梨樹CDPK基因家族進化和表達分析

韓艷麗，李 靜，操慶國，徐 銀，顏志明,2

(1.江蘇農林職業技術學院，江蘇鎮江 212400；2.江蘇現代園藝技術中心，江蘇鎮江 212400)

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梨樹CDPK基因家族進化和表達分析

韓艷麗1，李 靜1，操慶國1，徐 銀1，顏志明1,2

(1.江蘇農林職業技術學院，江蘇鎮江 212400；2.江蘇現代園藝技術中心，江蘇鎮江 212400)

鈣依賴蛋白激酶(CDPK或CPK)在植物生長和發育、逆境信號刺激及其對病原物的防御反應過程中發揮著非常重要的作用。本研究利用梨樹全基因組數據，采用生物信息學的方法，在全基因組水平上對梨樹CDPK基因家族進行系譜進化關系、基因結構、共線性關系及表達情況等分析。結果表明，梨樹基因組中共存在31個CDPK基因，命名為 PbCDPK1 ～ PbCDPK31。系譜分析結果表明，這些CDPK基因歸屬于4個亞家族。共線性分析檢測到12對CDKP基因間存在顯著的共線性關系，其中10對由最近一次發生的全基因組復制事件形成。非同義/同義置換率的比率(dN/dS)說明CDPK基因在功能上進化得非常保守。熒光定量PCR結果發現，5個梨樹CDPK基因對干旱逆境有響應。試驗結果可為進一步開展梨樹CDPK基因家族的功能鑒定和分子進化機制的研究提供參考。

梨樹；CDPK基因；生物信息學；進化；干旱

植物的生長發育和作物產量往往受到外部逆境的影響，這些因素包括干旱、低溫、高鹽、病原體感染，微生物誘導等。植物體自身形成了一套復雜的信號網絡途徑來適應多變的外界環境[1]。鈣離子(Ca2+)作為第二信使，在細胞信號轉導途徑中發揮重要作用[2]。在植物中，各種不同的內源和外部信號，如光照、激素、生物脅迫及非生物脅迫都會觸發胞漿Ca2+濃度的變化。這些鈣信號被不同Ca2+傳感器分子傳導到下游的信號級聯反應，如目標蛋白磷酸化等。鈣依賴蛋白激酶(CDPK或CPK)是植物中研究最為深入和廣泛的Ca2+傳感器之一。到目前為止,已經在植物界(從綠藻到顯花植物)以及原生生物中都發現了CDPK。CDPK蛋白包含一個N-端可變區域、有催化活性的蛋白激酶區、自抑制區以及包含EF-hand模塊(結合Ca2+)的CaM區[3]。CDPK獨特的結構使它同時具備Ca2+感應器和效應器的功能。CDPK通過解除其自抑制的機制使其具有活性。

大量研究表明，CDPK在植物的生長和發育、環境信號刺激及其對病原物的防御反應過程中發揮著非常重要的作用。擬南芥AtCPK1的過量表達顯著提高了NADPH氧化酶活性[4]，激活苯丙氨酸氨基水解酶PAL(Phenylalanine ammonialyase)，導致水楊酸(SA)的積累[5]。AtCPK5能激活呼吸氧化酶同系物D(RBOHD)[6]，從而誘導活性氧(ROS)爆發。 AtCPK4/11/23通過調控K+通道提高植物的抗鹽性[7]。CDPKs也在激素(如ABA、MeJA和乙烯等)信號傳導中起著重要作用[8-9]。此外，一些CDPK基因還參與植物根部發育和花粉管生長[10-11]。編碼CDPK的基因以多基因家族的形式存在，目前，在擬南芥基因組中共發現32個CDPK基因成員[12]，水稻中檢測到31個CDPK基因成員[13]。

梨樹在世界果樹生產中占有重要的位置，具有很高的經濟價值。梨樹全基因組序列雖已公布，但梨樹CDPK基因家族的系統分析還未見報道，CDPK響應非生物脅迫的研究處于起步階段。本研究在全基因組水平上識別和分析梨樹CDPK基因家族，對其進行系譜發生、共線性和表達特性等方面的分析，以期為進一步開展梨樹CDPK基因家族的基因功能和分子進化機制的研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為‘碭山酥梨’幼苗，由江蘇農林職業技術學院保存，挑選長勢一致的無菌植株移至霍格蘭培養液培養7 d進行緩苗。將幼苗置于濾紙上，對植物材料進行干旱處理，分別在0、2、4和8 h后收集葉片于液氮速凍，用于RNA提取和基因表達分析。每個時間點設3個生物學重復。

