Nisin、山梨酸鉀復合抑制尹家雞翅中腐敗菌的研究

孫夢桐，林洋，馬歡歡，呂欣然，白鳳翎，*，張平

（1.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧錦州121013；2.北京林業大學生物科學與技術學院，北京100083；3.北鎮市溝幫子食品有限公司，遼寧錦州121013）

Nisin、山梨酸鉀復合抑制尹家雞翅中腐敗菌的研究

孫夢桐1，林洋1，馬歡歡1，呂欣然2，白鳳翎1，*，張平3

（1.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧錦州121013；2.北京林業大學生物科學與技術學院，北京100083；3.北鎮市溝幫子食品有限公司，遼寧錦州121013）

應用Nisin和山梨酸鉀復合控制尹家雞翅中的腐敗菌。采用微生物學方法分離雞翅中腐敗菌，利用牛津杯打孔法對腐敗菌進行抑制研究，應用復合制劑對產品進行保鮮作用研究。從腐敗的尹家雞翅中分離獲得30株腐敗菌，初步鑒定大多數為革蘭氏陽性桿菌和球菌。Nisin在0.48 g/mL抑制28株腐敗菌的生長，山梨酸鉀在0.48 g/mL抑制27株腐敗菌的生長，0.16 g/mL Nisin和0.16 g/mL山梨酸鉀對30株腐敗菌均有抑菌作用。應用0.24 g/mL Nisin和0.24 g/mL山梨酸鉀在尹家雞翅中保鮮作用較好，在第7天時，細菌菌落總數比對照組下降4個數量級且具有較好的感官評定，雞翅中復合劑含量符合國家標準。尹家雞翅中添加復合濃度0.24 g/mL的Nisin和山梨酸鉀可使產品的貨架期延長至7 d。

Nisin；山梨酸鉀；復合；抑制；尹家雞翅；腐敗菌

熏雞于清光緒十五年聞名并延續至今，深受廣大消費者的青睞，其加工工藝堪稱一流[1]。尹家雞翅是其系列產品中一種低溫氣調包裝產品。因原料和加工環節的污染，使產品中微生物本底值很高，氣調保藏方式很難控制腐敗菌的生長繁殖，導致產品腐敗變質，因此保質期一般在2 d～3 d。采用強烈的熱殺菌方式可有效控制產品中的腐敗菌，但容易導致產品品質下降，一般采取添加防腐劑的方法控制產品中腐敗菌的生長繁殖。Nisin是一種源于乳酸菌的安全、無毒、高效生物防腐劑，能夠有效抑制明串珠菌、葡萄球菌等革蘭氏陽性菌的生長繁殖，特別是對芽孢桿菌抑菌效果較好[2-3]。山梨酸鉀可有效抑制食品中酵母、霉菌和需氧性細菌的生長繁殖，對革蘭氏陰性菌的作用效果明顯強于革蘭氏陽性菌[4]，廣泛使用于各種食品的防腐保鮮。Nisin和山梨酸鉀復合應用具有提升抑菌強度和擴大抑菌譜的優勢，徐世明等[5]應用0.035%Nisin、0.007%山梨酸鉀和0.180%乳酸鈉復配，成功使燒雞貨架期延長至20 d。康懷彬等[6]應用0.05%Nisin、0.05%溶菌酶、2.00%乳酸鈉和1.00%雙乙酸鈉復配，使道口燒雞產品在常溫下貯藏期延長至20 d～25 d，經二次殺菌可使貯藏期達到60 d。王雪鋒等[7]應用0.02% Nisin、0.20%山梨酸鉀和4.00%乳酸鈉復合保鮮劑，將真空包裝熟叫花雞貯藏期延長至21 d。將Nisin與山梨酸鉀復合應用于雞翅產品的防腐保鮮具有較好的協同作用，而添加乳酸鈉和雙乙酸鈉會影響產品的風味，溶菌酶相對成本過高[8-11]。因此，本文應用傳統微生物學方法從雞翅產品中分離腐敗菌，應用Nisin和山梨酸鉀復合對腐敗菌進行抑菌作用研究，并篩選最佳配比控制雞翅產品中腐敗菌生長，達到延長貨架期的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗原料

尹家雞翅：遼寧錦州北鎮市溝幫子食品有限公司。

1.1.2 培養基和試劑

LB肉湯培養基、LB瓊脂培養基：北京奧博星生物技術有限公司；平板計數瓊脂（PCA）、結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基（VRBGA）、乳酸細菌培養基（MRS）、瓊脂培養基（STAA）、銅綠假單胞菌培養基（CN）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）、麥康凱培養基（MAC)：青島高科園海博生物技術有限公司；Nisin：浙江銀象生物工程有限公司；山梨酸鉀：河南錦德化工實業有限公司；重鉻酸鉀、硫代巴比妥酸、98%硫酸、36%鹽酸、氫氧化鈉、山梨酸鉀（均為分析純)：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器

