土壤特征對黃花蒿酚類物質的影響

邸勝娟 羅世瓊 楊占南 鄭筑 胡娟 趙鋮

摘要：為探索影響黃花蒿酚類組分累積的土壤因素，測定了黃花蒿東莨菪內酯、貓眼草酚、貓眼草黃素含量及土壤養分含量、酶活性、微生物標記性磷脂脂肪酸（PLFAs）含量，并對其進行相關性及因子分析。結果表明，不同樣地黃花蒿東莨菪內酯含量、貓眼草酚含量、貓眼草黃素含量、根際土壤養分含量、酶活性及微生物PLFAs含量存在差異；土壤有效磷含量與東莨菪內酯含量呈顯著正相關（P<0.05），與黃花蒿貓眼草酚、貓眼草黃素含量呈極顯著正相關（P<001）；速效鉀含量與貓眼草黃素含量呈顯著正相關（P<0.05）；有速效鉀、有效磷是影響黃花蒿東莨菪內酯、貓眼草酚、貓眼草黃素含量的主要因子。人工栽培黃花蒿可結合當地土壤實際狀況，適量增施磷肥與鉀肥，可促進黃花蒿東莨菪內酯、貓眼草酚、貓眼草黃素含量的增加，這為人工栽培黃花蒿，提高黃花蒿的品質提供了科學的理論依據。

關鍵詞：黃花蒿；酚類物質；養分；酶活性；磷脂脂肪酸

中圖分類號： S567.21+9.06文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）11-0085-05[HS）][HT9.SS]

黃花蒿（Artemisia annua L.） 為菊科蒿屬一年生草本植物，具有重要的醫藥功能，作為中藥材已有上千年的歷史[1]。例如，從黃花蒿葉中分離提取的青蒿素被世界衛生組織列為治療瘧疾的首選藥物[2]。受不同生長環境如氣候、土壤等因素的影響，黃花蒿藥效組分含量差異明顯（青蒿含量 001%～1.50%，總多酚含量56～530 mg/g）[3]。目前，有關產地、生長階段、施肥等因素對黃花蒿藥效組分的影響已有文獻報道[4]，黃花蒿主要揮發性組分隨不同產地及種植環境不同而差異顯著[5]；黃花蒿葉片中青蒿素含量在花蕾前期最高，隨著生長時間的延長，其含量反而降低[6]；施肥對黃花蒿抗瘧相關組分有一定的影響[7]。然而，關于土壤條件對黃花蒿酚類物質影響的報道較少。黃花蒿藥效組分含量總是受到生長環境的影響[8]，其土壤條件是一個重要的影響因素，因為土壤與植物根系復雜的物理、化學及生物過程，必然影響養分、酶活性及微生物特征[9-13]，從而影響黃花蒿根系對養分的吸收，進而影響黃花蒿藥效組分的含量。因此，研究土壤環境因素對黃花蒿藥效組分的影響，對提高其藥效組分含量，實現提高其藥材品質具有重要意義。

我國野生黃花蒿資源豐富，尤以西南地區品種最多，分布面積較大。有報道指出，位于亞熱帶季風氣候區的貴州、廣西、重慶和湖南等地適宜野生黃花蒿的人工種植[14]。研究證實黃花蒿酚類物質包括東莨菪內酯、貓眼草酚、貓眼草黃素，該類物質具有協同青蒿素提高其抗瘧和抗癌作用，并具有較高的抗氧化活性[15]。黃花蒿酚類組分含量的變化引起了人們的廣泛關注。本試驗采樣地點選擇氣候條件基本一致的貴州省黎平縣、劍河縣以及榕江縣等6個采樣點，通過采集在相似氣候條件下不同土壤中生長的黃花蒿植株及根際土壤，對野生黃花蒿葉片酚類物質（東莨菪內酯、貓眼草酚、貓眼草黃素）含量與土壤養分、酶活性以及微生物磷脂脂肪酸（PLFAs）含量進行測定，并對其進行相關性分析及因子分析，探索黃花蒿土壤特征對黃花蒿酚類物質累積的影響因素，為提高人工栽培黃花蒿的品質提供科學的理論依據。

