甘藍硫苷生物合成相關基因FMOGS—OXS的預測與分析

劉蕾+宋佳+王輝

摘要：以擬南芥中控制硫苷生物合成相關基因家族FMOGS-OX位點基因全長編碼區(qū)及蛋白為參考序列，在甘藍（Brassica oleraceae L.）基因組數(shù)據(jù)庫中進行Blastn和Blastp檢索，得到具備Score≥100、E值≤10-10、coverage ≥70%條件的甘藍注釋基因作為候選擬南芥FMOGS-OX的同源基因，并進一步進行同源性比較、基因結構比較及序列聚類分析。結果顯示，在甘藍中發(fā)現(xiàn)3個旁系同源基因Bol010993、Bol029100、Bol031350。甘藍和擬南芥FMOGS-OX同源基因之間在核酸水平上的相似性為69.4%～83.0%；甘藍3個FMOGS-OX旁系同源基因間的相似性保持在70.0%～840%。甘藍Bol010993與擬南芥FMOGS-OX1～FMOGS-OX4的結構較為相似，而Bol029100、Bol031350與擬南芥FMOGS-OX5的結構較相似。系統(tǒng)進化分析及共線性分析初步確定，甘藍中分別存在1個FMOGS-OX2（Bol010993）和2個FMOGS-OX5（Bol029100、Bol031350）基因。

關鍵詞：十字花科；甘藍；硫代葡萄糖苷；FMOGS-OX基因

中圖分類號： S635.03文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）11-0022-04

人們對甘藍的重視主要源于甘藍中含有一種重要的植物次生代謝產物——硫代葡萄糖苷，它影響著十字花科植物的風味，同時在醫(yī)學上具有一定的保健功能，還有生物防御功能。硫代葡萄糖苷（簡稱硫苷），又叫芥子油苷，甘藍等十字花科植物中含有硫代葡萄糖苷，硫代葡萄糖苷的基本結構為1個β-D-葡萄糖，連接1個磺酸鹽醛肟基團和1個來源于氨基酸的側鏈[4]。目前已經有很多科學家研究植物中的硫代葡萄糖苷，而且對硫代葡萄糖苷作了進一步分析。已有120多種不同的硫代葡萄糖苷被發(fā)現(xiàn)[5-6]，它們主要分布在白菜、甘藍、油菜、芥菜、花椰菜、蕪菁、蘿卜等十字花科植物中，并且?guī)缀跛械氖只浦参锒寄芎铣闪蜍誟6-7]。硫代葡萄糖苷存在于這些植物的根、莖、葉、種子中，在種子中含量最多。人們從芥菜中分離出的第一種硫苷是丙烯基硫苷（singapore）[8]。這些結果引起了人們的廣泛關注。

擬南芥中FMOGS-OX基因在十字花科中存在一個獨特的亞家族FMOGS-OX1 ～ FMOGS-OX5，并且FMOGS-OX1 ～ FMOGS-OX5各突變體均使磺酰硫苷占總硫苷的比例大大降低[9-11]。另外，酶學試驗證實，不同的FMOGS-OX對側鏈長度存在特異性[9-10]。十字花科蔬菜中具有的抗癌物質磺酰脂肪族硫苷是FMOGS-OX基因的直接催化產物，因此，研究FMOGS-OX基因具有深遠的生物技術前景[12]。本研究在甘藍基因組測序大背景下，利用生物信息分析為主要技術手段，充分挖掘甘藍基因組數(shù)據(jù)庫，并對甘藍FMOGS-OXS候選基因進行預測及分析。本研究將為甘藍FMOGS-OXS基因的克隆、甘藍硫苷積累的分子機理的探索及富含有益硫苷甘藍新品種的選育提供理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

擬南芥FMOGS-OX家族所包含的5個基因（At1g65860、At1g62540、At1g62560、At1g62570、At1g12140）均來源于TAIR數(shù)據(jù)庫（www.arabidopsis.org）；甘藍基因組及基因注釋數(shù)據(jù)庫來源于NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）；白菜BrFMOGS-OX基因來源于BRAD（http：//Brassicadb.org），并參考Wang等的研究結果[13]；系統(tǒng)進化樹構建所涉及蛋白序列均來源于UniProt（www.uniprot.org）、TAIR（www.arabidopsis.org）和BRAD（http：//Brassicadb.org）。

