茶樹等木本植物炭疽菌種群遺傳分化研究

劉威 尹鵬 王子浩 葉乃興

摘要：從福建省不同地區(qū)茶樹及其他木本植物上分離獲得38株炭疽病菌，采用rDNA-ITS序列分析方法對供試菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析和種群分化研究。結(jié)果表明，炭疽菌不同種群遺傳多樣性豐富且存在遺傳差異，供試不同寄主來源炭疽病病菌在rDNA-ITS基因序列上存在一定的特異性，但不明顯。供試炭疽病病菌存在一定的寄主專化性，不具有地理來源特異性。序列比較結(jié)果顯示，菌株間的ITS序列同源性較高，但仍存在多種不同類型的堿基變異，包括堿基的缺失、突變、插入等。

關(guān)鍵詞：茶樹；木本植物；炭疽病菌；遺傳多樣性；ITS序列分析

中圖分類號： S435.711文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）11-0042-03[HS）][HT9.SS]

炭疽病是刺盤孢屬真菌（Colletotrichum Corda）侵染植物引起的病害，種類繁多，寄主范圍廣泛，有記錄的寄主植物種類至少有176屬190種，包括果樹、林木、蔬菜、牧草、花卉等[1]，且不同種類的炭疽菌生物學、生理學特性多存在差異。炭疽病病菌侵染茶樹，引起茶樹感染炭疽病，該病的發(fā)生可影響茶樹的生長，降低茶葉的產(chǎn)量與品質(zhì)[2]。炭疽病病菌種間、種內(nèi)存在較多變異，甚至不同寄主之間也會存在一定的遺傳多樣性，這些遺傳變化影響炭疽病病菌的侵染特性、寄主選擇性、致病力、生物學特性，及對茶樹炭疽病的防治效果。為深入了解炭疽病病菌的遺傳多樣性特征，rDNA-ITS序列分析、限制性片段長度多態(tài)性分析等多種分子標記技術(shù)已得到廣泛應用[3-4]。

絕大多數(shù)真菌rDNA-ITS區(qū)域基因序列具有廣泛的多態(tài)性，多數(shù)表現(xiàn)為種內(nèi)基因序列相對一致，而種間差異明顯的特點[5]。鑒于rDNA-ITS序列片段長度小且易于分析的特點，可以從其序列差異中得到足夠的信息用于種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育分析，現(xiàn)在已被廣泛應用在真菌性病害的分類鑒定和病害診斷中[6-8]。本研究通過分析從福建省不同地區(qū)寄主為茶樹或其他木本植物上分離獲得的炭疽菌rDNA-ITS區(qū)域序列異同，探討福建省不同寄主來源炭疽病病菌以及不同地區(qū)茶樹炭疽菌的遺傳多樣性，將對今后炭疽病的防治工作提供參考。

1材料與方法

1.1供試菌株[HT]

從福建省茶樹上采集炭疽病病菌標本，經(jīng)單孢分離獲得25株病原菌菌株，寄主為非茶樹木本植物的13株炭疽病菌菌株由福建農(nóng)林大學植物保護學院提供，組成供試38株不同采集地區(qū)、不同寄主植物的炭疽病病菌標本，菌株編號、種名、寄主植物、拉丁學名、采集地、GenBank登錄號等信息如表1所示。38株菌株均用馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）平板培養(yǎng)基保存于4～8 ℃冰箱中備用。

用真菌rDNA-ITS通用引物[JP3]ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[JP]對供試38株菌株進行PCR擴增[9]。試驗PCR反應的體系及其組成成分：5 ng模板DNA、1 μL上游引物、1 μL下游引物、5 μL PCR緩沖液、0.5 μL DNA聚合酶、4 μL dNTPs。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 52 s、56 ℃ 55 s、72 ℃ 60 s，共循環(huán)30次；71.5 ℃延伸11 min。擴增反應結(jié)束后，用微量移液器吸取4 μL擴增產(chǎn)物，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳法檢測其含量，切取電泳條帶經(jīng)純化后送上海華大基因科技有限公司進行測序。

1.2茶樹等炭疽菌遺傳多樣性分析

將供試38株炭疽病菌菌株的ITS基因序列用MEGA 6.0軟件的鄰結(jié)法（Neighbor-Joining，簡稱NJ）構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，以自展法對其進行檢測，循環(huán)1 000次。采用軟件DNAMAN 6.0計算各菌株變異位點和堿基含量，并選用Kimura 2-parameter計算菌株間的遺傳距離。對供試的38株植物炭疽病病菌rDNA-ITS基因序列進行遺傳多樣性檢測分析，比較茶樹炭疽菌與其他木本植物炭疽菌的序列差異。

2結(jié)果分析

2.1rDNA-ITS區(qū)PCR擴增結(jié)果

利用通用引物ITS1、ITS4對38株供試炭疽菌菌株的 rDNA-ITS 區(qū)域擴增，均能擴增獲得1條特異性條帶，序列大小約為580 bp。擴增的部分結(jié)果如圖1所示。

