STAT3蛋白真核表達載體的構建及其泛素化功能研究

李夏瑩+張秀杰+宋貴文

摘要：為研究信號轉導與轉錄激活因子3（STAT3）的活性調控機制，克隆人源STAT3基因，并將其構建在真核表達載體上。之后，通過細胞內共表達STAT3和泛素化質粒的方法，驗證了STAT3蛋白可以發生多種類型的泛素化修飾。結果表明，K63位非降解功能的泛素化影響STAT3蛋白的磷酸化，從而影響STAT3的活性及功能的發揮；而K48位降解功能的泛素化影響STAT3蛋白的降解，使STAT3蛋白得以更新，這2種類型的泛素化對STAT3蛋白及其功能都十分重要。

關鍵詞：STAT3蛋白；表達載體；泛素化；K63；K48

中圖分類號： Q78文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）11-0016-03

化[5]。信號轉導與轉錄激活因子家族（STAT）已發現7個成員，STAT3是該家族的研究熱點，且敲除該基因可以使胚胎死亡，說明該基因是不可或缺的。磷酸化修飾是調控STAT3活性的主要方式，Tyr705、Ser727是磷酸化的關鍵氨基酸位點[6]。此外，STAT3的Lys685可以在組蛋白乙酰轉移酶的修飾下發生可逆乙酰化[7-8]。

在真核細胞中，蛋白質的泛素化和磷酸化是最常見的翻譯后修飾。細胞外信號嚴格調控著蛋白的泛素化，在很多情況下，這種調控依賴于蛋白質的磷酸化[9]。磷酸化通過修飾泛素化的底物，或者修飾泛素化機器的某個組分來影響泛素化。此外，泛素化對于磷酸化和信號分子的傳遞也有一定的作用。本研究通過研究STAT3蛋白是否會發生泛素化，發生哪種類型的泛素化，并以此解釋泛素化與STAT3活性之間的關系。

1材料與方法

1.1試驗材料

Taq DNA polymerase，購自北京鼎國生物技術有限公司；T4 DNA連接酶、pMD-19-T simple Vector、DNA酶Ⅰ、Oligo（dT）18、Random promers、PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）Kit，購自TaKaRa公司；dNTPs，購自北京盛旭百川生物科技有限公司；DNA分子量標準品，購自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；蛋白質非預染分子量標準marker及預染分子量標準marker，購自Fermentas公司；Tween-20，購自Amresco公司；質粒小量提取試劑盒、EASYspin plus RNA提取試劑盒，購自北京艾德萊生物科技有限公司；質粒大量提取試劑盒、Enhanced chemiluminescence（ECL）kit，購自北京康為世紀生物科技有限公司；DNA凝膠回收純化試劑盒，購自Zymo公司；無內毒素大量質粒提取試劑盒，購自北京艾德萊生物科技有限公司；Anti-c-HA單克隆抗體、protein A/G plus-agarose（SC-2003），購自Santa Cruz生物公司；Anti-FLAG M2（F1804）單克隆抗體、PI染料，購自Sigma公司；HRP-標記山羊抗小鼠和山羊抗兔抗體，購自北京鼎國生物技術有限公司；Lipofectamine 2000轉染試劑，購自Invitrogen公司；蛋白酶抑制劑，購自亞太恒信生物科技（北京）有限公司；Sal Ⅰ和Hind Ⅲ酶，購自NEB公司；HA-ub、HA-KO、HA-K48、HA-K63等載體質粒均由唐軍教授饋贈；所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2Human STAT3基因的克隆

根據NCBI STAT3（ID：47080104）基因序列設計引物，上游引物為5′-ATGGCCCAATGGAATCAGC-3′，下游引物為5′-TCACATGGGGGAGGTAGCGC-3′。建立50 μL PCR反應體系：5 μL 10×PCR Buffer，2 μL 10 mmol/L dNTPs，20 pmol/L 上下游引物各1 μL，4 μL cDNA，1 μL Taq plus DNA polymerase，用ddH2O補至50 μL。按以下程序進行PCR反應：94 ℃預變性5 min，進入循環：94 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸2.5 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產物，目的基因大小為 2 313 bp。

1.3宿主細胞蛋白STAT3重組質粒的構建

針對pRK5-flag質粒多克隆位點設計引物并引入SalⅠ和HindⅢ酶切位點，以測序正確的pMD-19-T-STAT3質粒為模板進行PCR；1.5%瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產物后，進行SalⅠ和HindⅢ雙酶切，同時對pRK5-flag質粒進行 SalⅠ 和HindⅢ雙酶切，1.0%瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產物；將PCR酶切產物和pRK5-flag酶切產物按6 ∶1摩爾比混合，并加入等量的（5 μL）Solution I（酶溶液），過夜連接，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α；挑取單克隆，提取質粒酶切鑒定正確后，由北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序，測序正確克隆保存菌種，并提取質粒待用。

pRK5-flag-STAT3：上下游引物分別引入SalⅠ和HindⅢ酶切位點，上游引物為5′-ACGCGTCGACATGGCCCAATGGAATCAGCTAC-3′，下游引物為5′-CCCAAGCTTTCACATGGGGGAGGTAGCGCAC-3′。