1材料與方法

1.1試驗區域選擇

采樣地點位于貴州省黔東南苗族侗族自治州劍河縣、榕江縣、黎平縣，均屬亞熱帶濕潤季風氣候，年平均氣溫15.6～18.1 ℃，無霜期310～326 d，降水量1 093.2～1 226.5 mm，采樣地點氣候條件基本一致。樣地均為典型的丘陵山區地形地貌，黃花蒿自然生長均在3年以上，形成了優勢植物，群落內以及周圍含有雜草，沒有木本植物。

1.2樣品采集

采樣時間為2015年8月，在花蕾期采集黃花蒿植株及根際土壤。每個樣地隨機采集長勢基本一致的黃花蒿植株以及根際土壤，采集生長土壤時，挖取黃花蒿植株，抖掉易脫落的土壤，收集黏附于根系表面的土壤（每株約20 g）。取樣后，將土樣平均分成2份，裝入無菌塑料樣品袋，迅速運回實驗室，剔除石塊、植物殘根等雜質，一份自然風干，檢測土壤理化性質及酶活性，另一份于-4 ℃冰箱中保存，用于測定土壤微生物標記性的磷脂脂肪酸含量；收集新鮮黃花蒿葉片，測定東莨菪內酯、貓眼草酚、貓眼草黃素的含量，取少量葉片于60 ℃烘干測定水分系數。采集黃花蒿樣點的地理信息及土壤類型如表1所示。

1.3測定項目與方法

采用常規方法檢測土壤基本理化性質[16]，土壤pH值采用玻璃電極法（25 mL水、5 g土） 測定；有機質含量采用重鉻酸[CM（25]鉀氧化-外加熱法測定；土壤全氮、全磷、全鉀含量的測定[CM）][FL）]

色法、1 mol/L乙酸銨浸提-火焰光度法。土壤脲酶活性測定采用苯酚-次氯酸鈉比色法[17]；蔗糖酶活性測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法[18]；磷酸酶活性測定采用磷酸苯二鈉比色法[19]。

黃花蒿葉片東莨菪內酯、貓眼草酚、貓眼草黃素含量采用高效液相色譜儀（HPLC-20AT）分析[20]，將黃花蒿新鮮葉片用研缽磨碎，精確稱取0.500 0 g，加入20 mL無水乙醇，靜置過夜，超聲處理30 min，過濾，采用色譜柱Waters PAH C18 （250 mm × 4.6 mm × 5 μm）、二極管陣列檢測器及Lc-solusion 2.5色譜工作站，流動相A相乙腈、甲醇體積比為 11 ∶[KG-*3]5，B相水、甲酸體積比為0.1 ∶[KG-*3]100，檢測波長為345 nm，梯度洗脫，通過外標法計算其含量。

新鮮土壤微生物PLFAs含量采用氣相色譜-質譜聯用儀（GCMS-QP2010）分析。參照Bligh等的方法[21]對土壤微生物的PLFAs進行提取；色譜柱為HP-5MS（30 m×0.25 mm×0. 25 μm）石英毛細管色譜柱；升溫程序為70 ℃（5 min），以20 ℃/min升至190 ℃（1 min），以5 ℃/min升至200 ℃（2 min），再以10 ℃/min 升至280 ℃（8 min）；進樣口溫度為250 ℃；離子源溫度為230 ℃；載氣為He（0.9 mL/min）；分流比為10 ∶[KG-*3]1，質量掃描范圍30～500 m/z。內標為十九烷酸甲酯標準品，土壤微生物脂肪酸甲酯混和標樣為細菌酸甲酯混合物（bacterial acid methyl esters mix，47080-U，Sigma-Aldrich）。

