沙田柚GDSL酯酶/脂肪酶基因的鑒定及序列分析

劉玉潔+郭丹妮+張渝+覃信梅+李惠敏+秦新民

摘要：利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)沙田柚自交和異交花柱進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過(guò)差異分析得到GDSL酯酶/脂肪酶的基因序列，該基因全長(zhǎng)1 306 bp（GenBank登錄號(hào)：KU159279），開(kāi)放閱讀框（簡(jiǎn)稱ORF）全長(zhǎng)1 104 bp，共編碼367個(gè)氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)分子量為40.09 ku，理論等電點(diǎn)為6.44，含有1個(gè)與SGNH蛋白相同的保守結(jié)構(gòu)域（conserved active sites，簡(jiǎn)稱CAS）；GDSL基因在沙田柚自交1 d花柱中的表達(dá)量（簡(jiǎn)稱RPKM）為4.68，2 d為2.41，3 d則迅速下降到0.27；在異交1 d花柱中該基因的表達(dá)量為4.48，2 d迅速升高至7.43，3 d仍維持較高水平為4.37；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，沙田柚GDSL酯酶/脂肪酶基因與甜橙（Citrus sinensis）親緣關(guān)系很近，屬于同一進(jìn)化分支。

關(guān)鍵詞：沙田柚；GDSL酯酶/脂肪酶基因；序列分析；鑒定

中圖分類號(hào)： S666.301文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）11-0045-04[HS）][HT9.SS]

植物自交不親和是指具有完全花且能夠產(chǎn)生雌雄配子，雌蕊的柱頭或花柱能特異性識(shí)別與自體基因型相同的花粉，導(dǎo)致花粉不萌發(fā)或花粉管停止生長(zhǎng)的一種現(xiàn)象[1]。在高等植物中，據(jù)估計(jì)有超過(guò)一半的顯花植物表現(xiàn)出自交不親和性，這種現(xiàn)象在被子植物中尤其明顯[2]。自交不親和對(duì)植物保持遺傳多樣性以及雜種優(yōu)勢(shì)有著極其重要的作用。

目前，植物自交不親和性的研究取得了較大進(jìn)展。在茄科、車前草科、罌粟科，自交不親和物種利用胞外核糖核酸酶（簡(jiǎn)稱S-RNase）阻止花粉管的生長(zhǎng)[3]。在薔薇科、玄參科中，自交不親和現(xiàn)象受S位點(diǎn)相關(guān)的F-box基因SLF的調(diào)控，這些基因能在花粉中特異性表達(dá)[4]。此外，一些基因也參與了植物自交不親和反應(yīng)，如參與防御的蛋白質(zhì)可能在花粉萌發(fā)以及花粉管延伸到生長(zhǎng)停止、破裂等一系列過(guò)程中發(fā)揮作用[5]。Distefano等發(fā)現(xiàn)與花粉特異性識(shí)別以及花粉管定向生長(zhǎng)有關(guān)的蛋白表現(xiàn)出多樣化特性[6]。鈣離子在調(diào)節(jié)花粉管的生長(zhǎng)方面也有重要作用[7-8]。

沙田柚屬于配子體高度自交不親和的果樹(shù)。目前，沙田柚自交不親和的研究在蛋白質(zhì)化學(xué)、細(xì)胞學(xué)、形態(tài)學(xué)方面取得了一定的進(jìn)展。薛妙男等發(fā)現(xiàn)，沙田柚自交花粉管停止生長(zhǎng)的位置在花柱的1/2處[9]。楊繼華等對(duì)沙田柚自交花柱特異蛋白的分子量、等電點(diǎn)、N-末端氨基酸序列進(jìn)行了測(cè)定[10-11]。秦新民等對(duì)沙田柚花粉管特異蛋白進(jìn)行了分離和鑒定[12]。同時(shí)，花柱通道細(xì)胞中特異蛋白以及花粉管中特異蛋白的產(chǎn)生部位及分布也得到確定[13-15]。

GDSL酯酶/脂肪酶因具有保守結(jié)構(gòu)域（GDS）（L）保守區(qū)而得名，其中，G、D、S分別代表甘氨酸、天冬氨酸、絲氨酸。目前，尚未見(jiàn)GDSL酯酶/脂肪酶基因與植物授粉和自交不親和性相關(guān)的研究報(bào)道。筆者對(duì)沙田柚自交和異交花柱進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)對(duì)所測(cè)的Unigenes功能進(jìn)行注釋，獲得了沙田柚GDSL酯酶/脂肪酶基因，對(duì)該基因編碼蛋白質(zhì)的理化特征、在沙田柚自交與異交花柱中的表達(dá)進(jìn)行了分析，旨在為深入研究GDSL酯酶/脂肪酶基因的生理功能以及沙田柚自交不親和的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