1.4STAT3泛素化的檢測

6孔板分別按下述方式轉染HEK293T細胞，其中pRK5-flag空載體組作為陰性對照：（1）pRK5-flag+HA-ub；（2）pRK5-flag-STAT3+HA-ub；（3）pRK5-flag+HA-KO；（4）pRK5-flag-STAT3+HA-K48；（5）pRK5-flag-STAT3+HA-K63。

細胞內泛素化：（1）質粒轉染后20 h（即收獲細胞蛋白前4 h），加入20 μmol/L MG132抑制蛋白酶體的降解作用。（2）收獲細胞蛋白。用冰預冷的1×PBS輕輕漂洗細胞2次。（3）配制裂解工作液。1 mL Lysis buffer中加入10 μmol/L二硫蘇糖醇溶液，1×cocktail C蛋白酶抑制，10 mmol/L N-乙基順丁烯二酰亞胺和終濃度為1%的十二烷基硫酸鈉溶液（SDS）。（4）6孔板每個孔中加入80 μL現用現配的裂解工作液，將細胞刮下轉移至1.5 mL的離心管中。（5）將離心管放入 95 ℃ 金屬浴中，滅活10 min。（6）超聲波（功率10%）破碎細胞沉淀1 min。（7）每管加入720 μL不含（SDS）的裂解工作液，4 ℃、12 000 r/min離心20 min。（8）取出50 μL離心上清液作為Input，其余上清液加入到含有偶聯Flag抗體的beads離心管中，4 ℃旋轉孵育過夜。（9）過夜孵育之后，用 1×Lysis buffer洗滌beads 3次（4 ℃、3 000 r/min、3 min）。（10）加入20 μL 2×SDS蛋白上樣緩沖液，于100 ℃煮 10 min，立即進行Western Blot檢測。

2結果與分析

2.1人源STAT3基因的克隆

為獲取人源基因STAT3，使用Trizol法提取HEK293T細胞的總RNA，以其為模板利用RT-PCR擴增STAT3基因。擴增得到片段大小約為2 310 bp，如圖1所示。隨后將2種PCR產物分別與pMD-19-T載體連接，并將轉化后長出的陽性克隆進行測序。測序結果表明，構建并保存在pMD-19-T載體中的STAT3基因與NCBI上登陸的參考序列在氨基酸水平上完全相同，可用于后續試驗中。

2.2STAT3基因重組載體的構建

根據試驗需要，將STAT3基因分別插入相應的表達載體內，經雙酶切鑒定及測序比對正確后作質粒大量提取，用于后續的試驗。依據試驗需求構建重組載體pRK5-flag-STAT3，重組載體的酶切鑒定結果如圖2所示。

2.3pRK5-flag-STAT3質粒的驗證表達

將pRK5-flag-STAT3質粒轉染入HEK293T細胞，轉染24 h后收獲細胞蛋白，進行Western Blot驗證。如圖3所示，pRK5-flag-STAT3在細胞中表達良好，可以用于后續試驗。

2.4STAT3蛋白可以發生泛素化

為驗證STAT3蛋白能否發生泛素化修飾，將構建的pRK5-flag-STAT3真核表達載體以及pRK5-flag與 HA-ub 一起轉染HEK293T細胞，為保證能有效捕捉蛋白泛素化修飾，在轉染20 h后收集細胞裂解液，并進行免疫共沉淀，孵育2 h后，進行Western Blot檢測，如圖4所示，STAT3可以發生泛素化修飾。

2.5STAT3蛋白泛素化類型確定

泛素分子全長包含7個賴氨酸位點（K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63）和1個位于C端的甘氨酸位點以及位于N端的甲硫氨酸位點。泛素自身的每個賴氨酸位點以及N端的

甲硫氨酸位點都可以發生泛素化從而延伸泛素鏈[10-11]，其中對K48、K63位多聚泛素化的研究最廣泛。按照試驗方法中所述，將構建的pRK5-flag-STAT3真核表達載體以及pRK5-flag分別與HA-ub、HA-KO、HA-K48、HA-K48一起轉染HEK293T細胞，在轉染20 h后收集細胞裂解液，并進行免疫共沉淀，孵育2 h后，進行Western Blot檢測，如圖5所示，STAT3可以發生多種類型的泛素化修飾。