1.2 數據收集和搜索

從Pear Genome Project(http://peargenome.njau.edu.cn)下載梨(Pyrusbretschneideri)全基因組的注釋序列。從Pfam數據庫(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)中下載kinase(PF00069)和EF-hand(PF13499)結構域的隱馬可夫模型(HMM)。用HMMER3(http://hmmer.janelia.org/)軟件包以隱馬可夫模型對梨樹基因組進行搜索，所用選項為“cut_ga”。得到的基因提交到InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)搜索結構域進行驗證。

1.3 系譜發生分析

以CDPK基因的全長氨基酸序列作多序列聯配，所用軟件為MUSCLE[14]，參數使用默認值。根據多序列比對的結果，使用MEGA6構建系統發生樹，所用算法為鄰近法(neighbor joining，NJ)，對構建的樹進行自舉檢驗，重復設為1 000。

1.4 共線性檢測和dN/dS估算

對CDPK各成員間進行共線性檢測，所用軟件為MicroSyn[15]。采用該軟件檢測各基因所在基因組區段之間同源基因在數量和順序上的保守程度。使用PAML軟件包的codeml程序[16]進行計算。同義置換率 dS(synonymous)和非同義置換率 dN(nonsynonymous)

1.5 熒光定量PCR

利用CTAB法提取梨葉片的總RNA，利用PrimeScript○RRT reagent Kit反轉錄cDNA。運用軟件Beacon Designer 7.0對全長CDPK基因特異的區域設計引物(表1)。常用的看家基因(actin，GenBank登錄號 GU830958)作為熒光定量PCR(qPCR)的內參基因。反應程序為：預變性4 min，95 ℃;變性40 s，95 ℃；退火20 s，60 ℃；延伸30 s，72 ℃；38個循環；熔解曲線溫度為65～95 ℃，反應程序為15 s，94 ℃，1 min，60 ℃，15 s，95 ℃。所有的反應重復3次。以0 h收集的葉片作為對照，根據2-ΔΔCt的方法分別計算干旱處理2 h、4 h、8 h樣品中各基因的相對表達量。

表1 實時熒光PCR引物序列Table 1 Primer sequence for real-time PCR analysis

2 結果與分析

2.1 梨樹中CDPK基因的鑒定

本研究以Ser/Thr蛋白激酶區和EF-hand模塊的HMM在梨全基因組蛋白序列中進行搜索，并用InterProScan對蛋白的結構進行驗證，共獲得31個梨樹CDPK基因。根據基因與HMM相似性的大小，將這些CDPK基因命名為 PbCDPK1 ～ PbCDPK31(表2)。

2.2 系譜發生分析

為了考察CDPK基因家族在梨樹中的系譜發生關系，在多序列聯配的基礎上，以NJ法構建CDPK基因家族的系譜發生樹。為了更好地對梨樹CDPK基因家族進行分類，以31個梨樹CDPK基因和32個擬南芥CDPK基因作聯合系譜發生樹(圖1)。根據自舉值的大小(一般>50%)和擬南芥CDPK基因的分類信息，將梨樹CDPK基因分為4個亞家族，分別命名為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。亞家族Ⅰ中含有12個CDPK基因，亞家族Ⅱ具有5個成員，亞家族Ⅲ存在12個CDPK基因，而亞家族Ⅳ中只存在2個基因。

表2 梨樹CDPK基因家族成員基本信息Table 2 Characteristics of CDPK genes in pear

圖1 梨樹和擬南芥中CDPK蛋白的聯合系譜發生樹Fig.1 Joined phylogenetic tree of CDPK proteins in pear and Arabidopsis

2.3CDPK基因外顯子/內含子結構

梨樹CDPK基因內含子數目為6、7、9和11個。在進化樹中，親緣關系靠近的成員具有相同的內含子數目和相位(圖2)。亞家族Ⅰ包括12個梨樹基因，其中9個基因具有6個內含子，并且內含子的相位相同。值得注意的是，亞家族Ⅰ中有3個基因無含子插入，這種無內含子的CDPK只在薔薇科植物中發現，可能薔薇科植物中CDPK基因發生了內含子的丟失事件。所有亞家族Ⅱ中的梨樹CDPK基因均由7個內含子組成，并且內含子相位相同。亞家族Ⅲ中除了3個基因外，均具有7個內含子。亞家族Ⅳ中2個梨樹CDPK基因的內含子數目最多，為11個。各個亞家族成員內含子數目和插入相位的保守性說明基因結構在各亞家族內的保守性。