沙田柚試驗(yàn)材料取自廣西壯族自治區(qū)桂林市靈川縣潮田鄉(xiāng)大山口村果園10年生結(jié)果樹(shù)。取盛花期人工自交授粉（沙田柚×沙田柚）和異交授粉（酸柚×沙田柚）后1～3 d的花柱及當(dāng)天開(kāi)花的未授粉的花柱為試材，立即于液氮中速凍，并保存在-80 ℃超低溫冰箱中。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1RNA的提取、建庫(kù)及測(cè)序

RNA的提取按改良的 Trizol 法[16]進(jìn)行，RNA檢測(cè)合格后交由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司建庫(kù)測(cè)序，每個(gè)樣品產(chǎn)生8 Gb數(shù)據(jù)（資料另文發(fā)表）。首先用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，然后將 mRNA 隨機(jī)打斷成片段，以這些RNA片段為模板，用隨機(jī)引物合成第1條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、核糖核酸酶H（簡(jiǎn)稱RNase H）、DNA聚合酶Ⅰ（簡(jiǎn)稱DNA polymeraseⅠ）合成第2條cDNA鏈。cDNA鏈經(jīng)試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫之后做末端修復(fù)、加poly（A）并連接測(cè)序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)文庫(kù)插入片段大小，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制備好的文庫(kù)用Illumina HiSeqTM 2000進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2[JP+1]序列分析和系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建

使用DNAman、SWISS-MODEL、NetPhos 2.0、TMPRED、Finder等軟件對(duì)測(cè)序所得序列進(jìn)行序列及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析。基于氨基酸序列 GDSL 酯酶/脂肪酶基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)用DNAman軟件進(jìn)行構(gòu)建。[JP]

2結(jié)果與分析

2.1基因的生物信息學(xué)分析

沙田柚GDSL酯酶/脂肪酶基因（[WTBX][STBX]Unigene17983_All）全長(zhǎng)序列為1 306 bp（GenBank登錄號(hào)：KU159279），使用NCBI網(wǎng)站的NCBI ORF Finder和生物信息學(xué)軟件DNAman進(jìn)行分析，該序列包含1個(gè)1 184 bp的開(kāi)放閱讀框（簡(jiǎn)稱ORF），編碼367個(gè)氨基酸（圖1）。[FL）]

2.2編碼蛋白質(zhì)的分析和疏水性預(yù)測(cè)

在線軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）分析表明，該基因編碼的蛋白質(zhì)分子量（簡(jiǎn)稱MW）為40.09 ku，等電點(diǎn)（簡(jiǎn)稱pI）為6.44。該蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的氨基酸（Asp+Glu）總數(shù)為26，帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys）總數(shù)為24；分子式為C1 771H2 749N483O540S20；不穩(wěn)定系數(shù)為38.54，屬于穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)。

蛋白質(zhì)序列的疏水性用DNAman軟件分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。此基因所編碼肽鏈的疏水性平均值為-0.144，為親水性蛋白。

2.3功能結(jié)構(gòu)域分析

用NCBI的安全域架構(gòu)檢索工具（Conserved Domain Architecture Retrieval Tool）分析編碼的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)具有1個(gè)與SGNH蛋白相同的CAS保守結(jié)構(gòu)域（圖3）。

2.4跨膜預(yù)測(cè)

運(yùn)用跨膜蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（簡(jiǎn)稱TMbase）（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）預(yù)測(cè)該蛋白的跨膜區(qū)域。由圖4可知，此蛋白共有9個(gè)跨膜區(qū)，其中1～21位、78～98位、218～236位、273～296位氨基酸的跨膜方向?yàn)橛蓛?nèi)[CM（25]向外，分值分別為12、88、227、283。而2～21位、78～96、[CM）]

218～236、275～295、292～321位氨基酸的跨膜方向?yàn)橛赏獾絻?nèi)，分值分別為10、88、227、285、308。

2.5蛋白質(zhì)磷酸化預(yù)測(cè)

通過(guò)在線蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析軟件（簡(jiǎn)稱NetPhos 2.0 Server），對(duì)GDSL酯酶/脂肪酶基因所編譯的蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，該多肽鏈分值在0.5以上可能的磷酸化位點(diǎn)共有19個(gè)（圖5）。其中絲氨酸（Ser）可能的磷酸化位點(diǎn)共有9個(gè)，分別位于肽鏈的36、47、152、155、279、283、284、293、343位；蘇氨酸[CM（25]（Thr）可能的磷酸化位點(diǎn)有4個(gè)，分別位于66、120、278位；酪氨酸的磷酸化位點(diǎn)有6個(gè)，分別位于109、174、195、245、275、336位。

2.6蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)在線分析軟件Predict Protein（http：//www.predictprotein.org/）對(duì)GDSL酯酶/脂肪酶二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，α-螺旋所占比例為32.7%，β-折疊所占比例為5.72%，無(wú)規(guī)則卷曲所占比例為61.58%。

