壺天宮鐘乳石變色原因的探究

肖樂天

研究背景

暑假，我到位于安徽省廣德縣的太極洞旅游。在參觀洞區代表性景觀之一壺天宮時，發現洞內鐘乳石為黑褐色，十分突兀。詢問導游、景區工作人員，他們也覺得很蹊蹺，很可惜弄不清具體原因。景區已做了不少工作以清除這些污垢，但效果并不理想。不過，通過交流，我得知了一個事實：壺天宮內鐘乳石早前也和其他溶洞內鐘乳石一樣呈現乳白色，但壺天宮后來曾被當作酒窖貯存原酒。不知是不是巧合，在貯酒一段時間后鐘乳石表面開始出現一些黏稠的東西，顏色逐步加深，最終成為現在的樣子（圖1）。游覽結束后，我一直在想，原本漂亮的鐘乳石為什么會在窖酒后就變成黑褐色呢？這些黏稠黑褐色物質是怎么產生的？這一系列的問號激發了我深入探究的濃厚興趣。

我首先在網上仔細搜索，發現與之有關的文獻記錄、研究資料都十分稀少。由于鐘乳石顏色改變是在貯藏白酒原酒后發生的，因此我判斷這可能是因貯藏白酒前后，洞內生態環境發生改變所致。通過實地采集樣品、顯微鏡初步觀察、微生物分離純化等實驗和分析，我初步判斷壺天宮鐘乳石變色是由溶洞生態環境改變引發微生物大量滋生導致的。

實驗過程

黑褐色物質的采集

用無菌采樣棉簽挑取覆蓋在鐘乳石表面的黑褐色物質適量，轉入無菌處理的采樣瓶中，密封后低溫保存于裝有冰袋的保溫盒內，帶回實驗室4℃保存備用。

黑褐色物質的初步顯微觀察

將黑褐色物質用無菌生理鹽水適當稀釋后，取100uL涂布在載玻片并置于載物臺上；調節顯微鏡直至視野內看到清晰的物像，拍照記錄；更換油鏡，在要觀察的位置上滴加1滴香柏油，再反復調節至看清楚標本止，拍照記錄。

微生物的分離純化

Luria-Bertani（LB）固體培養基平板的制備

分別稱取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g、瓊脂15g，加蒸餾水定容至1L，于115℃高壓滅菌30min。冷卻至50℃左右后，在超凈臺上倒制平板，完成后存放于4℃冰箱備用。

微生物的分離培養及初步篩選

在超凈工作臺上稱取適量黑褐色物質，加入1 mL無菌水，用移液器反復吹吸，直至樣品混合均勻。取1000uL加到盛有9000uL無菌水的離心管內，稀釋10倍制成稀釋度為10的懸液。同法按每級稀釋10倍的次序得到10、10的稀釋液。用移液器分別吸取10、10、10倍稀釋液100uL涂布于LB平板上，25℃倒置培養。

分離微生物的純化

在超凈工作臺上，從涂布平板上選取大小和形態各不相同的單菌落，用接種環在其表面挑取少量菌體，在平板上劃線。將劃線后的LB平板放于25℃培養箱，倒置培養。

分離微生物的革蘭氏染色及觀察

先用草酸銨結晶紫進行初染，再用盧革式碘液媒染，然后用95%乙醇脫色，最后用番紅溶液復染。用吸水紙吸掉載玻片上水膜，待染色標本干燥后置光學顯微鏡下觀察，方法同上。

分離微生物菌株的保藏

用無菌牙簽在分離良好的菌落表面挑取少許樣品，投入裝有LB培養液的試管中，蓋上管塞，于25℃、200rpm振蕩培養10h。用移液器吸取培養物850uL，加入盛有150uL無菌甘油的冷凍管中，混合均勻，置-70℃冷凍保藏。

分離菌株的透射電鏡觀察

取100uL培養24h后的菌液于無菌離心管中，滴加100uL2%磷酸鎢染色液于樣品中混勻。染色20min后，用銅網取樣后晾干，交給教師放置于電鏡樣品室內進行觀察照相。