3結果與討論

STAT3蛋白作為信號通路中一個關鍵的分子，在受到外界信號刺激時，會發生磷酸化和二聚體化，轉化為活性形式的pSTAT3，進入細胞核發揮轉錄激活的作用。

本研究通過克隆的方法獲得了人源STAT3基因，并將其構建在pRK5-flag表達載體上。之后將pRK5-flag-STAT3和泛素質粒共轉染細胞，確認STAT3可以發生泛素化修飾，并可以發生Ko、K48、K63等多種類型的泛素化。已有研究報道K63位的泛素化中在信號激活和蛋白質運輸中起了關鍵作用；蛋白激酶Akt的K63鏈泛素化，對于Akt的膜定位和磷酸化很重要[12-14]。此外，K48位的泛素化被證實與蛋白質降解有關[15]。而其他賴氨酸連接的多聚泛素鏈具有非泛素降解和泛素降解功能，其中K63連接多聚泛素化具有非泛素降解功能。已發現泛素化介導的非蛋白降解功能包括DNA損傷修復、信號傳導、轉錄調節、胞吞作用和蛋白激酶活化。

結合本研究結果以及已有文獻報道，可推測K63位非降解功能的泛素化影響STAT3蛋白的磷酸化，從而影響STAT3的活性及功能的發揮；而K48位降解功能的泛素化影響STAT3蛋白的降解，使STAT3蛋白得以更新，這2種類型的泛素化對于STAT3蛋白及其功能都十分重要。

參考文獻：

[1]Levy D E，Kessler D S，Pine R，et al. Interferon-induced nuclear factors that bind a shared promoter element correlate with positive and negative transcriptional control[J]. Genes & Development，1988，2（4）：383-393.

[2]Dale T C，Imam A M，Kerr I M，et al. Rapid activation by interferon alpha of a latent DNA-binding protein present in the cytoplasm of untreated cells[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1989，86（4）：1203-1207.

[3]Fu X Y. A transcription factor with SH2 and SH3 domains is directly activated by an interferon alpha-induced cytoplasmic protein tyrosine kinase（s）[J]. Cell，1992，70（2）：323-335.

[4]Nakanoh S，Fuse N，Tadokoro R，et al. Jak1/Stat3 signaling acts as a positive regulator of pluripotency in chicken pre-gastrula embryos[J]. Developmental Biology，2017，421（1）：43-51.

[5]Yu H，Pardoll D，Jove R. STATs in cancer inflammation and immunity：a leading role for STAT3[J]. Nature Reviews Cancer，2009，9（11）：798-809.

[6]Larner A C，David M，Feldman G M，et al. Tyrosine phosphorylation of DNA binding proteins by multiple cytokines[J]. Science，1993，261（5129）：1730-1733.

[7]Lee H，Zhang P，Herrmann A，et al. Acetylated STAT3 is crucial for methylation of tumor-suppressor gene promoters and inhibition by resveratrol results in demethylation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109（20）：7765-7769.

[8]Pan J，Lee Y，Zhang Q，et al. Honokiol decreases lung cancer metastasis through inhibition of the STAT3 signaling pathway[J]. Cancer Prevention Research，2017，10（2）：133-141.

[9]Park S，Kim D，Kaneko S，et al. Molecular cloning and characterization of the human AKT1 promoter uncovers its up-regulation by the Src/Stat3 pathway[J]. Journal of Biological Chemistry，2005，280（47）：38932-38941.

[10]Xu P，Duong D M，Seyfried N T，et al. Quantitative proteomics reveals the function of unconventional ubiquitin chains in proteasomal degradation[J]. Cell，2009，137（1）：133-145.

[11]Rieser E，Cordier S M，Walczak H. Linear ubiquitination：a newly discovered regulator of cell signalling[J]. Trends in Biochemical Sciences，2013，38（2）：94-102.

[12]Yang W L，Jin G，Li C F，et al. Cycles of ubiquitination and deubiquitination critically regulate growth factor-mediated activation of Akt signaling[J]. Science Signaling，2013，6（257）：ra3.

[13]Lin K. The Akt DUBbed InAktive[J]. Science Signaling，2013，6（257）：Pel.

[14]Yang W L. The role of K63-linked ubiquitination cycles in Akt kinase activation[D]. Houston：The University of Texas at Houston，2013.

[15]Li P，Liu H，Zhang Y，et al. Endotoxin tolerance inhibits degradation of tumor necrosis factor receptor-associated factor 3 by suppressing pellino 1 expression and the K48 ubiquitin ligase activity of cellular inhibitor of apoptosis protein 2[J]. The Journal of Infectious Diseases，2016，214（6）：906-915.倪雅楠，劉博. 龍爪槐SRAP-PCR反應體系的建立與優化[J]. 江蘇農業科學，2017，45（11）：19-22.