pH值和干燥溫度對大便隱血檢測試劑靈敏度的影響

賈丹妮++王琳

摘 要：為研究不同的標記pH值和載金墊干燥溫度對大便隱血（FOB）檢測試劑（膠體金法）靈敏度的影響，在人血紅蛋白等電點略高處設置pH值7.5，8.0，8.5，9.0，9.5以及載金墊干燥溫度37℃和45℃，進行臨床試驗和靈敏度測試以及穩定性實驗。結果表明，所制備的大便隱血檢測試劑（膠體金法）中，標記pH=8.0-9.0的試劑靈敏度明顯高于9.0以上，載金墊37℃烘干的顯色效果明顯好于45℃烘干，其中，標記環境pH=8.5與載金墊干燥溫度37℃的靈敏度最高，可以作為大便隱血檢測試劑制備的最優工藝條件。

關鍵詞：大便隱血；pH值；干燥溫度；靈敏度

中圖分類號：R446 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2017）13-0182-04

Effect of pH and Drying Temperature on the Sensitivity of Fecal Occult Blood Diagnostic Kit

Jia Danni， Wang Lin

（PEREFCT EASE BIOTECH （BEIJING） CO.，LTD， Benjing 101111）

Abstract：This experiment designed different markup pH of Hb monoclonal antibody and drying temperature of colloidal gold cushion， to study the influence of different acid and alkali environment and gold cushion drying temperature on the sensitivity of Fecal occult blood （FOB） detection kit （colloidal gold method）. Set five pH （7.5，8.0，8.5，9.0，9.5） and two gold cushion drying temperature （37℃ and 45℃）， clinical trials and sensitivity test and stability test were carried out， the results showed that the kit sensitivity of tag pH （8.0～9.0） was significantly higher than that of above 9.0， gold cushion drying effect on 37 ℃ is significantly better than that of 45℃， among them， the tag environment pH of 8.5 and gold cushion drying temperature of 37 ℃ has the highest sensitivity， which can be used as a preparation of the optimal process conditions of Fecal occult blood diagnostic kit.

Key words：fecal occult blood；pH value；drying temperature；sensitivity

臨床數據表明，威脅人類生命的主要疾病中，大腸癌已位列前茅，其中歐美國家的大腸癌死亡率已上升到第二位[1]。大腸癌早期并無癥狀，一旦有癥狀，多數患者已達中晚期，有研究表明，大腸癌患者的早期生存率（5年）可達92%，是進展期的11倍多，因此，大腸癌的早期篩查具有非常重要的意義[2]。有研究表明，大腸癌及癌前病變的糞便隱血陽性檢出率比其他腸道疾病高，但肉眼觀察不到，因此，大便隱血是大腸癌早期的一個重要指標[3]。目前，以大便隱血為指標，較為確切有效的篩查大腸癌的方法較多，其中膠體金免疫層析檢測法的特異性和敏感性較傳統的化學方法均有提高，且敏感性高于化學法40%[4-5]。膠體金免疫層析檢測法用于定性檢測人糞便樣品中的血紅蛋白（Hb），與化學方法-聯苯胺法、鄰甲苯胺法相比，其抗干擾性強，不易受鐵劑、過氧化酶、維生素C等物質的影響，假陽性率低[6-7]；比匹拉米洞法更具靈敏度[8]。

大便隱血檢測試劑（膠體金法）的檢測效果易受制備過程中溶液酸堿度和干燥溫度的影響，本實驗以單克隆抗體標記過程中膠體金溶液pH值以及載金墊干燥過程中溫度對大便隱血成品試劑靈敏度的影響展開討論，以優化制備工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器設備