1.2試驗方法

利用擬南芥FMOGS-OX1 ～ FMOGS-OX5基因的全長編碼區(qū)序列在甘藍基因組及注釋基因數(shù)據(jù)庫中進行Blastn、Blastp檢索，得到具備Score ≥100、E值 ≤10-10、coverage ≥70%的甘藍基因組注釋基因作為候選擬南芥FMOGS-OX基因的同源基因。采用MEGA軟件進行多序列比對及聚類分析[14]。序列相似性分析和點陣圖制作分別采用EMBOSS軟件包的Needle程序和polydot程序（emboss.sourceforge.net）。

2結果與分析

2.1甘藍FMOGS-OX位點基因的預測

在甘藍基因組和44 940個注釋基因 （來源于http：//brassicadb.org/brad） 的基礎上，針對擬南芥FMOGS-OX家族中5個硫苷生物合成基因（FMOGS-OX1、FMOGS-OX2、FMOGS-OX3、FMOGS-OX4、FMOGS-OX5）采用Blastn、Blastp程序對甘藍中FMOGS-OX家族相關基因進行檢索分析。對應5個擬南芥FMOGS-OX基因，在甘藍中共找到了3個同源基因（Bol010993、Bol029100、Bol031350）。

擬南芥中FMOGS-OX基因在脂肪族硫苷側鏈修飾途徑中起著重要作用，其所編碼的黃素單加氧酶具有使側鏈上的硫發(fā)生氧化的作用[7]。擬南芥中該家族存在5個旁系同源基因FMOGS-OX1、FMOGS-OX2、FMOGS-OX3、FMOGS-OX4、FMOGS-OX5，均位于擬南芥第1號染色體上，其中FMOGS-OX2（At1g62540）、FMOGS-OX3（At1g62560）、FMOGS-OX4（At1g62570）為tandem基因。甘藍中預測的3個FMOGS-OX基因中的Bol029100、Bol031350均分布在第8號染色體上，而Bol010993存在于Scaffold000215，目前該scaffold尚未定位到相應的染色體上。

2.2甘藍FMOGS-OX基因與擬南芥FMOGS-OX基因的同源比較

由表2可知，擬南芥和甘藍FMOGS-OX基因在外顯子數(shù)目、外顯子大小及編碼區(qū)長度等方面較為類似。擬南芥

FMOGS-OX1～FMOGS-OX4均含有7個外顯子，并且不同旁系同源基因間各相應外顯子的長度非常接近，僅有FMOGS-OX3在外顯子1中多3 bp，另外，F(xiàn)MOGS-OX1～FMOGS-OX4的外顯子7稍有差別（分別為216、210、222、222 bp）。盡管擬南芥FMOGS-OX5與FMOGS-OX1～FMOGS-OX4相比缺少2個外顯子，但有趣的是 FMOGS-OX5外顯子4的長度為219 bp，等于FMOGS-OX1～FMOGS-OX4各基因的外顯子4與外顯子5的長度之和（83 bp+136 bp=219 bp）；同樣地，F(xiàn)MOGS-OX5的外顯子5長度為 390 bp，等于FMOGS-OX1的外顯子6與外顯子7的長度之和（174 bp+216 bp=390 bp），并且與另外3個旁系同源基因FMOGS-OX2～FMOGS-OX4的外顯子6與外顯子7的長度之和（384 bp、396 bp、396 bp）非常接近。擬南芥中5個旁系同源基因在全基因長度、編碼區(qū)長度、編碼區(qū)所占全基因的比例均較為相似。甘藍FMOGS-OX的3個旁系同源基因中Bol010993存在7個外顯子，而Bol029100、Bol031350均含5個外顯子。另外，甘藍FMOGS-OX基因在全基因長度方面差異較大，Bol010993最長，為5 853 bp，Bol031350最短，僅為1 795 bp。甘藍FMOGS-OX的3個旁系同源基因的編碼區(qū)長度差別不大，其長度分別為1 386、1 347、1 380 bp。對甘藍和擬南芥FMOGS-OX基因各外顯子區(qū)比對后發(fā)現(xiàn)，各同源基因外顯子1～外顯子3長度較為相似；甘藍Bol010993與擬南芥FMOGS-OX1～FMOGS-OX4非常類似，尤其與FMOGS-OX4在外顯子數(shù)目及大小方面完全相同；而甘藍Bol029100、Bol031350則與擬南芥FMOGS-OX5較為類似，均含有5個外顯子，特別是外顯子4與FMOGS-OX5的外顯子4長度相同，均為219 bp。擬南芥和甘藍FMOGS-OX基因編碼區(qū)所占全基因的比例顯示5個擬南芥FMOGS-OX基因的編碼區(qū)所占全基因的比例均在40%左右，其中FMOGS-OX2最小，為35.02%，F(xiàn)MOGS-OX3最大，為4913%；而甘藍中3個旁系同源基因的編碼區(qū)所占全基因的比例差異明顯，分別為23.68%、70.30%、76.88%。表2擬南芥和甘藍FMOGS-OX位點基因外顯子數(shù)目、大小及所占基因比例等2.4主要十字花科植物FMOGS-OX位點基因的系統(tǒng)進化分析

