信號傳導與轉錄激活因子3在乳腺癌中的表達及其與人基質金屬蛋白酶2、9的關系研究

胡慧 韋偉 易辛 馮瑰麗

·論著·

信號傳導與轉錄激活因子3在乳腺癌中的表達及其與人基質金屬蛋白酶2、9的關系研究

胡慧 韋偉 易辛 馮瑰麗

目的 觀察乳腺癌組織中信號傳導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)的表達，分析其與患者臨床特征的關系。方法 應用免疫組織化學法(EnVision)檢測23例乳腺癌患者癌組織中STAT3、白細胞介素-6(interleukin，IL-6)、人基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2和MMP-9的表達情況，并分析其與患者臨床病理特征的關系。結果 浸潤性癌組織中STAT3表達高于非浸潤性癌。23例乳腺癌組織中IL-6表達陽性11例，陽性率47.83%；MMP-2陽性10例，陽性率43.48%；MMP-9陽性9例，陽性率39.13%；STAT3陽性表達與浸潤型乳腺癌有統計學差異(χ2=7.738，P<0.05)，兩者呈正相關(r=0.161，P<0.05)；STAT3陽性表達與IL-6陽性表達無相關性(r=0.032，P>0.05)，與MMP-9(r=0.537，P<0.05)和MMP-2(r=0.649，P<0.05)陽性表達呈正相關。結論 STAT3與乳腺癌的浸潤侵襲有關，其可能是通過調節MMP-2和MMP-9的表達控制乳腺癌的侵襲和轉移。

乳腺癌； 信號傳導與轉錄激活因子3； 侵襲； 基質金屬蛋白酶-9； 基質金屬蛋白酶-2

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發病率均居女性癌癥第1位，手術、放化療及靶向治療與內分泌治療是目前臨床最有效的治療手段[1-2]，但仍有近17.0%的乳腺癌患者死于乳腺癌轉移[3-4]。腫瘤干細胞假說認為，在腫瘤組織中存在一小部分具有自我更新和多向分化能力的細胞，并且生長不受控制。術后殘留的靜止期癌細胞可能為腫瘤干細胞，成了復發和轉移的根源。研究表明，乳腺癌干細胞自我更新和增殖與信號轉導和信號傳導與轉錄激活因子3(STAT3)有密切關系[5]。研究發現，細胞外基質的破壞在腫瘤浸潤和轉移中扮演重要角色，而基質金屬蛋白酶類(matrix metalloproteinases，MMPs)是參與破壞細胞外基質的主要蛋白酶類，特別是MMP-2和MMP-9，與腫瘤的浸潤和轉移關系密切[6-7]。我們對23例乳腺癌患者腫瘤組織中STAT3的表達進行檢測，分析在乳腺癌中STAT3的表達與患者臨床特征的相關性。

對象與方法

一、對象

2015年8月～2016年8月，我院收治的新發乳腺癌且有完整臨床及病理資料的患者23例，均為女性，絕經后13例，年齡30～71歲，平均年齡(54.48±4.74)歲。其中T1 9例，T2 11例，T3 3例。N0 6例，N1 1例，N2 5例，N3 11例。分子分型：HER-2過表達型2例，Luminal A型4例，Luminal B型13例，三陰性型 3例。浸潤性乳腺癌20例，非浸潤性乳腺癌3例。標本采集符合北京大學深圳醫院倫理委員會規定及赫爾辛基宣言。

二、方法

1.實驗儀器與試劑：兔抗人單克隆抗體IL-6、STAT3、MMP-2和MMP-9均購自Proteintech(芝加哥，美國)，抗兔/鼠通用型免疫組合試劑盒(REAL TMEnVision+/HRP RABBIT/MOUSE，Dako，丹麥)山羊血清、DAB顯色液、蘇木精均購自康為世紀(北京，中國)。

2.免疫組織化學分析乳腺癌組織中相關蛋白表達情況：組織4%多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋，切片，常規脫蠟水化，抗原修復，正常山羊血清封閉20分鐘后孵育IL-6(1∶200)、STAT3(1∶200)、MMP-2(1∶200)、MMP-9(1∶200)一抗過夜，PBS洗3次，每次5分鐘，37度孵育二抗30分鐘，PBS洗3次，每次5分鐘，DAB顯色5到10分鐘，PBS洗10分鐘，蘇木精復染，鹽酸酒精分化，自來水沖洗10分鐘，脫水，透明，封片，鏡檢。