梨樹和擬南芥CDPK基因按圖1進化樹中的順序排列CDPKgenes on the left was arranged in Fig. 1；外顯子以方形表示，連接外顯子的線則表示內含子 Exon is represented by box and line connecting two exons represents an intron；黑色方形表示蛋白激酶結構域 Protein kinase domain was marked by black color
圖2 梨樹CDPK基因內含子-外顯子
Fig.2 Schematic representations of exon-intron compositions ofCDPKgenes in pear andArabidopsis

2.4 共線性分析

由基因組或基因組片段復制導致的同源基因，不僅表現為基因序列具有相似性，而且其染色體上相鄰基因的排列序列具有很高的一致性。這種基因排列的保守性稱為共線性。本研究利用MircoSyn軟件對31個CDPK基因的基因組區段之間進行共線性分析。結果表明，在梨樹基因組內，12對CDKP基因間存在顯著的共線性關系(表3)。為了估算CDPK基因間復制事件發生的大致時間，筆者考查了CDPK基因間共線性區段內同源基因的平均同義置換率。結果發現，10對CDPK基因共線性區段間的dS在0.06～0.38 的范圍內(表3)，而有2對基因間的dS值大于0.57。非同義/同義置換率的比率(dN/dS)可在蛋白水平上度量選擇壓力。12對存在共線性關系的CDKP基因對的dN/dS均遠小于1，說明CDPK基因在進化上非常保守，氨基酸在純化選擇(負選擇)壓力下保守地突變。

表3 梨樹各CDPK基因之間的共線性關系及非同義置換率(dN)和同義置換率(dS)Table 3 Synteny related to genes in CDPK gene family in pear

2.5 表達分析

通過對擬南芥中同源基因的功能以及梨樹CDPK基因的進化分析后發現， PbCDPK10、 PbCDPK22、 PbCDPK27、 PbCDPK5和 PbCDPK7很可能與梨樹逆境信號轉導有關(見討論)。選取這5個CDPK基因，通過qPCR技術考查它們在表達水平上是否響應干旱逆境。結果發現，干旱處理能顯著影響這5個基因的表達，并具有類似的表達模式(圖3)。干旱處理2～4 h，每個基因的表達開始上升，但沒有顯著的變化，在處理8 h后表達水平顯著高于對照，最高為處理的8.7倍。

3 討 論

CDPK蛋白由多基因家族編碼，廣泛存在于植物中。本研究在梨基因組中共發現31個CDPK基因。在目前已測序的薔薇科植物中，草莓、桃和蘋果中分別存在15、15和26個CDPK基因。梨樹和蘋果中的CDPK基因數目接近，是草莓和桃的2倍左右。據報道，在顯花植物中，物種特異性的全基因組復制事件通常導致基因家族成員數目在不同物種間的差異[17]。在薔薇科植物中，梨樹和蘋果樹的基因組比草莓和桃多發生了一次全基因組復制[18]。這個復制事件很可能是導致梨樹和蘋果樹中CDPK基因家族數目增加的主要原因。

H2、H4和H8分別表示脫水處理2、4和8 h H2, H4, and H8, dehydrated for 2, 4, 8 h；對照(CK)的表達量標準化為1 Expression of control (CK) was normalized to 1
圖3 定量 RT-PCR 表達分析5個梨樹CDPK基因在轉錄水平上對干旱處理的響應
Fig.3 Quantitative RT-PCR analysis of 5PbCDPKgenes expression response to drought stress

為了初步推測梨樹CDPK基因的功能，把梨樹31個CDPK基因和擬南芥的32個CDPK基因作聯合系譜發生樹分析。通過進化樹的構建,可以分析分子之間的起源關系,預測分子的功能。同一亞家族或小的分枝往往具有相似的功能。另外，據報道，在梨樹基因組序列中保留了發生2次全基因組復制的證據，一次為“古代六倍體化”事件(大約140百萬年前)和最近一次發生的全基因組復制事件(30～45百萬年前)。通過分析CDPK基因所在染色體區段內的共線性，可以推測這些基因的起源及復制時間等特性。在梨樹基因組內，在10對存在顯著的共線性關系的CDKP基因間，其共線性區段間同義置換率較小(0.06～0.38)，很可能由最近一次發生的全基因組復制事件形成，而另外2對CDPK基因共線性區段間的dS較大，說明它可能起源于較古老的“古代六倍體化”基因組復制事件。