1.1.1 主要原材料

Hb單克隆抗體（包被），Boson Biotech.，Co.Ltd。

Hb單克隆抗體（標記），Boson Biotech.，Co.Ltd。

硝酸纖維素膜（NC膜），上海杰一生物生物技術有限公司。

1.1.2 實驗設備

電磁加熱攪拌器，C-MAG-MS4，廣州儀科實驗室技術有限公司。

臺式離心機，H1650-W，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

37℃恒溫培養箱，DHP-9032B，上海米青科實業有限公司。

1.2 大便隱血檢測試劑（膠體金法）的制備工藝

膠體金制備→單克隆抗體包被、標記→金標結合墊的制備→半成品、成品組裝→結果檢測。

操作要點：

膠體金制備：選擇檸檬酸三鈉還原法，用C-MAG-MS4型電磁加熱攪拌器制備膠體金溶液[9]。

單克隆抗體包被：在NC膜上質控線處包被羊抗鼠IgG，在檢測線處包被Hb單克隆抗體，過夜干燥。

單克隆抗體標記：調節膠體金溶液pH值，將純化后的Hb抗體以最佳標記量與膠體金溶液結合，并加入BSA封閉，使其終濃度為1%。14000r/min高速冷凍離心30min，棄去上清，留沉淀，并復溶至原體積的1/10。

金標結合墊的制備：在復溶后的復合物中依次加入山羊血清、膠體金工作液和吐溫20，使其占混合液比例分別為43.5%、43.5%和4.3%，混合液均勻鋪于玻璃纖維素膜上，使其浸透后置于干燥箱烘干。

1.3 膠體金溶液pH值和載金墊干燥溫度的設定

一般認為，單克隆抗體標記的最適pH應在蛋白質等電點（pI）略偏堿的條件下，蛋白質和膠體金才能牢固地結合，而選擇最適pH值時，pH遠大于pI的膠體金顆粒也不會聚沉，外觀上與略偏減條件下顏色差別不大[10]。人血紅蛋白等電點為7.23，本實驗在大于其等電點處，設計五個不同pH值。標記Hb單克隆抗體前，預先加入不同量的0.2M K2CO3調節膠體金溶液pH值分別為7.5，8.0、8.5、9.0、9.5。以烘干方式干燥載金墊的溫度一般不超過50℃，因此，按照工藝條件標記抗體，鋪制載金墊后分為兩批，設置兩個溫度，一個接近人體溫（37℃），另一個設為45℃，烘箱干燥1h。

1.4 成品試紙條組裝

將干燥后的載金墊與樣品墊、吸水濾紙一起粘貼于帶有NC膜并包被了Hb單克隆抗體的PVC底板上，彼此之間留有1～2mm的重疊；切條寬度為4mm，組裝于扣板內。如圖1所示。

2 結果與分析

2.1 臨床樣本檢測

有研究表明，便隱血實驗的陽性結果與大腸癌發生部位無關[11]，故收集臨床已確診且有完整資料的大腸癌患者的大便樣本130份（其中包括直腸癌和結腸癌樣本各65份）；收集正常人的大便樣本42份。即陽性樣本130份，陰性樣本42份。用五個pH及兩個烘干溫度條件下制備的大便隱血檢測試劑分別檢測上述臨床樣本，10min內判讀結果，并與萬華普曼生物工程有限公司試劑的檢測效果對比，結果如表1、表2、表3。

由表1、2結果可知，上述pH=7.5，烘干溫度37℃和45℃條件下制備的試劑分別出現了2例和1例假陽性，其他四種條件下制備的試劑對正常人的大便樣本全部判斷正確，無假陽性出現；對臨床陽性樣本的檢測準確率均在90%以上，其中以pH=8.5，烘干溫度37℃檢測準確率最高（99.23%）；對陽性樣本的檢測準確率，除pH=9.5分別與pH=8.0-9.0的有差異（p<0.05），其他兩兩之間均無顯著差異（p>0.05），表明pH=9.5條件下制備試劑的檢測準確率較低。進而與已上市的萬華普曼生物工程有限公司試劑檢測結果對比，結果見表3，表明在PH=8.0-9.0制備的試劑已接近其效果，可以作為診斷大便隱血的依據。