3.免疫組化染色陽性結果判斷：IL-6、STAT3、MMP-2、MMP-9蛋白檢測以細胞漿出現棕黃色顆粒為陽性，根據每張切片細胞的陽性強度按無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別打分0，1，2，3分；根據著色面積按無著色、著色<1/3、著色1/3～2/3、著色>2/3分別評0，1，2，3分。最終根據兩項總分判定結果：<3分為陰性，≥3分為陽性。

三、統計學分析

結 果

1.STAT3蛋白表達及患者臨床病理特征分析：23例乳腺癌組織中STAT3陽性表達8例，其中浸潤性癌7例，非浸潤性癌1例，陽性率34.78%(圖1)。非浸潤性癌STAT3陽性表達與浸潤型乳腺癌比較，差異有統計學意義(χ2=7.738，P<0.05)，Spearman相關性分析顯示，兩者呈正相關(r=0.161，P<0.05)。與患者年齡、絕經與否、乳腺癌分期、乳腺癌分型、腫瘤大小、淋巴結轉移和遠處轉移等比較均無統計學差異，亦無顯著相關性(表1)。

表1 STAT3表達與患者臨床特征的關系

2.STAT3表達與IL-6、MMP-9、MMP-2表達相關性分析：23例乳腺癌患者腫瘤組織中，IL-6表達陽性11例，陽性率47.83%；MMP-2陽性10例，陽性率43.48%；MMP-9陽性9例，陽性率39.13%(圖2、3、4)。使用Spearman相關系數進一步分析STAT3與IL-6、MMP-9、MMP-2的相關性，結果顯示，STAT3陽性表達與IL-6陽性表達無顯著相關性(r=0.032，P>0.05)，與MMP-9(r=0.537，P<0.05)和MMP-2(r=0.649，P<0.05)陽性表達呈顯著正相關(表1)。

A：STAT3表達陰性，細胞漿淡黃色，著色面積<1/3(× 200倍，DAB染色)；B：STAT3表達陽性：細胞漿棕褐色，著色面積>2/3(× 200倍，DAB染色)圖1 STAT3在乳腺癌組織中表達

A：IL-6表達陰性，細胞漿淡黃色，著色面積<1/3(× 200倍，DAB染色)；B：IL-6表達陽性：細胞漿棕褐色，著色面積>2/3(× 200倍，DAB染色)圖2 IL-6在乳腺癌組織中表達

A：MMP-2表達陰性，細胞漿淡黃色，著色面積<1/3(× 200倍，DAB染色)B：MMP-2表達陽性：細胞漿棕褐色，著色面積>2/3(× 200倍，DAB染色)圖3 MMP-2在乳腺癌組織中表達

A：MMP-9表達陰性，細胞漿淡黃色，著色面積<1/3(× 200倍，DAB染色)B：MMP-9表達陽性：細胞漿棕褐色，著色面積>2/3(× 200倍，DAB染色)圖4 MMP-9在乳腺癌組織中表達

STAT是一種轉錄因子家族的蛋白質，在腫瘤的發生發展中扮演著重要角色，特別是STAT3的異常激活在癌癥發生機制中處于核心位置[8]。在正常細胞中，STAT3的激活在時間和程度上均受到嚴格控制。但是在許多腫瘤細胞中，STAT3被持續激活，導致靶基因連續表達，促進腫瘤細胞增殖、存活、侵襲和血管生成[9]。在惡性腫瘤中，驅動STAT3活化的主要驅動因子是IL-6，它可通過一種復雜的IL-6受體ɑ和gp130激活兩面激酶(Janus kinases，JAK)，最終磷酸化STAT3[10]。IL-6驅動STAT3活化的重要性已在多種腫瘤中被驗證，包括乳腺癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、結腸癌、黑色素瘤等[11]。有報道認為，在三陰型乳腺癌中通過抑制IL-6，能進一步抑制STAT3而達到抑制腫瘤的目的；而在HER-2陽性乳腺癌中則有可能通過IL-6的高表達激活STAT3通路而導致腫瘤對抗HER-2治療耐藥[12-13]。我們利用免疫組化的方法檢測23例乳腺癌患者癌組織中IL-6和STAT3的陽性表達，IL-6陽性率為47.83%，STAT3陽性率為34.78%。楊潔等[14]采用同樣方法檢測了126例乳腺癌患者組織中STAT3的表達，陽性率達到82.5%。楊增等[15]檢測了36例乳腺癌組織中STAT3的表達，陽性率為58.3%。齊鳳杰等[16]的研究陽性率為65%。楊林等[17]通過檢測三陰性乳腺癌組織中IL-6的表達，發現陽性率達72.6%。本研究中三陰型乳腺癌例數少，HER-2陽性例數多，因此，是否本研究樣本量少，以及由于腫瘤異質性導致在不同分子分型和不同生物學類型的乳腺癌中表達有差異還有待研究。