利用SWISS-MODEL工具對(duì)該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)含有5個(gè)α-螺旋、5個(gè)β-折疊，其間由無(wú)規(guī)則卷曲連接。

2.7同源性分析

從GenBank[JP+1]數(shù)據(jù)庫(kù)中下載其他植物的GDSL酯酶/脂肪酶At1g29660類基因編碼的氨基酸進(jìn)行同源性分析，沙田柚GDSL酯酶/脂肪酶At1g29660類基因編碼的氨基酸序列與甜橙（Citrus sinensis，XM_006465091.1）的同源性為99%。在此基礎(chǔ)上，筆者下載了9種植物的GDSL酯酶/脂肪酶序列構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)，結(jié)果表明沙田柚GDSL酯酶/脂肪酶基因編碼的蛋白與蕓香科甜橙的親緣關(guān)系很近，屬于同一進(jìn)化分支（圖7）。[JP]

3結(jié)論與討論

氨基酸同源性分析可知，本研究所克隆的沙田柚 [WTBX][STBX]Unigene17983_All（GenBank登錄號(hào)：KU159279）基因與甜橙的GDSL酯酶/脂肪酶[WTBX][STBX]At1g29660同源性為99%，分析該基因編碼蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)具有1個(gè)與SGNH蛋白質(zhì)相同的保守CAS結(jié)構(gòu)域。GDSL酯酶/脂肪酶是脂肪水解酶超家族的一個(gè)亞家族，具有廣泛的底物特異性和專一性，能夠水解多種酯類物質(zhì)[17]。其中G、D、S分別代表甘氨酸、天冬氨酸、絲氨酸的殘基活性位點(diǎn)在N末端[18-21]。其活性位點(diǎn)非常靈活，因其活性位點(diǎn)與底物結(jié)合導(dǎo)致構(gòu)象改變而使其有更加廣泛的底物結(jié)合性，因此它的底物特異性較為廣泛且具有多重功能[22-24]。

GDSL酯酶/脂肪酶是一個(gè)多基因家族，廣泛參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、器官形態(tài)建成、次生代謝和逆境脅迫等生理活動(dòng)[17]。其中GDSL酯酶/脂肪酶與植物授粉和胚胎發(fā)育密切相關(guān)。Kondou等發(fā)現(xiàn)擬南芥[WTBX][STBX]RGE1基因可能在胚乳中表達(dá)并且調(diào)節(jié)胚胎的發(fā)育[25]。EXL4是GDSL脂肪酶家族的一員，編碼的花粉壁蛋白是胞外脂肪酶，能夠促進(jìn)柱頭水化作用的開(kāi)始[26]，而其中1個(gè)擬南芥角質(zhì)水解酶（cuticle destructing factor 1，簡(jiǎn)稱CDEF1）能夠水解柱頭表面的角質(zhì)層，進(jìn)而促進(jìn)花粉管穿透柱頭[27]。而本研究中所克隆的GDSL酯酶/脂肪酶為GDSL酯酶/脂肪酶At1g29660，GDSL基因在沙田柚自交1 d花柱中表達(dá)量（簡(jiǎn)稱RPKM）為4.68，2 d為2.41，3 d則迅速下降到0.27。而在異交1 d花柱中該基因的表達(dá)量為448，2 d迅速升高至7.43，3 d仍維持較高水平（4.37）。薛妙男等發(fā)現(xiàn)，沙田柚自交和異交條件下花粉的萌發(fā)和穿過(guò)柱頭的過(guò)程沒(méi)有差異，但花粉管在花柱中的生長(zhǎng)情況與自交和異交顯著相關(guān)，在自花授粉后2～3 d花粉管在花柱的1/2處生長(zhǎng)受阻，同時(shí)花粉管壁增厚，出現(xiàn)胼胝質(zhì)的積累；而異交花粉管生長(zhǎng)正常，最終進(jìn)入胚囊受精[9]。觀察沙田柚花柱通道細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征發(fā)現(xiàn)，自花授粉后2～3 d，花柱通道細(xì)胞處于衰退狀態(tài)，表現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體逐漸解體并液泡化[13]。GDSL基因在沙田柚自交1 d與異交1 d花柱中的表達(dá)基本相同，而在2～3 d自交花柱中的表達(dá)量快速下降，與自花授粉后2～3 d花柱通道細(xì)胞處于衰退狀態(tài)在時(shí)間上吻合，推測(cè)GDSL基因表達(dá)量的快速下降造成了細(xì)胞內(nèi)酯類物質(zhì)代謝受阻。至于GDSL基因在沙田柚自交不親和性反應(yīng)中的功能有待進(jìn)一步證實(shí)。

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