DL-CJ-2N型超級潔凈工作臺：東聯哈爾（北京）儀器制造有限公司；MOTIC BA300數碼顯微鏡：日本麥克奧迪（MOTIC）；GI54DS立式高壓蒸汽滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；IKA Vortex GENIUS 3振蕩器：德國IKA公司；V3型全自動菌落計數儀：杭州迅數科技有限公司；超微量電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；SPX-250智能生化培養箱：寧波海曙賽福實驗儀器廠；SP-722E型可見分光光度計：北京東南儀誠實驗室設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

在無菌條件下，取雞翅10.0 g剪碎后放入90 mL滅菌生理鹽水中，應用IKA Vortex GENIUS 3振蕩器充分振蕩5 min，靜置20 min。

1.2.2 腐敗菌的分離鑒定

用接種環挑取經過處理后的樣液，PCA、VRBGA、MRS、STAA、CN、PDA和MAC上劃線[12]，37℃培養48h，挑取平板上典型菌落進行劃線分離純化兩次，挑取單菌落進行革蘭氏染色后鏡檢。

1.2.3 抑菌試驗

將純化后的單菌落接種LB肉湯培養基，37℃培養24 h，用IKA Vortex GENIUS 3振蕩器振蕩2 min，混勻備用。參考文獻[13]采用牛津杯打孔法，將10 mL素瓊脂倒入無菌平板中，凝固后，將牛津杯放在素瓊脂表面。吸取125 μL 106CFU/mL菌懸液置于25 mL 45℃～50℃LB瓊脂培養基，搖勻，倒入置有牛津杯的平板中（不要倒進牛津杯的孔里）。待凝固后取出牛津杯，在牛津杯孔中分別加入125 μL的0.02、0.04、0.08、0.16、0.24、0.48 g/mL的Nisin和山梨酸鉀及復合濃度為0.02、0.04、0.08、0.16、0.24 g/mL的Nisin和山梨酸鉀，37℃培養48 h后，記錄抑菌效果，選出應用抑菌濃度。

1.2.4 復合保鮮劑對尹家雞翅保鮮研究

1.2.4.1 樣品處理

選取抑菌試驗篩選的Nisin、山梨酸鉀和二者復合制劑，將樣品在不同濃度試劑中浸泡4 min，取出裝袋封口后4℃貯藏，分別在第1、3、5、7、9天時測細菌菌落總數，并以不添加試劑為對照。

1.2.4.2 細菌菌落總數的測定

按GB/T 4789.02-2012《食品衛生微生物學檢驗菌落總數測定》的方法進行測定。

1.2.4.3 感官評價

感官質量評定指標包括氣味、滋味、組織狀態、外觀及色澤，選取6名有經驗的食品專業教師和學生采用Williams[14]9點評分法進行雞翅的感官評分。9點評分分級為：9=極好，8=很好，7=好，6=次好，5=一般，4=一般以下，3=差，2=很差，1=極差，且評分≥5為可接受。

1.2.4.4 山梨酸鉀含量測定

按照GB 1886.39-2015《食品安全國家標準食品添加劑山梨酸鉀》對應用山梨酸鉀試劑處理過的尹家雞翅進行測定。

2 結果與討論

2.1 腐敗菌的分離與初步鑒定

尹家雞翅中分離菌株革蘭氏染色和菌落形態結果見表1。

表1列出了從各種選擇性培養基中挑取的30個典型菌落，其中，PCA 4個、VRBGA 10個、STAA 8個、CN 2個、MRS 4個、PDA和MAC各1個。革蘭氏陽性菌26個，占86.7%；革蘭氏陰性菌4個，占13.3%。球狀9個，占30.0%；桿狀和短桿狀21個，占70.0%。由此可見，導致尹家雞翅腐敗變質的優勢菌群為革蘭氏陽性桿菌，主要包括假單胞菌、熱死環絲菌、乳酸菌和腸桿菌等，這與郭光平等[16]對非真空包裝燒雞中腐敗菌的初始菌相構成的結果相似。

表1 尹家雞翅中分離菌株革蘭氏染色和菌落形態結果Table 1 Results of Gram staining and colony morphology of separate strains from Yinjia chicken wings

經革蘭氏染色后的鏡檢結果如圖1所示。

MRS分離的菌株為革蘭氏陽性菌，呈現雙排列；MAC分離的是革蘭氏陰性桿菌，VRBGA分離的是革蘭氏陽性短桿菌；STAA分離的為革蘭氏陽性桿菌，形態大小各異。由此可以看出，導致尹家雞翅腐敗的主體細菌類群為革蘭氏陽性桿菌。