本研究發現，STAT3陽性表達與浸潤型乳腺癌有正相關性，說明STAT3的高表達與乳腺癌的浸潤侵襲有著密切的關系。為了進一步探究STAT3與乳腺癌侵襲轉移的關系，我們利用免疫組化觀察了乳腺癌組織中MMPs的表達。MMPs是一種鋅依賴的肽鏈內切酶家族，在各種組織細胞外環境中均有表達[18]。研究發現，MMPs不僅在正常生理過程中發揮著重要作用，同時也與腫瘤的侵襲和轉移有著極其密切的關系[19-20]。腫瘤的侵襲和轉移過程復雜，其中就包括細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的異常破裂[21]。而MMPs及其抑制劑，如TIMPs和膜相關MMP抑制劑(RECK)是ECM降解的重要調節因子[22]。MMP-9和MMP-2作為IV膠原酶，能夠破壞基底膜，特別是降解IV膠原，從而加速腫瘤在體外的侵襲。在乳腺癌中，MMP-9循環水平顯著升高，MMP-9和/或MMP-2的釋放在乳腺腫瘤的侵襲和轉移中扮演著重要的角色[23]。在本研究中的23例乳腺癌組織中MMP-2陽性率為43.48%，MMP-9陽性率為39.13%，均與STAT3陽性表達呈正相關，提示STAT3可能是通過調節MMP-2和MMP-9的表達控制乳腺癌轉移侵襲的。有研究顯示，在結腸癌中，IL-6/STAT3/Fra-1信號通路能夠通過調節MMP-2和MMP-9等上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)促進因子的表達，促進EMT和結腸癌侵襲[24]。祝立和等[25]通過研究乳腺浸潤性導管癌組織中STAT3與MMP-2和MMP-9表達的相關性，發現其呈顯著正相關，并認為STAT3基因可能通過調節MMP-2、MMP-9 的表達介導 EMT 從而促進乳腺浸潤性導管癌的侵襲轉移。

我們采用免疫組化檢測了23例乳腺癌患者腫瘤組織中STAT3、IL-6、MMP-2和MMP-9的表達，分析STAT3表達與患者臨床病理特征的關系，結果表明，STAT3與乳腺癌的浸潤、侵襲有關，其可能通過調節MMP-2和MMP-9的表達實現控制乳腺癌的侵襲和轉移。但由于本研究樣本量少，具體機制還有待進一步闡明。

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(本文編輯：楊澤平)

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Relationship research between expression of STAT3 in breast cancer with MMP-2/9

HUHui，WEIWei，YIXin，etal.

(DepartmentofBreastandThyroidSurgery，PekingUniversityShenzhenHospital，Shenzhen518036，China)

Objective To observe the expression of STAT3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)in breast cancer and explore the relationship between the expression and clinical features.Methods The expression of STAT3，IL-6(interleukin，IL-6)，MMP(matrix metalloproteinase，MMP)-2 and MMP-9 in 23 cases of breast cancer were observed by immunohistochemistry(EnVision)and positive rates were calculated.Chi Square and Spearman correlation coefficients were used to further analyze the correlation between STAT3 expression and clinical pathological features.Results The expression of STAT3 in invasive carcinoma was higher than that in non-invasive carcinoma.11 cases of IL-6，10 cases of MMP-2，9 cases of MMP-9 were positive in 23 cases of breast cancer，positive rate were 47.83%，43.48% and 39.13% respectively.There was a significant difference between STAT3 positive expression and invasive breast cancer(χ2=7.738，P<0.05)，and there was a significant positive correlation between them(r=0.161，P<0.05).There was no significant correlation between STAT3 positive expression and IL-6 positive expression(r=0.032，P>0.05)，while significant correlations were with MMP-2(r=0.649，P<0.05)and MMP-9(r=0.537，P<0.05)respectively.Conclusion STAT3 is closely related to invasion of breast cancer，which may be to controll the invasion and metastasis of breast cancer by regulating the expression of MMP-2 and MMP-9.

breast cancer; STAT3; invasion; MMP-2; MMP-9

10.3969/j.issn.1005-6483.2017.07.012

廣東省醫學科學技術研究基金資助項目(A2015545)

518036 深圳，北京大學深圳醫院乳腺甲狀腺外科

韋偉，Email：rxwei1123@163.com

2017-03-14)