陜西省水稻Wx基因種質資源遺傳多樣性分析

張羽 李小剛 王保軍 王業文 王俊義

摘要：稻米品質與稻米中直鏈淀粉含量（AC）有關，而直鏈淀粉含量與蠟質基因（Wx）的基因型有關，研究表明Wx基因第一內含子的剪接效率決定直鏈淀粉含量。明確陜西省主要水稻種質資源中Wx基因的基因型，可為水稻品質育種提供依據。應用CAPS法對112份陜西省水稻主要種質資源Wx基因第一內含子供體+1位堿基G/T進行檢測，根據G/T堿基將112份供試材料的Wx基因分為GG、GT、TT等3種基因型。同時，按國標檢測3種不同G/T型37份稻米的直鏈淀粉含量及其他相關性狀。結果顯示，112份供試材料中有1份材料為GG型，約占1%；25份為GT型，占22%；86份材料為TT型，約占77%。說明Wx基因第一內含子供體+1位堿基G/T的多態性與AC含量有良好的對應關系，與堊白粒率和堊白度有一定的對應關系。

關鍵詞：陜西省；水稻；蠟質基因（Wx）；基因型；剪接效率；支鏈淀粉含量；稻米品質；育種

中圖分類號： S511.033文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）11-0059-04[HS）][HT9.SS]

稻米品質主要是指稻米的外觀品質和蒸煮食用品質，其中直鏈淀粉含量、糊化溫度、膠稠度、堊白度等是衡量稻米蒸煮食用品質的主要指標，而直鏈淀粉含量則是稻米品質優劣的決定因素[1]。直鏈淀粉含量高的稻米較直鏈淀粉含量低的稻米硬，飯粒松散，脹性好。隨著人們生活水平的提高以及用途和地域的不同，人們對直鏈淀粉含量的要求也不盡相同，直鏈淀粉含量已經成為水稻品質育種的一個重要方面[2-8]。研究發現，蠟質基因（Wx）編碼的結合在淀粉粒上的淀粉合成酶，是水稻中控制直鏈淀粉合成的主要基因，非糯性基因（Wx）對糯性基因（wx）表現為不完全顯性，存在較為明顯的劑量效應，Wx基因序列由于SNP變異產生了一些復等位基因，如Wxa、Wxb、Wxop 和Wx-mq，其直鏈淀粉含量也因為SNP變異導致各不相同，Wxa的直鏈淀粉含量較高，Wxb、Wxop和Wx-mq的直鏈淀粉含量較低。在Wx的分子標記研究中，Bligh等報道利用和Wx基因緊密連鎖的微衛星（CT）n標記進行Wx基因多態性檢測[9]。隨著對水稻蠟質基因表達調控規律的深入研究，表明稻米中直鏈淀粉含量是由該品種蠟質基因第一內含子的剪接效率決定的，若蠟質基因第一內含子供體+1位是正常的堿基G，蠟質基因第一內含子能被正常剪接，水稻胚乳中就能產生較多的蠟質基因成熟mRNA，淀粉合成酶的量就較多，胚乳中直鏈淀粉含量就高；反之，蠟質基因第一內含子供體+1位突變成T后，蠟質基因第一內含子利用別的剪接位點進行剪接，剪接效率低，胚乳中產生的蠟質基因成熟mRNA的量較少，淀粉合成酶的量也較少，相應的胚乳中直鏈淀粉含量也較低。Ayres等最早根據Wx基因第一內含子供體+1位的這種G/T多態性，設計了PCR-ACCI酶切法，即蠟質基因第一內含子供體+1位是G時，它能與旁鄰的堿基構成ACCI的酶切識別序列AGGTATA，使含AGGTATA序列的擴增片段能被ACCI酶切，而含AGTTATA序列的不能被ACCI酶切[10]。隨后，很多研究人員對此結論進行了驗證和深入研究，充分證明Wx基因第一內含子供體+1位G/T多態性影響稻米直鏈淀粉含量[11-17]。本試驗通過CAPS方法對112份水稻樣品Wx的G/T多態性進行研究，同時利用國標法[18]對37份不同Wx基因型的米樣測定其直鏈淀粉含量及相關性狀，為陜西省稻米品質育種提供依據。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為陜西省水稻研究所提供。

1.2方法

1.2.1基因組提取及PCR

水稻基因組DNA采用SDS法提取，并采用1%瓊脂糖凝膠檢測基因組DNA的質量。PCR反應體系為：2×Taq Master Mix 15 μL，10 μmol/L正反引物各 1 μL，DNA模板1 μL，反應總體積30 μL，用ddH2O補足。反應程序為：94.0 ℃預變性5 min；94.0 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72.0 ℃延伸1 min，35個循環；最后72.0 ℃延伸10 min，4 ℃保存；8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR產物，銀染法顯色拍照。

1.2.2引物設計

Wx基因G/T多態性利用Ayres等設計的酶切擴增多態性序列標記Wx484/W2R-ACCI酶切分析，上游引物為Wx484，序列為5′-CTTTGTCTATCTCAAGACAC-3′；下游引物為W2R，序列為5′-TTTCCAGCCCAACACCTTAC-3′。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，ACCI酶購自Thrmo Scientific。