按照Frostegard等的方法[22]對PLFAs進行命名。細菌類群的PLFAs為2-OH 10：0、11：0、12：0、2-OH 12：0、3-OH 12：0、13：0、14：0、2-OH 14：0、15：0、i15：0、α15：0、16：0、2-OH 16：0、i16：0、i17：0、ω7c16：1、cy17：0、17：0、cy17：0。其中格蘭氏陽性細菌（G+）為i15：0、α15：0、i16：0、i17：0；格蘭氏陰性細菌（G-）為2-OH 10：0、2-OH 12：0、3-OH 12：0、2-OH 14：0、2-OH 16：0、16：1ω7c、cy17：0、cy19：0[21-22]。真菌類群為18：2ω6，9、18：1ω9c，18：1ω9t。放線菌類群為10Me18：0。線蟲為20：0[23]。

1.4統計分析

每組試驗均作空白處理和3組平行試驗。數據通過 Excel 進行整理和繪圖，采用SPSS 18.0統計軟件進行方差分析、單因素方差分析檢驗樣地間酚類物質、土壤特征是否存在顯著性差異；多重比較采用LSD法；土壤特征與黃花蒿酚類組分之間的相關性采用Pearson相關分析；黃花蒿酚類組分的土壤影響因素采用因子分析。

2結果與分析

[HTK]2.1黃花蒿酚類物質含量分析[HT]

由圖1可知，東莨菪內酯、貓眼草酚和貓眼草黃素含量分別為490.6～1 283.6、82.1～348.3、232.5～587.6 mg/kg，并且其含量表現為東莨菪內酯>貓眼草黃素>貓眼草酚；東莨菪內酯含量較高的樣地為QH-T1、QH-T2、QH-T3，貓眼草酚含量較高的樣地為QH-T1、QH-T3，貓眼草黃素含量較高的樣地為QH-T1；QH-T3、QH-T4樣地樣品的東莨菪內酯、貓眼草酚、貓眼草黃素含量均差異顯著；東莨菪內酯、貓眼草酚、貓眼草黃素含量最高分別是最低的2.61、4.24、2.53倍。說明黃花蒿東莨菪內酯、貓眼草酚、貓眼草黃素含量受氣候條件及土壤環境等多因素的綜合影響。

2.2黃花蒿土壤養分特征

由表2可知，不同黃花蒿樣地土壤pH值存在差異，pH值在6.13～7.65之間。棕壤和黃棕壤的pH值高于黃壤。土壤全量養分是衡量土壤肥力的重要指標之一，且不同土壤類型的土壤全量養分不同。測定樣品土壤中全氮含量最高的是最低的2.38倍，土壤全磷含量最高的是最低的6.19倍，而全鉀含量最高的是最低的2.04倍。黃花蒿土壤全氮、全磷含量與東莨菪內酯、貓眼草酚、貓眼草黃素含量變化沒有明顯的規律性關系，說明土壤全氮、全磷對黃花蒿東莨菪內酯、貓眼草酚、貓眼草黃素含量的變化沒有直接影響。不同樣地樣品的黃花蒿土壤堿解氮、有效磷、速效鉀含量分別在16.95～75.61、5.54～47.59、42.04～613.78 mg/kg之間。圖1顯示QH-T4樣品的黃花蒿東莨菪內酯、貓眼草酚、貓眼草黃素含量均較低，其土壤堿解氮、有效磷、速效鉀含量也較低，說明黃花蒿土壤有效養分有助于植物根系吸收養分，提高植物內部營養元素的形成，這與相關文獻報道的結果[14]基本一致。不同樣地黃花蒿土壤有機質含量在7.00～ 29.70 g/kg之間，有機質含量較高的QH-T5、QH-T6樣品，其堿解氮和有效磷含量也較高，而有機質含量最低的QH-T4樣品，其堿解氮和有效磷含量也較低，說明土壤有機質不但是土壤肥力的重要指標，也是土壤中氮和磷的重要來源。