對擬南芥（AT）、白菜（CC）、甘藍3個已有參考基因組物種的FMOGS-OX位點蛋白序列進行系統(tǒng)聚類分析。由圖2可知，擬南芥FMOGS-OX1～FMOGS-OX4基因之間親緣關系較近，而它們與FMOGS-OX5基因的距離相對較遠。參考甘藍基因組與擬南芥基因組、甘藍基因組與白菜基因組間的共線性，初步確定甘藍中分別存在1個FMOGS-OX2（Bol010993）和2個FMOGS-OX5（Bol029100、Bol031350）基因。同時發(fā)現(xiàn)，Bol010993與白菜FMOGS-OX2（Bra027035）聚在同一分支，Bol029100、Bol031350分別與白菜FMOGS-OX5（Bra016787、Bra026988、C5H9Q6）距離較近，這與甘藍、白菜（均為蕓薹屬）的親緣關系較近。

3小結與討論

本研究借助生物信息分析手段和技術，在甘藍中預測到3個FMOGS-OX旁系同源候選基因（Bol010993、Bol029100、Bol031350）。甘藍和擬南芥FMOGS-OX同源基因間在核酸水平上的相似性為69.4%～83.3%；甘藍3個FMOGS-OX旁系同源基因間的相似性保持在70.0%～84.0%。甘藍Bol010993與擬南芥FMOGS-OX1～FMOGS-OX4基因結構較為相似，而Bol029100、Bol031350與擬南芥FMOGS-OX5基因的結構更為類似。系統(tǒng)進化分析及共線性分析初步確定，甘藍中存在1個FMOGS-OX2（Bol010993）和2個FMOGS-OX5基因（Bol029100、Bol031350）。

擬南芥、甘藍、白菜基因組大小分別為157、520、485 Mb[4，15-16]，而且有研究表明，白菜和甘藍基因組存在多倍化事件[13]。與多倍化事件理論上伴隨的同源基因多拷貝現(xiàn)象相悖，在擬南芥中存在5個FMOGS-OX旁系同源基因，與Wang等在白菜中的研究結果[16]類似，甘藍中也發(fā)現(xiàn)3個旁系同源基因，這也暗示在擬南芥進化途徑中，出現(xiàn)過FMOGS-OX基因的復制、轉座、重組等現(xiàn)象，其中FMOGS-OX2～FMOGS-OX4為tandem基因，F(xiàn)MOGS-OX5中存在外顯子融合等現(xiàn)象也從側面印證了這一推測[12]。

