酯和銀杏酸含量，采用高效液相色譜法測定其含量，研究其分布規(guī)律。結(jié)果表明：雌樹不同部位中，葉的黃酮和內(nèi)酯含量高于其他部位，外種皮中銀杏酸含量高于其他部位；雄樹不同部位中，葉的黃酮和內(nèi)酯含量高于樹枝，樹枝的銀杏酸含量高于葉。綜上所述，雌雄銀杏的不同部位黃酮、內(nèi)酯和銀杏酸的含量有一定的差異，應對其不同部位進行合理利用從而加快銀杏產(chǎn)業(yè)進一步發(fā)展。

銀杏；黃酮；內(nèi)酯；銀杏酸；含量分析

銀杏(GinkgobilobaL.)為銀杏科、銀杏屬多年落葉喬木。銀杏起源于中國，它集果用、樹用、防護、觀賞于一體，是我國特有的多用途樹種。銀杏中所含的成分復雜多樣，在不同部位其種類及生物活性也各有不同。銀杏的葉、果仁、外種皮均有藥理作用，其中藥用價值最高的部位是銀杏葉。以銀杏葉提取物為原料制成的各種產(chǎn)品，應用于藥物、保健食品、功能性飲料等領域[1]。在全球的天然藥物中，銀杏制劑是用量較大的品種之一，在國內(nèi)銀杏制劑的年銷售額約為60億元，在心腦血管疾病中應用廣泛[2，3]。銀杏主要的活性成分為黃酮類、內(nèi)酯類化合物和銀杏酸[4]，但雌雄植株的不同部位在活性成分含量上有很大區(qū)別。黃酮類化合物主要以黃酮苷形式存在，可有效清除自由基[5]；內(nèi)酯類化合物為強效血小板活化因子(PAF)拮抗劑[6，7]；而銀杏酚酸類成分具有致敏性、細胞毒性和免疫毒性，為銀杏及白果的主要毒性成分，也是銀杏提取物及其制劑中的主要毒性物質(zhì)[8]。2015版藥典要求銀杏葉中總黃酮大于0.40%，總內(nèi)酯大于0.25%，同時要求銀杏葉提取物中總黃酮大于24%，總內(nèi)酯大于6%，而總銀杏酸含量不得超過10 mg/kg。我國的銀杏資源豐富，銀杏渾身是寶，具有極高的藥用價值。因此探索銀杏不同部位黃酮、內(nèi)酯和銀杏酸含量，并進行比較分析，為提高銀杏的綜合利用價值，同時為加快銀杏產(chǎn)業(yè)發(fā)展及提高利用效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

對照品：槲皮素對照品(批號：100081-201408)；山柰素對照品(批號：110861-201310)；異鼠李素對照品(批號：110860-201410)；白果內(nèi)酯(批號：110863-201505)；銀杏內(nèi)酯A(批號：110862-201511)；銀杏內(nèi)酯B(批號：110863-201410)；銀杏內(nèi)酯C(批號：110864-201505)；白果新酸(批號：111690-201403)；銀杏總酸(批號：111594-201503)，均購于中國食品藥品檢定研究所，供含量測定用。

樣品：銀杏葉、銀杏樹枝、白果、外種皮，于2015年10月下旬在江蘇邳州市鐵富鎮(zhèn)銀杏種植基地隨機采集5棵8～10年樹齡銀杏樹的鮮樣，統(tǒng)一置于60℃烘箱中烘干，粉碎，密封袋包裝保存于干燥器中備用。

試劑：甲醇(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；磷酸(分析純，貴陽高新技術(shù)開發(fā)區(qū)華通化學試劑廠)；四氫呋喃(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；三氟乙酸(分析純，天津市光復精細化工研究所)；乙腈(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；酸性氧化鋁(200-300目，柱層析用，桂林貴成科技有限公司)；其他試劑均為分析純。

儀器：分析型HPLC(1100 series)Agilent Technology， U.S；C18高效液相色譜柱(大連依利特分析儀器有限公司)；BSA124S電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；FW80高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；XMTD-3302數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州華奧儀器制造有限公司)；GZX-9140電熱鼓風干燥箱(上海博訊實業(yè)有限醫(yī)療設備廠)；其他為一般常規(guī)儀器。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

1.2.1.1 測定黃酮色譜條件：大連依力特Hypersil ODS2色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.4%磷酸溶液(50：50)；流速：0.80 mL/min；柱溫：(45±0.1)℃；檢測波長：360 nm。

1.2.1.2 測定內(nèi)酯色譜條件：大連依力特Hypersil ODS2色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-四氫呋喃-水(25：10：65)；流速：0.80 mL/min；柱溫：(40±0.1)℃；蒸發(fā)光檢測器。

1.2.1.3 測定銀杏酸色譜條件：大連依力特Hypersil ODS2色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：0.1%三氟乙酸的乙腈為流動相A，0.1%三氟乙酸的水為流動相B，按下表進行梯度洗脫；檢測波長：310 nm[9]。