2.3黃花蒿土壤酶活性特征

土壤酶作為土壤生態系統最為活躍的生物活性物質，能夠促進物質循環與能量流動，某種程度上反映了土壤養分的動態轉化[24]。脲酶能催化尿素水解，土壤氮素狀況及理化性狀與其活性變化有關。由圖2可知，不同樣地土壤脲酶活性在11.94～27.25 mg/g之間（圖2-A），有些樣地間脲酶活性差異顯著，QH-T5樣品脲酶活性為27.25 mg/g，是QH-T4樣品脲酶活性（11.94 mg/g）的2.28倍；脲酶活性與堿解氮含量變化類似，QH-T5的堿解氮含量與脲酶活性均較高，說明脲酶能夠促進氮含量轉換和利用。蔗糖酶反映了土壤生物活性強弱與物質轉化的速度，由圖2-B可知，不同樣地黃花蒿土壤蔗糖酶活性存在差異，在136.50～831.65 mg/g之間，有些樣地間蔗糖酶活性差異顯著，QH-T6樣品蔗糖酶活性為831.65 mg/g，是QH-T4樣品蔗糖酶活性（136.50 mg/g）的6.09倍，說明土壤生物活性強度與物質轉化的速度存在差異。磷酸酶能夠促進有機磷化合物分解，其活性直接影響土壤中磷的有效性，由圖2-C可知，不同樣地間黃花蒿土壤磷酸酶活性存在差異，在6.18～43.15 mg/g之間，有些樣地間磷酸酶活性差異顯著，QH-T6樣品的磷酸酶活性（43.15 mg/g）是QH-T4樣品磷酸酶活性（6.18 mg/g）的 6.98 倍，說明不同樣地間黃花蒿土壤中分解磷酸酶的能力存在差異。不同樣地樣品黃花蒿土壤脲酶、蔗糖酶以及磷酸酶活性的差異表明土壤類型影響土壤酶活性，從而影響其酚類物質的積累，主要體現在黃花蒿酚類物質含量的差異上。[FL）]

2.4黃花蒿土壤微生物特征

類群不同的土壤微生物，其活細胞的PLFAs組成成分具有相對的穩定性，通過其豐度及組成可對土壤微生物群落結構進行動態監測[25]。本試驗不同樣地黃花蒿土壤中共檢出19種PLFAs，包括細菌14種、真菌（C18：2ω6，9、18：1ω9c，18：1ω9t）、放線菌（10Me18：0）、線蟲（20：0）；不同樣地黃花蒿土壤微生物包括G+、G-、細菌、真菌、放線菌、線蟲。由表3可知，土壤微生物的PLFAs含量存在差異，G+、G-、細菌、真菌、放線菌、線蟲以及總微生物PLFAs的含量范圍分別為1.38～4.10、3.54～10.68、43.71～135.05、2.83～1080、477～787、0.48～0.84、54.87～147.62 mg/kg，有些樣地間PLFAs含量差異顯著，最高含量分別是最低含量的 2.97、301、309、3.81、1.65、1.75、2.69倍；黃花蒿土壤微生物的PLFAs含量均表現為細菌最高、線蟲最低，并且細菌的PLFAs含量占總微生物PLFAs的77.30%～ 91.48%，表明細菌在活化黃花蒿土壤養分方面起主要作用。變異系數反映了采樣點之間的平均變異程度，不同樣地黃花蒿土壤各種微生物PLFAs含量的變異系數均大于10%，為中等變異強度，表明不同樣地黃花蒿土壤微生物群落結構、豐度和組成成分存在差異。