2.2遺傳多樣性分析

由圖2可知，在遺傳距離約為0.02處，38株炭疽病病菌菌株的進化樹可分為3個類群，分別是Q1、Q2、Q3，其自檢支持率分別為98%、99%、99%；其中Q1群中包含的菌株最多，[FL）]

共26株，超過菌株總數(shù)的68%，其中有19個茶樹炭疽菌，7個其他木本植物炭疽菌。把Q1群可以再分為3個小群，分別為F1、F2、F3，F(xiàn)1、F2中菌株的寄主全為茶樹，F(xiàn)3中菌株的寄主則全為其他木本植物；Q2群中3個菌株也可以分為2類，其中AMX、RFS為一類，寄主為茶樹，YW寄主為魚尾葵，是非茶木本植物；Q3也可以再分為3個分支，分別為F4、F5、F6，F(xiàn)6中菌株的寄主全部為茶樹，F(xiàn)4、F5中菌株的寄主全部為非茶樹木本植物。從整個聚類樹來看，HQ與F1較近，且Q1、Q2、Q3中菌株寄主既有茶樹又有非茶木本植物，這說明供試炭疽菌存在一定的寄主專化性，但不具有嚴格的寄主專化性。在F1群中，菌株RTG與其余菌株存在較大的遺傳差異；在F2群中，ZRG與其余菌株存在較大的遺傳差異。

2.3供試植物炭疽菌rDNA-ITS序列差異比較

38株炭疽病病菌菌株的T、A、C、G堿基出現(xiàn)的平均概率分別為23.6%、23.4%、27.5%、25.5%，寄主為茶樹的炭疽菌T、A、C、G堿基出現(xiàn)的平均概率分別為23.8%、23.5%、27.1%、25.6%，其他木本植物T、A、C、G堿基出現(xiàn)的平均概率分別為23.1%、23.3%、28.2%、25.4%，由此可以看出，寄主為茶樹與其他木本植物炭疽菌的各堿基出概率差別不明顯。各菌株rDNA基因存在一些堿基差異，以T堿基為例，出現(xiàn)的概率為21.9%～25.2%，茶樹與其他木本植物病原菌沒有明顯差異。25株寄主為茶樹的菌株基因序列長度為507～527 bp，其他木本植物基因序列長度為506～526 bp，兩者差別[CM（25]不大。供試菌株rDNA-ITS序列長度多樣性不豐富。采[CM）]

用MEGA 5.1計算38株炭疽病病菌菌株之間的遺傳距離，發(fā)現(xiàn)全部菌株的平均遺傳距離約為0.046，說明各菌株間的遺傳距離較小，其中最大遺傳距離為0.119，最小遺傳距離為0。

多基因序列比對的部分結(jié)果如圖3所示，堿基的變異多出現(xiàn)在ITS1區(qū)，炭疽菌種間與種內(nèi)均存在豐富的遺傳多樣性，比較38株供試菌株ITS序列，發(fā)現(xiàn)侵染茶樹的炭疽病病菌在第5 bp基因位點上均比侵染其他木本植物的炭疽病病菌多1個A堿基（圖3中箭頭所指位置），這可能與病原菌與寄主長期互作有關(guān)系。

3結(jié)論與討論

研究表明，以基因序列為基礎(chǔ)的核酸分析技術(shù)來評價物種之間的親緣關(guān)系是可行的，rDNA基因區(qū)域中18S與28S區(qū)域相對保守，屬內(nèi)差別不大，可用于屬的分類鑒定，ITS區(qū)域序列多樣性豐富，被普遍應用于真菌種的鑒定中[10]。

本研究通過擴增供試38株炭疽病病菌的rDNA-ITS序列，并對其基因序列進行研究，發(fā)現(xiàn)供試菌株之間存在豐富的堿基序列差異，序列比較結(jié)果表明，菌株間的ITS序列同源性較高，但仍存在多種不同類型的堿基及序列變異，包括堿基的缺失、突變、插入等，這與ITS區(qū)段為非結(jié)構(gòu)基因、進化速度比結(jié)構(gòu)基因快有關(guān)[11]。與其他木本植物炭疽菌相比，茶樹炭疽菌在5 bp基因位點上存在特異的堿基A，這一堿基變異可能與炭疽病病菌適應寄主茶樹有關(guān)，還需擴大供試其他木本植物范圍進行驗證，進一步研究該變異與病原菌侵染性的關(guān)系。ITS序列的變異雖不一定是造成炭疽菌能侵染茶樹的原因，但這些變異可能使病原菌更易侵染茶樹或者在茶樹體內(nèi)更好地生長。此外，還需對與病原菌侵染寄主直接相關(guān)的基因進行研究，以便更好地了解炭疽病病菌侵染茶樹的內(nèi)在機制。

遺傳多樣性檢測分析結(jié)果表明，供試茶樹炭疽菌rDNA-ITS[CM（21*3]基因序列與其他植物炭疽菌存在一定的特異性，[CM）]

但特異性不明顯。同一采集地區(qū)的供試菌株在聚類圖上沒有相似性，說明供試菌株在福建省內(nèi)沒有地理來源特異性。

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