表1 洗脫梯度

1.2.2 對照品溶液制備

1.2.2.1 黃酮對照品溶液的制備：參照《中國藥典》2015版第一部銀杏葉總黃酮醇苷含量測定中對照品溶液制備方法，配制每1 mL含槲皮素30 μg、山奈素30 μg、異鼠李素20 μg的混合溶液。

1.2.2.2 內(nèi)酯對照品溶液的制備：參照《中國藥典》2015版第一部銀杏葉萜類內(nèi)酯含量測定中對照品溶液制備方法，配制每1 mL含銀杏內(nèi)酯A 0.18 mg、銀杏內(nèi)酯B 0.08 mg、銀杏內(nèi)酯C 0.10 mg、白果內(nèi)酯0.20 mg的混合溶液。

1.2.2.3 銀杏酸對照品溶液的制備：取白果新酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含1 μg的溶液，作為對照品溶液。另取總銀杏酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，作為定位用對照溶液。

1.2.3 供試品溶液制備

1.2.3.1 黃酮供試品溶液的制備：精密稱取樣品粉末約1 g，參照《中國藥典》2015版第一部銀杏葉總黃酮醇苷含量測定中供試品溶液制備方法，制備供試品。

1.2.3.2 內(nèi)酯供試品溶液的制備：取樣品粉末約1.5 g，參照《中國藥典》2015版第一部銀杏葉萜類內(nèi)酯含量測定中供試品溶液制備方法，制備供試品。

1.2.3.3 銀杏酸供試品溶液的制備：取樣品粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱定重量，超聲45 min，取出，冷卻，稱重，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，先用濾紙過濾，然后用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得[10]。

1.2.4 測定方法

1.2.4.1 黃酮測定方法：精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，按公式：總黃酮醇苷含量=(槲皮素含量+山奈素含量+異鼠李素含量)×2.51計算含量。

1.2.4.2 內(nèi)酯測定方法：精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，按公式：總內(nèi)酯含量=白果內(nèi)酯含量+銀杏內(nèi)酯A含量+銀杏內(nèi)酯B含量+銀杏內(nèi)酯C含量計算。

1.2.4.3 銀杏酸測定方法：精密吸取對照品溶液、供試品溶液各50 μL，注入液相色譜儀，測定，以白果新酸對照品外標法計算總銀杏酸含量。

2 結(jié)果與分析

將采集于5棵不同銀杏樹的銀杏葉、銀杏樹枝、白果及外種皮樣品分別按“1.2.3”項下方法平行制備3份，按“1.2.4”項下方法測定其總黃酮、總內(nèi)酯和銀杏酸含量，計算平均值，結(jié)果見表2、表3、表4。

由表2可知，在雌、雄銀杏樹的不同部位黃酮含量有一定的差異，呈顯樹葉>樹枝、外種皮>果仁，其中雌樹樹葉的總黃酮含量最高，而黃酮含量最高的銀杏葉中，雌樹葉>雄樹葉，而在雌雄銀杏樹枝中黃酮含量差別不大。

表2 銀杏不同部位的黃酮含量(%)

表3 銀杏不同部位的內(nèi)酯含量(%)

由表3可知，在雌銀杏樹的不同部位，總內(nèi)酯含量樹葉>樹枝>外種皮>果仁；在雄樹的不同部位，樹葉內(nèi)酯含量高于樹枝。

由表4可知，在銀杏的不同部位都含銀杏酸，但含量差異較大。在雌樹的不同部位中，外種皮>>樹葉>樹枝>>果仁，外種皮的含量最高，達4.4%，果仁含量最低至0.0008%。在雄樹樹葉、樹枝銀杏酸含量均高于雌樹。

表4 銀杏不同部位銀杏酸含量(%)

3 結(jié)論與討論

本研究對銀杏不同部位的黃酮、內(nèi)酯和銀杏酸含量進行了分析和探討，結(jié)果表明葉中總黃酮和總內(nèi)酯含量均高于其他部位，是提取黃酮及內(nèi)酯活性成分的最佳藥用原料，同時對雌、雄樹銀杏葉進行比較分析，結(jié)果表明，雌樹葉中黃酮含量高于雄樹葉，且銀杏酸含量低于雄樹葉；雌樹中不同部位的銀杏酸含量：外種皮>樹枝>樹葉>果仁，銀杏外種皮中銀杏酸含量高達4.4%，因此在采收季節(jié)應做好防范措施，避免外種皮混入葉中從而使原料銀杏酸含量偏高，導致產(chǎn)品的銀杏酸含量超標。有研究表明銀杏酸具有良好的殺蟲殺菌效果[11-13]，因此，白果外種皮是銀杏酸農(nóng)藥用提取最佳原料；果仁中三種成分含量都很低，但其含粗脂肪、淀粉、蛋白質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，具有很高的食用價值[14]，但食用時應高溫處理好，避免有毒成分銀杏酸食入而引起過敏等不良反應；銀杏樹枝三種成分含量都較低，在實際生產(chǎn)中不宜作為原料。