實驗結果

黑褐色物質特征

黑褐色樣品外觀黏稠，手感滑膩，有腐臭味。光學顯微鏡觀察顯示其中含有類似微生物細胞的深色不規則顆粒物和桿狀物。

黑褐色物質稀釋培養

在LB培養基中對黑褐色物質中的微生物進行了分離培養。結果顯示，培養基上沿劃線痕跡處形成了菌落，其分布由密集逐步稀疏，最后形成獨立的單菌落。根據菌落形態大小的差異，我們分離獲得了4株微生物，分別命名為H1、H2、H3和H4（見圖2）。

分離菌株初步染色觀察

對分離純化的菌株進行革蘭氏染色，經光學顯微鏡觀察顯示，4株菌株細胞形態各異，均顯示為紫色，表明分離獲得的菌株可能為來自不同種屬的革蘭氏陽性細菌。

透射電鏡觀察

與光學顯微鏡觀察結果一致，透射電子顯微鏡觀察結果顯示4株細菌體外均被莢膜包裹（見圖3），且部分菌株有長鞭毛。

討論

太極洞景區的壺天宮曾被開發用于洞藏白酒原酒。然而，隨著貯酒年份的增加，洞內鐘乳石表面逐漸生成一層黏稠物質。隨著時間延長，該物質的顏色發生變化，致使鐘乳石由原初的乳白色變為黑褐色。如何修復受損的鐘乳石成為景區亟待解決的難題。因此，探索壺天宮貯酒后鐘乳石變黑成因，不僅可為該景點的修復提供理論依據，也可為其他溶洞資源的開發利用和保護管理提供科學指導。不同于相關溶洞中鐘乳石污染的報道，在壺天宮用于貯藏白酒原酒的2年問，洞內鐘乳石表層逐漸被一層黑褐色的黏稠物質包裹。可以推斷，黑褐色物質的形成與貯酒行為直接相關。對鐘乳石上黑褐色黏稠物質的顯微鏡檢查結果顯示，黏稠物質中包含少量細菌和疑似微生物細胞碎片物，提示黑褐色物質可能來源于微生物。然而，實驗室培養條件下的微生物細胞及裂解物均為無色或其他顏色，并非目前所見的黑褐色黏稠物質。如果黑褐色物質來源于微生物，它們是怎樣形成的呢？

結合溶洞的生態環境和觀察的實驗結果，推測黑褐色物質的形成過程如下：溶洞內環境相對封閉，經過長時間的自然修飾和適應，形成了穩定、獨特的微生態環境，各種生物特別是微生物之間相互制約，處于平衡狀態。在寡營養、高濕度、低氣溫條件下，溶洞內微生物生長緩慢，總量處于較低水平，覆蓋在鐘乳石表面的微生物及其裂解產物可被溶洞環境及時有效轉化，或（和）被新形成的鐘乳石覆蓋，雖經幾萬甚至幾十萬年時間，鐘乳石表面依舊呈現天然乳白色。

然而，當白酒原酒貯藏于相對封閉的溶洞后，酒壇內易揮發的酒精等物質就會逐漸擴散積累，濃度不斷增大，加之高濕環境，大量的揮發物質隨水蒸氣凝結在洞內石山、石乳、石罩等之上，為微生物的生長提供了充足營養，導致某些類群的微生物大量過度繁殖；而另一些類群的微生物則逐漸處于劣勢，甚至死亡，從而改變了原有微生物群落結構，微生物之間及微生物與環境之間的平衡遭到破壞。最終，由于過量繁殖的微生物及其裂解產物無法完全被環境轉化，于是不斷積累在鐘乳石表面，其中含有的脂肪、碳水化合物等物質，在空氣中氧的作用下，逐漸變黑，并與水混合，形成黑褐色黏稠物質。

該項目獲得第30屆全國青少年科技創新大賽創新成果競賽項目中學組微生物學一等獎。

專家評語

該項目從開始的好奇探究到思考，符合中學生的思維和知識水平。研究內容合理，技術方法規范，有地方特色。建議利用分離的菌株進一步侵染鐘乳石，模擬洞中的條件，以驗證本項目分離鑒定出的微生物是否為鐘乳石變色的原因。