2.2 抑菌試驗結果

不同濃度Nisin和山梨酸鉀以及兩者復合制劑對30株分離菌的抑制作用結果見表2。

圖1 尹家雞翅中分離菌株的革蘭氏染色結果（1 000×）Fig.1 Gram staining results of separate strains from Yinjia chicken wings

表2 Nisin和山梨酸鉀對雞翅中腐敗菌的抑菌結果Table 2 Results of inhibition of spoilage bacteria using Nisin and potassium sorbate in chicken wings

從中可以看出，0.24 g/mL和0.48 g/mL的Nisin可分別抑制26株和28株分離菌的生長，不被抑制的菌株中PCA-1、VRBGA-7和VRBGA-8為革蘭氏陰性菌，對Nisin不敏感。只有菌株PCA-4對Nisin具有較強的抗性。0.24 g/mL和0.48 g/mL的山梨酸鉀分別可抑制26株和27株分離菌的生長，不被抑制的菌株中MRS-3、PCA-2、PCA-3為革蘭氏陽性球菌，STAA-1為革蘭氏陽性桿菌，可能是與山梨酸鉀抑菌能力有關。0.16 g/mL Nisin和山梨酸鉀和0.24 g/mL Nisin和山梨酸鉀復合可抑制全部30株腐敗菌的生長繁殖，說明Nisin和山梨酸鉀兩者的抑菌作用可以互補，具有協同作用效應。依據抑菌效果，將0.48 g/mL的Nisin和0.48 g/mL的山梨酸鉀以及0.16、0.24 g/mL的Nisin和山梨酸鉀復合應用到尹家雞翅產品進行保鮮試驗。

不同劑量的Nisin、山梨酸鉀和兩者復合制劑對尹家雞翅中分離腐敗菌的抑菌效果圖如圖2所示。

圖2 不同試劑對雞翅中腐敗菌的抑菌結果Fig.2 Results of inhibition of spoilage bacteria from chicken wings using different preservative

從圖2a中可以看出，0.08 g/mL山梨酸鉀對菌株MRS-4生長具有一定的抑菌作用，隨著濃度的增大，抑菌圈逐漸增大清晰；b中0.08 g/mLNisin對菌株MRS-4具有很好的抑菌作用，0.16 g/mL時抑菌效果已達到最好；圖中c表明Nisin、山梨酸鉀復合試劑對菌株MRS-4的抑制效果在0.16 g/mL Nisin和0.16 g/mL山梨酸鉀制劑、0.24 g/mL Nisin和0.24 g/mL山梨酸鉀制劑較好。

2.3 復合保鮮劑對尹家雞翅保鮮效果中菌落總數測定結果

應用0.48 g/mL Nisin和0.48 g/mL山梨酸鉀以及0.16 g/mL，0.24 g/mL Nisin和山梨酸鉀復合對尹家雞翅進行保鮮試驗，貯藏9 d后細菌菌落計數指標結果如圖3所示。

圖3 應用Nisin和山梨酸鉀制劑對尹家雞翅中腐敗菌的抑制結果Fig.3 Results of inhibition of spoilage bacteria using Nisin and potassium sorbate in Yinjia chicken wings

從圖3中可以看出，不同試劑處理的產品與對照組相比較，添加0.48 g/mL Nisin的尹家雞翅樣品在第3天至第5天細菌菌落總數比未添加試劑對照組下降3至5個數量級，第7天至第9天時，細菌菌落總數下降2個數量級，9 d后細菌菌落總數逐漸增大；添加0.48 g/mL山梨酸鉀的尹家雞翅樣品在第3、5、7天細菌菌落總數比未添加試劑對照組下降3、5、3個數量級，7 d后細菌菌落總數下降；添加0.16 g/mL Nisin和0.16 g/mL山梨酸鉀試劑的尹家雞翅樣品在第3、5、7天細菌菌落總數比未添加試劑的對照組分別下降3、5、1個數量級，7 d后細菌菌落總數下降；添加0.24 g/mL Nisin和0.24 g/mL山梨酸鉀的尹家雞翅中的菌落總數在第3天至第5天比未添加試劑的對照組下降3個至5個數量級，在第7天細菌菌落總數比未添加試劑的對照組下降4個數量級。從整體來看，添加0.24 g/mL Nisin和0.24 g/mL山梨酸鉀的尹家雞翅中的菌落總數從第1天至第7天始終比其他組的細菌菌落總數低，抑菌效果相對較好。

