茶樹等木本植物炭疽菌種群遺傳分化研究

劉威 尹鵬 王子浩 葉乃興

摘要：從福建省不同地區茶樹及其他木本植物上分離獲得38株炭疽病菌，采用rDNA-ITS序列分析方法對供試菌株進行系統發育分析和種群分化研究。結果表明，炭疽菌不同種群遺傳多樣性豐富且存在遺傳差異，供試不同寄主來源炭疽病病菌在rDNA-ITS基因序列上存在一定的特異性，但不明顯。供試炭疽病病菌存在一定的寄主專化性，不具有地理來源特異性。序列比較結果顯示，菌株間的ITS序列同源性較高，但仍存在多種不同類型的堿基變異，包括堿基的缺失、突變、插入等。

關鍵詞：茶樹；木本植物；炭疽病菌；遺傳多樣性；ITS序列分析

中圖分類號： S435.711文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）11-0042-03[HS）][HT9.SS]

炭疽病是刺盤孢屬真菌（Colletotrichum Corda）侵染植物引起的病害，種類繁多，寄主范圍廣泛，有記錄的寄主植物種類至少有176屬190種，包括果樹、林木、蔬菜、牧草、花卉等[1]，且不同種類的炭疽菌生物學、生理學特性多存在差異。炭疽病病菌侵染茶樹，引起茶樹感染炭疽病，該病的發生可影響茶樹的生長，降低茶葉的產量與品質[2]。炭疽病病菌種間、種內存在較多變異，甚至不同寄主之間也會存在一定的遺傳多樣性，這些遺傳變化影響炭疽病病菌的侵染特性、寄主選擇性、致病力、生物學特性，及對茶樹炭疽病的防治效果。為深入了解炭疽病病菌的遺傳多樣性特征，rDNA-ITS序列分析、限制性片段長度多態性分析等多種分子標記技術已得到廣泛應用[3-4]。

絕大多數真菌rDNA-ITS區域基因序列具有廣泛的多態性，多數表現為種內基因序列相對一致，而種間差異明顯的特點[5]。鑒于rDNA-ITS序列片段長度小且易于分析的特點，可以從其序列差異中得到足夠的信息用于種內系統發育分析，現在已被廣泛應用在真菌性病害的分類鑒定和病害診斷中[6-8]。本研究通過分析從福建省不同地區寄主為茶樹或其他木本植物上分離獲得的炭疽菌rDNA-ITS區域序列異同，探討福建省不同寄主來源炭疽病病菌以及不同地區茶樹炭疽菌的遺傳多樣性，將對今后炭疽病的防治工作提供參考。

1材料與方法

1.1供試菌株[HT]

從福建省茶樹上采集炭疽病病菌標本，經單孢分離獲得25株病原菌菌株，寄主為非茶樹木本植物的13株炭疽病菌菌株由福建農林大學植物保護學院提供，組成供試38株不同采集地區、不同寄主植物的炭疽病病菌標本，菌株編號、種名、寄主植物、拉丁學名、采集地、GenBank登錄號等信息如表1所示。38株菌株均用馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）平板培養基保存于4～8 ℃冰箱中備用。

用真菌rDNA-ITS通用引物[JP3]ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[JP]對供試38株菌株進行PCR擴增[9]。試驗PCR反應的體系及其組成成分：5 ng模板DNA、1 μL上游引物、1 μL下游引物、5 μL PCR緩沖液、0.5 μL DNA聚合酶、4 μL dNTPs。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 52 s、56 ℃ 55 s、72 ℃ 60 s，共循環30次；71.5 ℃延伸11 min。擴增反應結束后，用微量移液器吸取4 μL擴增產物，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳法檢測其含量，切取電泳條帶經純化后送上海華大基因科技有限公司進行測序。

1.2茶樹等炭疽菌遺傳多樣性分析

將供試38株炭疽病菌菌株的ITS基因序列用MEGA 6.0軟件的鄰結法（Neighbor-Joining，簡稱NJ）構建菌株的系統發育樹，以自展法對其進行檢測，循環1 000次。采用軟件DNAMAN 6.0計算各菌株變異位點和堿基含量，并選用Kimura 2-parameter計算菌株間的遺傳距離。對供試的38株植物炭疽病病菌rDNA-ITS基因序列進行遺傳多樣性檢測分析，比較茶樹炭疽菌與其他木本植物炭疽菌的序列差異。

2結果分析

2.1rDNA-ITS區PCR擴增結果

利用通用引物ITS1、ITS4對38株供試炭疽菌菌株的 rDNA-ITS 區域擴增，均能擴增獲得1條特異性條帶，序列大小約為580 bp。擴增的部分結果如圖1所示。