2.5土壤特征與黃花蒿酚類組分含量的相關性分析

不同土壤類型，其理化性質也不同，黃花蒿酚類組分存在差異。由表4可知，東莨菪內酯含量與貓眼草酚、貓眼草黃素含量呈顯著正相關（P<0.05），表明黃花蒿東莨菪內酯、貓眼草酚、貓眼草黃素的累積是相互促進的。有機質具有改善土壤理化性質的重要作用，黃花蒿土壤有機質含量與酚類物質含量均未呈顯著相關，說明有機質并不直接影響黃花蒿酚類物質的累積，有機質含量與有效磷含量、堿解氮含量、全氮含量、全磷含量、磷酸酶活性、脲酶活性、蔗糖酶活性呈顯著或極顯著正相關（P<0.05或P<001），表明有機質可能是土壤氮和磷的來源。土壤pH值與微生物總PLFAs含量呈顯著負相關（P<0.05），與磷酸酶活性、蔗糖酶活性呈極顯著負相關（P<0.01），表明pH值的升高不利于微生物生長，同時減小酶的活性。土壤酶是土壤中具有生物活性的蛋白質，可與微生物共同推動土壤生物化學過程。磷酸酶可催化磷酸脂類或磷酸酐的水解，其活性直接影響土壤中磷的生物有效性，磷酸酶[CM（25]活性與土壤有效磷含量呈極顯著正相關（P<0.01），磷酸酶能將土壤中有機磷或無機磷轉化為植物可吸收利用的形態。黃花蒿土壤有效磷含量與東莨菪內酯、貓眼草酚、貓眼草黃素含量呈顯著或極顯著正相關（P<0.05或 P<0.01），說明土壤有效磷能夠促進黃花蒿葉片東莨菪內酯、貓眼草酚、貓眼草黃素含量的增加，主要源于磷酸酶的活化；土壤速效鉀含量與貓眼草黃素含量呈顯著正相關（P<0.05），全鉀含量與貓眼草酚、貓眼草黃素含量分別呈顯著正相關（P<0.05）、極顯著正相關（P<001），表明速效鉀可以促進貓眼草黃素含量的增加；土壤微生物總PLFAs含量與全鉀含量呈顯著正相關（P<005），說明黃花蒿土壤微生物可以活化土壤中的鉀，使得土壤中有效磷和速效鉀的含量得到提高，有利于黃花蒿對有效磷和速效鉀的吸收利用，從而促進黃花蒿植株的生長以及葉片中東莨菪內酯、貓眼草酚、貓眼草黃素的累積。

2.6土壤養分及微生物與黃花蒿酚類物質含量因子分析

對黃花蒿土壤有機質含量、全氮含量、全磷含量、全鉀含量、堿解氮含量、有效磷含量、速效鉀含量、脲酶活性、磷酸酶活性、蔗糖酶活性、微生物總PLFAs含量以及pH值影響黃花蒿東莨菪內酯、貓眼草酚、貓眼草黃素含量的12項指標進行因子分析，通過KMO（Kaiser-Meyer-Olkin）、Bartlett檢驗，結果得到KMO值為0573，P值為0.000，小于顯著水平005，表示適合做因子分析。由表5可知，前3個公共因子的特征值均大于1，累積方差貢獻率達到88.221%，表明前3個公共因子基本可以反映影響整個黃花蒿東莨菪內酯、貓眼草酚、貓眼草黃素含量因子的信息。

由于各因子負載值趨于兩極分化，對前3個公共因子采用方差極大正交旋轉后的因子載荷矩陣具有一定的生物學意義。基于各因子在某一成分的載荷大小確定其所起作用，由表6可知，速效鉀、有效磷含量和pH值3項指標對第1個公共因子起主要作用，方差貢獻率為54.293%。有機質含量、堿解氮含量、全氮含量、脲酶活性、磷酸酶活性、蔗糖酶活性、微生物總PLFAs含量等7個指標對第2個公共因子起主要作用，其方差貢獻率為 19.452%，全鉀、全磷含量這2項指標對第3個公共因子起主要作用，其方差貢獻率為14.068%。結果表明，影響黃花蒿東莨菪內酯、貓眼草酚、貓眼草黃素含量的主要因子有速效鉀、有效磷含量，其次為有機質含量、堿解氮含量、全氮含量、磷酸酶活性、脲酶活性、蔗糖酶活性、微生物總PLFAs含量，這和分析土壤特征與黃花蒿酚類組分相關性的結果基本一致。

3結論

通過不同樣地土壤特征與黃花蒿酚類物質含量的相關分析及因子分析，初步明確土壤有效磷含量能夠促進黃花蒿葉片東莨菪內酯、貓眼草酚、貓眼草黃素含量的增加，速效鉀含量能夠促進貓眼草黃素含量的增加；人工栽培黃花蒿可結合當地土壤實際狀況，適量增施磷肥與鉀肥，可促進黃花蒿東莨菪[CM（25]內酯、貓眼草酚、貓眼草黃素的累積。這為人工栽培

蒿，提高黃花蒿的品質提供了科學的理論依據。

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