2.2 靈敏度檢測

用1.3中不同標記pH值以及載金墊烘干溫度下制備的大便隱血（FOB）檢測試劑（膠體金法），檢測不同濃度的FOB標準品，10min內判讀，檢測結果如表4。

由表4可見，本研究制備的大便隱血（FOB）檢測試劑，標記pH=8.0-9.0的試劑靈敏度明顯高于9.0以上，37℃烘干的顯色效果明顯好于45℃烘干；pH=7.5制備的試劑剛好能達到200ng/ml（國家限定標準），但2.1中其檢測準確率較低；pH=9.0，37℃烘干制備的最低檢測限可達150ng/ml；pH=9.5制備的未能達到200ng/ml（國家限定標準）；pH=8.0制備的最低檢測限為120ng/ml；pH=8.5，37℃烘干制備的最低檢測限可達110ng/ml，已經低于國家限定標準200ng/ml，靈敏度較高，適合檢測微量大便隱血。

2.3 37℃加速穩定性研究

對制備試劑的穩定性進行考察，于37℃恒溫培養箱加速培養，分別在5天，10天，15天，20天，25天取出測試，結果標記pH=8.0，8.5，9.0制備的試劑在25天時仍與初始檢測樣品檢測結果的符合率為100%，穩定性較好；標記pH=7.5和9.5的試劑在分別在15天和10天時，靈敏度和清晰程度已達不到初始效果。

3 討論

上述實驗結果表明，本研究制備的大便隱血檢測試劑（膠體金法）檢測準確率已接近市售試劑。

靈敏度檢測結果顯示，標記pH=9.0以上制備的試劑，陽性結果的質控線和檢測線清晰程度均較弱；pH=8.0和pH=8.5制備的試劑，在標準品濃度≧150ng/ml時，均顯示強陽性，120ng/ml時才顯示弱陽；pH=7.5制備的試劑，靈敏度剛好達到200ng/ml，且檢測準確率較低，可能其酸堿度，還未達到最適，性能不太穩定；而載金墊烘干溫度為37℃，pH=8.5的最低檢測限可達110ng/ml。

同一濃度下，檢測線的清晰程度不同，pH=9.0以下的明顯比pH=9.0以上的清晰，可能是因為膠體金溶液pH值過高，遠大于人血紅蛋白的等電點（7.23），此時蛋白整體帶負電荷，而膠體金顆粒也帶負電荷，二者互相排斥，而且蛋白此時比較親水，吸附金顆粒所需的疏水作用和靜電作用都減弱，特異性反應也減弱；而pH=8.0和pH=8.5的膠體金溶液環境略高于蛋白等電點，蛋白中部分氨基酸帶負電，被金顆粒排斥，而某些等電點較高的氨基酸仍帶正電，能較好的吸附到金顆粒表面，這樣氨基酸序列可以得到充分延展，此分段氨基酸序列的表征有利于特異性結合位點的暴露[12]。此時蛋白比較疏水，疏水作用力使蛋白與金顆粒更加牢固的結合。

靈敏度檢測結果顯示，同一pH下，37℃靈敏度高于45℃，可能是因為37℃更適合蛋白吸附作用的環境，膠體金有吸附酶的特性，并能保持其特性[13]。有研究表明，溫度對蛋白質的吸附影響較大，載金墊干燥溫度高于37℃時可能吸附量可能已經達到飽和，45℃時抗體蛋白可能已經部分變質，與膠體金結合能力減弱[14]。

4 結語

綜合分析與討論的結果，標記抗體時pH=8.0和pH=8.5的膠體金溶液制備的大便隱血（FOB）檢測試劑（膠體金法）靈敏度均較高，可達120ng/ml，其中pH=8.5，載金墊烘干溫度37℃的靈敏度最高，最低檢測限可達110ng/ml，表明適當的標記pH值和金墊烘干溫度可以共同影響大便隱血檢測試劑的靈敏度。檢測時選擇pH=8.5，載金墊烘干溫度37℃的條件，有利于大便中極微量隱血的檢測，適于大腸癌以及癌前病變篩查時現場大批量使用，特別是基層醫療機構和醫療資源缺乏的亞太地區，為有腸胃道疾病潛在風險的患者提供及早就醫的診斷依據[15]。

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