擬南芥FMOGS-OX基因家族包含F(xiàn)MOGS-OX1～FMOGS-OX5 5個基因，F(xiàn)MOGS-OX1～FMOGS-OX5各突變體均大大降低磺酰脂肪族硫苷的數(shù)量，并且FMOGS-OX各基因還對脂肪族硫苷側鏈存在特異性[9-10，13]。有研究認為，甘藍中4-甲基亞磺酰-3-丁烯硫苷（gucoraphanin，GRA）的含量較高，也是公認的抗癌蔬菜紫甘藍和青花菜（均為甘藍類蔬菜）的主要抗癌活性成分[11]，因此，F(xiàn)MOGS-OX基因具有廣泛的生物技術應用前景[17]。由于擬南芥中存在5個FMOGS-OX旁系同源基因，這樣使得擬南芥中硫苷的遺傳變異更為復雜；而在甘藍中僅發(fā)現(xiàn)了3個FMOGS-OX旁系同源基因（Bol010993為FMOGS-OX2，Bol029100、Bol031350均為FMOGS-OX5），這有利于進一步人為操縱甘藍中磺酰硫苷的結構和數(shù)量。

參考文獻：

[1]董靜，王利國. 甘藍發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的變化規(guī)律及降低方法[J]. 江蘇農業(yè)學報，2015，31（5）：1161-1165.

[2]顧閩峰，王乃頂，王偉義，等. NaCl脅迫對結球甘藍幼苗生長及體內離子分布的影響[J]. 江蘇農業(yè)學報，2015，31（3）：638-644.

[3]Ishida M，Hara M，F(xiàn)ukino N，et al. Glucosinolate metabolism，functionality and breeding for the improvement of Brassicaceae vegetables[J]. Breeding Science，2014，64（1）：48-59.

[4]李蔚，劉莉莎，李仁，等. 十字花科蔬菜基因組含量的測定與分析[J]. 植物遺傳資源學報，2011，12（1）：103-106.

[5]Grubb C D，Abel S. Glucosinolate metabolism and its control[J]. Trends in Plant Science，2006，11（2）：89-100.

[6]Halkier B A，Gershenzon J. Biology and biochemistry of glucosinolates[J]. Annual Review of Plant Biology，2006，57：303-333.

[7]廖小軍，胡小松，辛力. 食品和飼料中硫代葡萄糖苷及其降解產物[J]. 食品科學，1999，20（12）：19-21.

[8]何榕，姜子濤，李榮. 硫代葡萄糖苷的定量分析研究進展[J]. 食品研究與開發(fā)，2006（7）：206-209.

[9]Hansen B G，Kliebenstein D J，Halkier B A. Identification of a flavin-monooxygenase as the S-oxygenating enzyme in aliphatic glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis[J]. Plant Journal，2007，50（5）：902-910.

[10]Li J，Hansen B G，Ober J A，et al. Subclade of flavin-monooxygenases involved in aliphatic glucosinolate biosynthesis[J]. Plant Physiology，2008，148（3）：1721-33.

[11]Schlaich N L. Flavin-containing monooxygenases in plants：looking beyond detox[J]. Trends in Plant Science，2007，12（9）：412-418.

[12]Juge N，Mithen R F，Traka M. Molecular basis for chemoprevention by sulforaphane：a comprehensive review[J]. Cellular & Molecular Life Sciences，2007，64（9）：1105-1127.

[13]Wang X W，Wang H Z，Wang J，et al. The genome of the mesopolyploid crop species Brassica rapa[J]. Nature Genetics，2011，43（10）：1035-1039.

[14]Tamura K，Dudley J，Nei M，et al. MEGA4：molecular evolutionary genetics analysis （MEGA） software version 4.0[J]. Molecular Biology & Evolution，2007，24（24）：1596-1599.

[15]Johnston J S，Pepper A E，Hall A E，et al. Evolution of genome size in Brassicaceae[J]. Annals of Botany，2005，95（1）：229-235.

[16]Wang H，Wu J，Sun S，et al. Glucosinolate biosynthetic genes in Brassica rapa[J]. Gene，2011，487（2）：135-142.

[17]董莉，任雪松，李成瓊，等. 甘藍硫甙組分和含量分析[J]. 西南大學學報（自然科學版），2012，34（12）：34-38.焦翠翠，郭妍妍，吳均章，等. 水稻Ds標記的曲穗突變體的分子鑒定[J]. 江蘇農業(yè)科學，2017，45（11）：26-29.