幾種中藥材對兔原代腎小管上皮細胞增殖作用影響的研究

趙 丹，張 雪，管 靜，周 英，俸婷婷*

(1.貴州大學 藥學院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州省中藥民族藥創制工程中心，貴州 貴陽 550025；3.貴州省藥食同源植物資源開發工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025；4. 貴州省藥食兩用資源應用開發工程實驗室，貴州 貴陽 550025；5.貴州醫科大學 公共衛生學院，貴州 貴陽 550025)

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幾種中藥材對兔原代腎小管上皮細胞增殖作用影響的研究

趙 丹1，2，3，4，張 雪5，管 靜1，2，3，4，周 英1，2，3，4，俸婷婷1，2，3，4*

(1.貴州大學 藥學院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州省中藥民族藥創制工程中心，貴州 貴陽 550025；3.貴州省藥食同源植物資源開發工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025；4. 貴州省藥食兩用資源應用開發工程實驗室，貴州 貴陽 550025；5.貴州醫科大學 公共衛生學院，貴州 貴陽 550025)

通過體外培養兔原代腎小管上皮細胞，來研究大血藤、吳茱萸、豨薟草及川牛膝4種中藥材提取物對腎小管上皮細胞增殖作用的影響。利用MTT法測定大血藤、吳茱萸、豨薟草及川牛膝4種中藥材的水提與醇提的3 mg/L，30 mg/L和300 mg/L三個濃度組對兔原代腎小管上皮細胞增殖作用的影響。結果表明，吳茱萸和豨薟草的醇提300 mg/L濃度組及大血藤的水提300 mg/L濃度組對兔原代腎小管上皮細胞的增殖作用抑制很強，其存活率分別僅有24.12%，16.03%和30.84%，而大血藤的醇提3 mg/L濃度組和豨薟草的醇提30 mg/L及3 mg/L濃度組對兔原代腎小管上皮細胞的增殖作用具有促進作用，其存活率達到了107.91%，114.95%和111.45%。大血藤、吳茱萸、豨薟草及川牛膝4種中藥材對兔原代腎小管上皮細胞增殖作用均有不同程度的影響。

大血藤；吳茱萸；豨薟草；川牛膝；增殖作用

大血藤(Sargentodoxacuneata)，木通科大血藤屬植物，具有抗炎，活血，祛風止痛等藥理作用。吳茱萸(Tetradiumruticarpum)，蕓香科吳茱萸屬植物，具有止瀉、散寒止痛等藥理作用。豨簽草(SiegesbeckiaorientalisL.)為菊科草本植物，具有祛風濕，利關節，抗炎等藥理作用。川牛膝(CyathulaofficinalisKuan)，莧科杯莧屬植物，具有逐瘀通經，通利關節，降血壓作用等藥理作用[1]。這4種中藥材均具有溫補腎陽、利水滲濕、益氣活血等功效，根據中醫藥理論中的性味歸經之說，均可歸屬為腎經。根據歸經理論，能夠將藥物的作用與人體的臟腑經脈之間的關系相結合，說明藥物能治療或作用的臟腑經脈的病變，從而就能具體的認識到藥物的主要作用器官和藥物的特殊功效[2]。本文旨在利用原代分離的兔腎小管上皮細胞對大血藤、吳茱萸、豨薟草及川牛膝4種中藥材提取物對腎小管上皮細胞增殖作用的影響進行研究，為這4種中藥材的應用及腎毒性作用的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

20天齡雄兔購自貴州省畜牧研究所實驗基地，清潔級，合格證CSXK(黔)2012-001。

中藥材：大血藤、吳茱萸(四平市百草堂中藥飲片有限公司)；豨薟草(四川省川南藥業有限公司)；川牛膝(成都市益誠藥業有限公司)。

試劑：DMEM/F12(1∶1)(Hyclone)，胎牛血清(四季青)，胰蛋白酶(Amresco)，堿性磷酸酶染液—鈣鈷法(南京建成)，SP染液、CK18(北京博奧森)，DAB顯色劑(北京中杉金橋)，噻唑藍(MTT)，二甲亞砜(DMSO)。

儀器：旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器)，冷凍干燥機(北京松源華興科技)，CO2培養箱、酶標儀(Thermo)，倒置熒光顯微鏡(寧波舜宇)，超凈工作臺(蘇州凈化)。

1.2 方法

1.2.1 中藥材提取物的制備 分別稱取大血藤、吳茱萸、豨薟草及川牛膝4種中藥材100.0 g，粉碎，分別用雙蒸水，75%乙醇為提取液，以料液比1∶10進行回流提取，80℃，1 h，連續提取3次。合并提取液，抽濾濃縮，再低溫凍干，得到不同質量的提取物，低溫密封保存，備用。

1.2.2 兔原代腎小管上皮細胞的分離與鑒定 以耳緣靜脈注入空氣處死，無菌切取雙腎，浸泡于冷PBS中，剝離腎締及腎包膜，保留腎皮質，剪碎，過80目篩，取篩上部分研碎，再過150目篩，取篩上部分，以1500 r/min，離心7 min，去上清液，再用胰酶消化15 min，終止消化，離心去上清液，再用完全培養基定容至10 mL，均分至兩培養皿中，鏡檢。37℃，5%CO2培養，24 h后補加3 mL完全培養基，72 h后首次換液。