1.2.3直鏈淀粉含量（AC）及其他性狀的測定

從供試的113份材料中隨機選取有3種基因型的材料37份，按照NY/T 593—2013《食用稻米品質》標準進行糙米率、精米率、長寬比等性狀的計算。然后用旋風式粉碎磨（JFS-13A型）磨粉，再經100目篩后放置烘箱內經60 ℃干燥過夜。準確稱取025 g淀粉小心放入50 mL 容量瓶，加入0.5 mL 95%乙醇，輕搖，使樣品濕潤分散。再加入 4.5 mL 1 mol/L NaOH 溶液，用堿液將瓶壁上黏附的樣品沖洗下去，然后沸水浴 10 min，冷卻至室溫，用超純水定容至50 mL，混勻后取其樣液 2.5 mL，加入已盛有半瓶蒸餾水的50 mL容量瓶中，再向容量瓶中加入0.5 mL 1 mol/L乙酸溶液，使樣品酸化，加0.75 mL碘試劑溶液（0.12 mol/L KI，0.008 mol/L I2），充分搖勻，用蒸餾水定容，靜置20 min，以0.09 mol/L NaOH溶液為空白對照，利用紫外分光光度計（752型）于620 nm 波長處測定吸光度，根據標準曲線回歸方程y=0.738 2x-0.036 7（r2=0.998 6，標準曲線由不同含量的直鏈淀粉按國標規定方法配置標樣測定產生）計算表觀直鏈淀粉含量，每個樣品3次重復，其平均值作為該樣品的AC含量。

2結果與分析

2.1供試材料Wx基因的G/T多態性

CAPS標記Wx484/Wx2R-ACCI檢測結果表明，112份材料中有86份材料基因為TT，約占總試材料的77%，酶切后只有1條257 bp的條帶；25份材料基因為GT，約占總試材料的22%，酶切后既有257 bp的片段，也有129、128 bp的片段；只有1份材料基因為GG，約占總試材料的1%，酶切后只有 128 bp 左右的片段。

2.2Wx基因G/T多態性與水稻恢保種類的關系

[JP2]112份供試材料中有76份恢復系材料，其中70份Wx基因型為TT，占92.11%，6份基因型為GT，占7.89%。有20份保持系材料，[JP3]其中4份基因型為TT，占20%，15份基因型為GT，占75%，1份基因型為GG，占5%。供試的恢復系材料中Wx基因型主要為TT，而保持系材料的Wx基因型主要為GT（表1）。[JP]

2.3Wx基因G/T多態性與其他性狀的關系

從3種基因型材料中隨機抽取37份材料進行相關性狀和直鏈淀粉含量測定，結果如表2所示。

37份材料的直鏈淀粉含量在9.3%～21.9%之間，其中基因型為GG和GT的材料直鏈淀粉含量在12.29%～2188%之間，基因型為TT的材料直鏈淀粉含量在9.26%～19.65%之間。從研究結果看，基因型為GT的直鏈淀粉含量較高，平均為18.64%，糙米率平均為76.69%，精米率平均為67.64%，整精米率平均為56.36%，米粒長寬比平均為2.79，堊白粒率平均為69.83%，堊白度平均為16.35%。而基因型為TT的材料直鏈淀粉含量較低，平均為13.81%，糙米率平均為77.22%，精米率平均為66.43%，整精米率平均為4665%，米粒長寬比平均為2.63，堊白粒率平均為22.57%，堊白度平均為799%。

3討論與結論

隨著人們生活水平的提高，對品質要求越來越高，同時地處不同區域的人們由于生活習慣口味不同，對米質要求也各不相同，另外不同的稻米加工對直鏈淀粉含量的要求也不一致。TT基因型的材料直鏈淀粉含量較低，GT基因型的材料直鏈淀粉含量較高，TT基因型的材料其堊白粒率和堊白度比GT基因型的材料低。供試的陜西省主要水稻種質資源中保持系材料和恢復系材料占85.71%，其中恢復系材料的Wx基因型大部分為TT，而保持系材料的Wx基因型大部分為GT，因此雜交種Wx基因型可能為TT或GT，TT基因型的品種直鏈淀粉含量較低，黏性強，適口性好，GT基因型的品種直鏈淀粉含量較高，黏性弱，膨脹性好。由于Wx基因型與AC含量有良好的對應關系，因此無需等種子成熟后測定AC含量，而在作物生長的任何時期可以根據育種需要，利用檢測Wx基因型來培育滿足要求的不同品種。由于供試材料中只有1份材料的Wx基因型是GG，其直鏈淀粉含量及其他所測性狀接近GG基因型材料。在長江上游秈稻種植區，科研人員在育種實踐中發現稻米品質由碾米品質、外觀品質、食味品質決定，其中直連淀粉含量是食味品質的重要指標之一。目前使用[CM參考文獻：

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[18]稻米直鏈淀粉含量的測定常規方法：ISO/TC 34 ISO 6647-2—2007[S].