高麗雅[15]等研究了銀杏不同部位黃酮類化合物含量的分布，李轉(zhuǎn)梅等[16]測定白果不同部位及不同炮制品中白果酸和總銀杏酸，但對銀杏不同部位的黃酮、內(nèi)酯和銀杏酸三種成分含量都進行了分析和探討的相關(guān)文獻極少，且本研究結(jié)果與吳爭榮[17]等采用高效液相法測定了雌雄銀杏不同部位黃酮含量結(jié)果中雄性銀杏均高于雌性銀杏的結(jié)果有差異。因此，本文研究了銀杏樹不同部位中黃酮、內(nèi)酯及銀杏酸含量的分布情況，為銀杏不同部位綜合開發(fā)利用提供更有效、更全面、有價值的參考。

[1] 安建平，王廷璞，趙菲佚，等.銀杏化學成分及藥理作用的研究和應用進展[J].天水師范學院學報，2003，23(5)：34-37.

[2] 郭 明，劉 玥，許 琳，等.中藥銀杏制劑的心血管藥理效應：機制與展望[J].中國科學：生命科學，2014，44(6)：543-550.

[3] 謝作權(quán)，張慶華.銀杏葉提取物對神經(jīng)及心血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機制[J].國外醫(yī)學(藥學分冊)，2007，34(1)：35-38.

[4] 張紅梅.天然藥物銀杏的化學成分和藥理作用[J].首都師范大學學報(自然科學版)，2014，35(3)：41-46，66.

[5] 牟玲麗，寇俊萍，朱丹妮，等.銀杏葉的化學成分及其抗氧化活性[J].中國天然藥物，2008，6(1)：26-29.

[6] 魏學立，曲 瑋，梁敬鈺.銀杏的研究進展[J].海峽藥學，2013，25(2)：1-8.

[7] 王 旋，張慧靈，顧振綸，等.銀杏內(nèi)酯藥理作用的研究進展[J].中草藥，2005，11：1741-1744.

[8] 王蕎薇，謝媛媛，王義明，等.銀杏葉中銀杏酚酸類成分含量測定方法研究[J].中國藥學雜志，2015，50(2)：167-173.

[9] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：316-317，416-417.

[10] 黃 萍.不同產(chǎn)地銀杏葉中總銀杏酸的含量比較[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19(12)：129-131.

[11] 毛佐華，俞培忠，孫 鍇，等.銀杏酸5種同系物單體的制備及其殺滅釘螺的作用[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2007，25(4)：274-278.

[12] 林光榮，林清洪，胡維冀，等.銀杏酸的分離、鑒定及對5種蔬菜病原真菌的抑制作用[J].江西農(nóng)業(yè)大學學報，2010，32(3)：498-503.

[13] 李金雨，林清洪，林光榮，等.銀杏酸微乳劑對幾種蔬菜病原真菌的抑制作用[J].福建農(nóng)業(yè)科技，2012，10：47-49.

[14] 蒲麗麗.銀杏的藥用食用價值及在食品工業(yè)中的應用[J].農(nóng)村經(jīng)濟與科技，2010，21(4)：110，53.

[15] 高麗雅，李穩(wěn)宏，韓 楓，等.黃酮類化合物在銀杏不同部位含量的分布[J].西北大學學報(自然科學版)，2007，37(2)：225-227，272.

[16] 李轉(zhuǎn)梅，張學蘭，李慧芬，等.白果不同部位及不同炮制品中白果酸和總銀杏酸定量比較[J].中成藥，2015，37(1)：164-168.

[17] 吳爭榮，馮海蓉，賀 殿，等.雌雄銀杏不同部位黃酮含量的高效液相色譜法測定[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2010，30(21)：1877-1878.

Analysis on the Content of Flavonoids, Terpene Lactones and Ginkgo Acid in Different Parts inGinkgoBiloba.

WUZhu1，2，WANGQiu-ping1，2，TIANMan-man1，2，WANGQian-yang2，HEJun2*

(1.CollegeofPharmacy,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China;2.ResearchCenterofBiochemistryEngineeringofGuizhouProvince,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

In order to analyse the content of flavonoids, terpene lactones and ginkgo acids in different parts of Ginkgo biloba, the content of these components were determined by the high performance liquid chromatography (HPLC). For female, the content of flavonoids and terpene lactones was higher in leaves than in other parts; and the content of ginkgo acid was higher in episperm than in other parts. For male, the content of flavonoids and terpene lactones was higher in leaves than in branches; and the content of ginkgo acid was higher in branches than in leaves. It is clear that different parts of female and those of male have different contents of flavonoids, terpene lactones and ginkgo acid. Therefore, different parts of Ginkgo biloba should be used rationally in order to accelerate the development of ginkgo industry.

Ginkgobiloba；flavonoids；terpene lactones；ginkgo acid；content analysis

2017-03-08；

2017-05-16

貴州省科技廳2008年省重大專項項目(2007065)。

R284.1

A

1008-0457(2017)04-0072-04 國際

10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.04.013

*通訊作者：何珺(1974-)，女，副教授，主要研究方向：天然產(chǎn)物有效成分提取及檢測技術(shù)；E-mail：hejun1016@163.com。