以濃度為1×105mol/mL的細胞接種于24孔板，爬片。37℃，5%CO2培養24 h。采用堿性磷酸酶染液(鈣鈷法)對腎小管上皮細胞進行滴染。免疫組化染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(SP法)，DAB試劑顯色。

1.2.3 中藥材提取物對腎小管上皮細胞增殖作用影響的測定 稱取中藥材水提物0.1 g，溶于1 mL完全培養基中，梯度稀釋至終濃度為3 mg/L，30 mg/L和300 mg/L。稱取中藥材醇提物0.1 g，溶于1 mLDMSO中，用完全培養基梯度稀釋至終濃度為3 mg/L，30 mg/L和300 mg/L。

以濃度為1×105mol/mL接種于96孔板，每孔200 μL，37℃，5%CO2條件下培養24 h。棄上清液，更換新培養基，實驗組更換含不同濃度中藥材提取物的培養基，水提物空白對照組更換含完全培養基，醇提物空白對照組更換含2‰DMSO培養基，每組設置5個復孔。繼續培養48 h，每孔加入20 μL MTT(終濃度0.5 g/L)，37℃，5%CO2條件下反應4 h，棄上清液，每孔加入150 μLDMSO，振蕩10 min。490 nm處測OD值。以存活率為指標，反映中藥材對腎小管上皮細胞的影響，計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 中藥材制備的結果

共制備4種中藥材的水煎物和醇提物，中藥材提取結果見表1。

表1 中藥材制備的結果

2.2 腎小管上皮細胞鑒定的結果

堿性磷酸酶化學染色呈陽性結果，細胞質中有灰黑色顆粒沉淀(圖1)。

免疫組化染色呈陽性結果，圍繞細胞核周圍細胞質及胞漿中呈棕黃色沉淀，蘇木素復染后顏色變深，呈棕褐色(圖2)。堿性磷酸酶是腎小管上皮細胞中的標志性酶，細胞角蛋白CK18是腎小管上皮細胞特異性表達的角化蛋白。鑒定結果說明該細胞為所需的腎小管上皮細胞。

圖1 兔腎小管上皮細胞堿性磷酸酶染色×400

2.3 中藥材對腎小管上皮細胞增殖作用影響的結果

吳茱萸和豨薟草的醇提300 mg/L濃度組及大血藤的水提300 mg/L濃度組對兔原代腎小管上皮細胞的增殖作用抑制很強，其存活率分別僅有24.12%、16.03%和30.84%，而大血藤的醇提3 mg/L濃度組和豨薟草的醇提30 mg/L及3 mg/L濃度組對兔原代腎小管上皮細胞的增殖作用具有促進作用，其存活率達到了107.91%、114.95%和111.45%。川牛膝的水提和醇提的3 mg/L，30 mg/L和300 mg/L三個濃度組對腎小管上皮細胞增殖作用的影響很小，其存活率均不低于90%，除水提300 mg/L濃度組的存活率為88.40%。具體數值見表2。

圖2 兔腎小管上皮細胞免疫組化結果

中藥材水提物OD值水提物抑制率(%)醇提物OD值醇提物抑制率(%)空 白0．5241±0．04—0．5417±0．04—大血藤300mg/L0．1588±0．0130．840．2045±0．0239．72大血藤30mg/L0．5155±0．06100．140．3603±0．0469．98大血藤3mg/L0．5028±0．07102．340．5555±0．04107．91吳茱萸300mg/L0．3408±0．0460．650．1355±0．0124．12吳茱萸30mg/L0．3563±0．0663．410．3673±0．0265．37吳茱萸3mg/L0．3973±0．0370．710．4138±0．0273．65豨簽草300mg/L0．4870±0．0994．600．0825±0．0016．03豨簽草30mg/L0．4887±0．0394．920．5918±0．05114．95豨簽草3mg/L0．4498±0．0287．360．5738±0．05111．45川牛膝300mg/L0．4753±0．0288．400．4910±0．0691．33川牛膝30mg/L0．5155±0．0395．890．5428±0．02100．96川牛膝3mg/L0．5138±0．0295．560．5395±0．02100．35

3 結論與討論

人體內的代謝廢物大部分通過泌尿系統排出體外，腎小管是腎臟的重要組成部分，亦是泌尿系統的重要功能性結構。代謝物在腎小球中進行超濾，形成原尿進入腎小管，在腎小管中進行重吸收最終形成終尿排出體外。在此過程中各種藥物及其代謝物多數會直接與腎小管接觸后再排出體外，因此腎小管上皮細胞成為了外源物毒性作用的靶向結構[3]。通過分離培養兔原代腎小管細胞，可以很快得到不同藥材對該細胞增殖作用影響的結果。這種通過體外建模來研究藥物的藥理活性方法已經逐步普及，與體內試驗相比，該方法具有靶向準確性高，出結果快，可信度高等優點，當然也存在評判標準不一等缺點，但是其數據也可作為藥理實驗的考察依據之一。