2.2遺傳多樣性分析

由圖2可知，在遺傳距離約為0.02處，38株炭疽病病菌菌株的進化樹可分為3個類群，分別是Q1、Q2、Q3，其自檢支持率分別為98%、99%、99%；其中Q1群中包含的菌株最多，[FL）]

共26株，超過菌株總數的68%，其中有19個茶樹炭疽菌，7個其他木本植物炭疽菌。把Q1群可以再分為3個小群，分別為F1、F2、F3，F1、F2中菌株的寄主全為茶樹，F3中菌株的寄主則全為其他木本植物；Q2群中3個菌株也可以分為2類，其中AMX、RFS為一類，寄主為茶樹，YW寄主為魚尾葵，是非茶木本植物；Q3也可以再分為3個分支，分別為F4、F5、F6，F6中菌株的寄主全部為茶樹，F4、F5中菌株的寄主全部為非茶樹木本植物。從整個聚類樹來看，HQ與F1較近，且Q1、Q2、Q3中菌株寄主既有茶樹又有非茶木本植物，這說明供試炭疽菌存在一定的寄主專化性，但不具有嚴格的寄主專化性。在F1群中，菌株RTG與其余菌株存在較大的遺傳差異；在F2群中，ZRG與其余菌株存在較大的遺傳差異。

2.3供試植物炭疽菌rDNA-ITS序列差異比較

38株炭疽病病菌菌株的T、A、C、G堿基出現的平均概率分別為23.6%、23.4%、27.5%、25.5%，寄主為茶樹的炭疽菌T、A、C、G堿基出現的平均概率分別為23.8%、23.5%、27.1%、25.6%，其他木本植物T、A、C、G堿基出現的平均概率分別為23.1%、23.3%、28.2%、25.4%，由此可以看出，寄主為茶樹與其他木本植物炭疽菌的各堿基出概率差別不明顯。各菌株rDNA基因存在一些堿基差異，以T堿基為例，出現的概率為21.9%～25.2%，茶樹與其他木本植物病原菌沒有明顯差異。25株寄主為茶樹的菌株基因序列長度為507～527 bp，其他木本植物基因序列長度為506～526 bp，兩者差別[CM（25]不大。供試菌株rDNA-ITS序列長度多樣性不豐富。采[CM）]

用MEGA 5.1計算38株炭疽病病菌菌株之間的遺傳距離，發現全部菌株的平均遺傳距離約為0.046，說明各菌株間的遺傳距離較小，其中最大遺傳距離為0.119，最小遺傳距離為0。

多基因序列比對的部分結果如圖3所示，堿基的變異多出現在ITS1區，炭疽菌種間與種內均存在豐富的遺傳多樣性，比較38株供試菌株ITS序列，發現侵染茶樹的炭疽病病菌在第5 bp基因位點上均比侵染其他木本植物的炭疽病病菌多1個A堿基（圖3中箭頭所指位置），這可能與病原菌與寄主長期互作有關系。

3結論與討論

研究表明，以基因序列為基礎的核酸分析技術來評價物種之間的親緣關系是可行的，rDNA基因區域中18S與28S區域相對保守，屬內差別不大，可用于屬的分類鑒定，ITS區域序列多樣性豐富，被普遍應用于真菌種的鑒定中[10]。

本研究通過擴增供試38株炭疽病病菌的rDNA-ITS序列，并對其基因序列進行研究，發現供試菌株之間存在豐富的堿基序列差異，序列比較結果表明，菌株間的ITS序列同源性較高，但仍存在多種不同類型的堿基及序列變異，包括堿基的缺失、突變、插入等，這與ITS區段為非結構基因、進化速度比結構基因快有關[11]。與其他木本植物炭疽菌相比，茶樹炭疽菌在5 bp基因位點上存在特異的堿基A，這一堿基變異可能與炭疽病病菌適應寄主茶樹有關，還需擴大供試其他木本植物范圍進行驗證，進一步研究該變異與病原菌侵染性的關系。ITS序列的變異雖不一定是造成炭疽菌能侵染茶樹的原因，但這些變異可能使病原菌更易侵染茶樹或者在茶樹體內更好地生長。此外，還需對與病原菌侵染寄主直接相關的基因進行研究，以便更好地了解炭疽病病菌侵染茶樹的內在機制。

遺傳多樣性檢測分析結果表明，供試茶樹炭疽菌rDNA-ITS[CM（21*3]基因序列與其他植物炭疽菌存在一定的特異性，[CM）]

但特異性不明顯。同一采集地區的供試菌株在聚類圖上沒有相似性，說明供試菌株在福建省內沒有地理來源特異性。

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