2.4 復合制劑對尹家雞翅保鮮效果中感官評定結果

將添加0.48 g/mL Nisin和0.48 g/mL山梨酸鉀以及0.16、0.24 g/mL Nisin和山梨酸鉀復合制劑的樣品分別在第1、3、5、7、9天進行感官評定，感官評定結果如圖4所示。

圖4 Nisin和山梨酸鉀制劑處理尹家雞翅的感官評分結果Fig.4 Results of sensory score of Yinjia chicken wings using Nisin and potassium sorbate

可以看出，隨著貯藏時間增加，雞翅感官質量下降，添加試劑的樣品感官評價更好。從0至第7天，感官質量評分結果良好；7 d后感官質量迅速下降；到第9天對照組的感官評價不可接受（≤5分），添加試劑的樣品感官評價較差。感官質量從高到低依次是0.24 g/ mL的Nisin和0.24 g/mL的山梨酸鉀復合、0.48 g/mL山梨酸鉀、0.48 g/mL Nisin以及0.16 g/mL的Nisin和0.16 g/mL的山梨酸鉀復合。因此，說明添加0.24 g/mL Nisin和0.24 g/mL山梨酸鉀復合在保持原有口感的條件下可將尹家雞翅的貯藏期從2 d延長至7 d，這與抑菌試驗、菌落總數測定結果相一致。

2.5 尹家雞翅中山梨酸鉀測定結果

應用國標方法測得尹家雞翅樣品中山梨酸鉀含量見表3，可以看出所有添加山梨酸鉀的樣品中山梨酸鉀殘留量不超過國家標準限量要求（0.075 g/kg）。

表3 尹家雞翅中山梨酸鉀測定結果Table 3 Results of the determination of potassium sorbate in Yinjia chicken wings

3 結論

尹家雞翅產品是一種低溫氣調包裝的即食禽類制品，由于原料和加工等原因導致產品本身腐敗菌污染嚴重，采用氣調方式很難控制其腐敗菌的生長。本文應用PCA、VRBGA、MRS、STAA、CN和MAC固體培養基經分離純化篩選出30株腐敗菌菌株，進而應用Nisin和山梨酸鉀及二者復合試劑對30株腐敗菌進行抑菌試驗，確定0.24 g/mL Nisin和0.24 g/mL山梨酸鉀復合制劑對尹家雞翅進行保鮮試驗，結果顯示可使雞翅產品貨架期從2 d延長至7 d，且添加山梨酸鉀的雞翅中山梨酸鉀含量均符合國家標準。本研究為Nisin和山梨酸鉀應用于速食禽制品的防腐保鮮提供借鑒與參考。

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Properties of Inhibition of Spoilage Bacteria Using Nisin and Potassium Sorbate Combinations in Yinjia Chicken Wings

SUN Meng-tong1，LIN Yang1，MA Huan-huan1，Lü Xin-ran2，BAI Feng-ling1，*，ZHANG Ping3
（1.College of Food Science and Technology，Bohai University，Food Safety Key Lab of Liaoning Province，National&Local Joint Engineering Research Center of Storage，Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products，Jinzhou 121013，Liaoning，China；2.College of Biological Science and Technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；3.Beizhen Gou-Bangzi Food Co.，Ltd.，Jinzhou 121013，Liaoning，China）

Application of Nisin with potassium sorbate complex agent control spoilage bacteria in Yinjia chicken wings.Spoilage bacteria were isolated from the chicken wings using the microbiological method，and the inhibition effect of Nisin with potassium sorbate complex agent on the spoilage bacteria was studied by the oxford cup method.Study on preservation of the product by using the complex agent.Thirty spoilage bacteria strains were isolated from Yinjia chicken wings，and preliminary identification of the majority of Gram-positive bacilli and cocci.Inhibition of the growth of 28 spoilage bacteria by 0.48 g/mL Nisin；Inhibition of the growth of 27 spoilage bacteria by 0.48 g/mL potassium sorbate；0.16 g/mL Nisin with potassium sorbate complex agent had bacteriostatic effect on 30 representative spoilage bacteria.The preservation effect of 0.24 g/mL Nisin with potassium sorbate complex agent on Yinjia chicken wings is better than that other concentration complex agent.The total bacteria count decreased 4 log units and maintained good sensory quality in treatment group than the control during 7 day storage，as well as the content of preservation meet the national standard in Yinjia chicken wings.Addition of 0.24 g/mL of Nisin and 0.24 g/mL of potassium sorbate combination in Yinjia chicken wings can make the shelf life be extended to 7 d.

Nisin；potassium sorbate；complex；inhibition；Yinjia chicken wings；spoilage bacteria

2016-12-11

孫夢桐（1992—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品安全與質量控制。

*通信作者：白鳳翎（1964—）男，教授，博士，研究方向：食品安全與質量控制和食品微生物學。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.039