中藥材大都來源于天然植物、動物及礦物質，且傳統觀念認為，相比于西藥，其毒性和副作用相對較小，應用較為安全。隨著國內中醫藥的快速發展，中藥越來越受消費者的青睞，且中藥的研究也備受關注，從而中藥的使用范圍也在不斷擴大，其不良反應事件發生率也呈現增加的趨勢。自20世紀60年代起，中藥所致的腎損害病例被陸續報道，引起了世界各國藥事管理部門和學界的廣泛關注[4]。腎臟作為人體代謝排毒的重要器官之一，多種藥物或其代謝產物大都必經此處，在腎小管過濾、重吸收，再排出體外。此過程必然會與腎小管上皮細胞直接接觸，故采用體外培養腎小管上皮細胞，測驗中藥材對其的增殖毒性可從一方面反映中藥材對腎的影響，且具有快速高效的優點。

大血藤、吳茱萸、豨簽草及川牛膝在抗炎鎮痛，祛風濕方面均具有一定藥理作用[5-8]。并且在臨床上，也有一定的應用，為了方便其在藥理研究方面更好的利用，利用分離培養兔原代腎小管細胞來試驗其對腎小管上皮細胞的增殖作用的影響是很有必要的。在本次實驗中發現川牛膝的水提和醇提的不同濃度組對腎小管上皮細胞的增殖毒性都很低，并且醇提的中濃度組及低濃度組對該細胞還具有促進增殖作用，這樣可以增大其用量使其達到最佳的藥理療效。而吳茱萸的水提及醇提的高中低三個濃度組對該細胞均具有增殖毒性，故而在做其他藥理研究中，應盡量選擇較低濃度，也可從吳茱萸較強的細胞毒性方面研究其一直細胞存活或生長途徑。豨簽草及大血藤的水提中濃度及低濃度組對該細胞的增殖毒性也很低，并且豨簽草的醇提中低濃度組和大血藤的醇提低濃度組對該細胞還具有較好促進增殖作用，從而在做其他藥理研究過程中適當的控制其用量。綜上所述，試驗中藥材對兔原代腎小管上皮細胞增殖作用的影響可作為藥材在藥理研究過程中濃度篩選的依據之一。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典(第一部)[M].中國醫藥科技出版社出版，2015.

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Effects of Several Traditional Chinese Medicinal Materials on the Proliferation of Primary Renal Tubular Epithelial Cells in Rabbit

ZHAODan1，2，3，4，ZHANGXue5，GUANJing1，2，3，4，ZHOUYing1，2，3，4，FENGTing-ting1，2，3，4*

(1.SchoolofPharmaceuticalsciences,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025；2.GuizhouEngineeringCenterforTraditionalChineseMedicineandEthnicMedicine,Guiyang,Guizhou550025；3.ResearchandDevelopmentCenterforMedicineandEdiblePlantResourcesofGuizhou,Guiyang,Guizhou550025；4.MedicinalandEdiblePlantResourcesApplicationandDevelopmentEngineeringLaboratoryofGuizhou,Guiyang,Guizhou550025; 5.SchoolofPublicHealth,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550025)

The effects of extracts of four Chinese herbal medicines, namely Sargentodoxa cuneata、Tetradium ruticarpum、Siegesbeckia orientalisL and Cyathula officinalis Kuan, on the proliferation of renal tubular epithelial cells were studied by culturing rabbit primary renal tubular epithelial cells in vitro. The effects of 3 mg/L, 30 mg / L and 300 mg / L of water extraction and alcohol extraction of the four herbal medicines on tubule epithelial cell proliferation were studied by MTT method. The results showed that 300 mg / L of the alcohol extract of T. ruticarpum and S. orientalis and the water extract of 300 mg / L of S. cuneata significantly inhibited the proliferation of primary renal tubular epithelial cells by 24.04%, 16.03% and 30.84%, respectively. 3 mg / L of the alcohol extract of S. cuneata and 30 mg / L and 3 mg / L of alcohol extract of S. orientalis showed a proliferation effect on primary renal tubular epithelial cells, and the survival rate reached 107.91%, 114.95% and 111.45%. All of the four Chinese herbal medicines had some effects on the proliferation of primary renal tubular epithelial cells in rabbit.

sargentodoxacuneata；tetradiumruticarpum；siegesbeckiaorientalisL；cyathulaofficinaliskuan； proliferation effect

2017-02-25；

2017-04-16

貴州省藥食同源資源研究開發科技創新人才團隊(黔科合人才團隊(2015)4010號)；貴州省中藥民族藥制藥工程專業學位研究生工作站(黔教研合JYSZ字[2014]002)；貴州省科技重大專項子課題(黔科合J重大字[2015]2002-3-4)；貴州省高層次創新型人才培養(黔科合人才(2015)4032號)。

R914

A

1008-0457(2017)04-0076-04 國際

10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.04.014

*通訊作者：：俸婷婷(1983-)，女，副教授，主要研究方向：中藥民族藥藥理毒理研究；E-mail： ftt0809@163.com。