據報道，在擬南芥32個CDPK成員和31個水稻CDPK成員中，多數CDPK與逆境信號轉導有關[19]。Sheen[20]發現，在干旱和鹽誘導條件下，擬南芥AtCPK1和AtCPK2的表達量顯著增加,而擬南芥 AtCPK10和 AtCPK30參與了對ABA和非生物脅迫的信號轉導。本研究中發現，在梨樹和擬南芥CDPK的進化樹中，AtCPK1和AtCPK2為1對直系同源基因，和AtCPK1和AtCPK2最同源的梨樹基因為 PbCDPK10、 PbCDPK22和 PbCDPK27。而這3個梨樹CDPK基因由最近發生的一次全基因組形成，基因間的dN/dS均遠小于1，說明它們在純化選擇壓力下進化得非常保守。 AtCPK10和 AtCPK30也為1對直系同源基因，而 PbCDPK5和 PbCDPK7跟 AtCPK10和 AtCPK30的親緣關系最近，它們也是由最近發生的一次全基因組復制形成，并且基因間的dN/dS均遠小于1。這些證據表明 PbCDPK10、 PbCDPK22和 PbCDPK27以及 PbCDPK5和 PbCDPK7很可能與梨樹逆境信號轉導有關。qPCR試驗結果發現，在干旱處理8 h后，這5個基因的表達量顯著提高，說明通過系譜發生樹、共線性和選擇壓等分析推測的CDPK基因的功能和試驗結果較為一致。

4 結 論

在梨樹基因組中共存在31個CDPK基因，歸屬于4個亞家族。在梨樹基因組內，12對CDKP基因間存在顯著的共線性關系，其中10對由最近一次發生的全基因組復制事件形成，而另外2對CDPK基因可能起源于較古老的“古代六倍體化”基因組復制事件。梨樹CDPK基因在功能上進化得非常保守。通過系譜發生樹、共線性和選擇壓等分析推測 PbCDPK10、 PbCDPK22、 PbCDPK27、 PbCDPK5和 PbCDPK7可能與梨樹逆境信號轉導有關。qPCR試驗在表達水平上表明這5個梨樹CDPK基因對干旱逆境有響應。本試驗結果可為進一步開展梨樹CDPK基因家族的功能鑒定和分子進化機制的研究提供參考。

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(責任編輯：潘學燕 Responsible editor:PAN Xueyan)

Evolution and Expression Analysis ofCDPKGene Family in Pear (Pyrusspp.).

HAN Yanli1,LI Jing1,CAO Qingguo1,XU Yin1and YAN Zhiming1,2.

(1.Jiangsu Polytechnical College of Agriculture and Forestry,Zhenjiang Jiangsu 212400, China; 2.Jiangsu Engineering and Technology Center for Modern Horticulture，Zhenjiang Jiangsu 212400，China)

Calcium-dependent protein kinase (CDPK or CPK) plays important roles in plant growth and development, stress response, and immune and defense signaling, etc. This study aims to provide valuable foundation for further study of biological function and evolutionary relationship in this family. Bioinformatic method was used to comprehensively analyze phylogenetic relationship, synteny relationship and expression pattern ofCDPKgene family in pear (Pyrusspp.).A total of 31CDPKgenes were identified in pear, namely PbCDPK1- PbCDPK31, and they were phylogenetically clustered into 4 subfamilies. The synteny relationship showed that significant synteny relationship were detected within 12CDPKgene pairs, of which 10 were evolved form the recent whole genome duplication event. Purifying selection also played a critical role in the function evolution ofCDPKfamily genes through nosynonymous/synonymous substitution analysis. FiveCDPKgenes responded to drought stress based on the quantitative real-time RT-PCR (qPCR). The results of this study might lay a significant foundation for further studies on the gene functions and molecular evolutionary mechanism ofCDPKgene family in pear.

Pear (Pyrusspp.);CDPKgene; Bioinformatics; Evolution; Drought

2016-03-30 Returned 2016-05-20

Jiangsu Natural Science Foundation(No.BK20131243); Jiangsu Sanxin(Three New)Agricultural Project(No.SXGC[2015]311); Qinglan Project of Jiangsu Province.

HAN Yanli, female, master. Research area:fruit molecular biology.E-mail:45600134@qq.com

日期：2017-06-29

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170629.1108.020.html

2016-03-30

2016-05-20

江蘇省自然科學基金(BK20131243)；江蘇省農業三新工程(SXGC[2015]311)；江蘇省青藍工程。

韓艷麗，女，碩士研究生，研究方向為果樹分子生物學。E-mail: 45600134@qq.com

S661.2

A

1004-1389(2017)07-1026-07