錦鯉胚胎發育過程中幾種代謝酶活性及丙二醛含量的變化

史東杰 梁擁軍 饒青 朱莉飛 張升利

摘要：以錦鯉胚胎為研究對象，分別在受精初期、卵裂期、囊胚期、原腸期、胚體及器官形成期、出膜前期取樣，測定魚卵受精初期及胚胎發育不同時期超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性及丙二醛含量。結果顯示，錦鯉魚卵受精初期超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性及丙二醛含量均較低，隨著胚胎發育，酶活性及丙二醛含量均呈現上升趨勢。當發育至原腸期時，酶活性及丙二醛含量均顯著升高（P<0.05）；當胚胎發育至出膜前期時，酶活性及丙二醛含量繼續上升，且顯著高于以前各時期（P<0.05）。此時期，超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）活性及丙二醛（MDA）含量分別為受精初期的1.78、3.62、23.41、1.92倍。

關鍵詞：超氧化物歧化酶；磷酸酶；丙二醛；胚胎發育；錦鯉

中圖分類號： S917文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）11-0120-03[HS）][HT9.SS]

魚類在殼內的發育階段稱為胚胎發育，該階段是魚類個體發育最為關鍵的時期。在魚類早期發育生物學中，通常將魚類的胚胎發育分為受精期、卵裂期、囊胚期、原腸期、胚體及器官形成期、出膜前期等多個時期。魚類的細胞分化和組織、器官發育等均在胚胎發育過程中開始發生，因此魚類胚胎發育過程中生理代謝十分活躍[1]。同時，整個胚胎發育過程中只有卵殼的保護，易受到外界環境的破壞，因此需要較強的抗菌和免疫能力。酶是機體活細胞產生的一種生物催化劑，生命活動中的各類代謝化學反應、免疫反應均為酶促反應，因而特定酶的催化能力代表了機體特定動能的發育情況。超氧化物歧化酶（SOD）是一種重要的抗氧化酶，是機體清除超氧陰離子自由基的首要物質，它可對抗和阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，并可及時修復和保護細胞。酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）是非特異性磷酸單酯水解酶，分別在酸性和堿性環境下起催化作用，在動物DNA、RNA、蛋白質、脂類及機體免疫等代謝過程中起著重要的調控作用。丙二醛（MDA）含量通常被認為可反映機體脂質過氧化程度的指標，并具有毒性。因此，SOD、ACP、AKP這3種酶活性及MDA含量的變化可以反映動物機體生理生態變化、免疫機能及健康狀況[2-5]。本研究以錦鯉（Cyprinus carpio L.）為研究對象，旨在通過研究錦鯉胚胎發育過程中SOD、ACP、AKP這3種酶活性及MDA含量的變化規律，探討魚類胚胎發育過程和代謝調控機理。

1材料與方法

1.1受精卵采集

通過人工催產、干法受精，獲得受精卵，隨機分為3組，約1 000粒/組，置于含有500 mL試驗用水的培養皿（直徑 20 cm，高3 cm）中孵化。魚卵剛受精時立即取樣，然后用顯微鏡連續觀察受精卵，在以下各取樣點進行取樣，取樣點分別為：受精初期、卵裂期、囊胚期、原腸期、胚體及器官形成期、出膜前期，每個取樣點采集魚卵或胚胎約100粒（個）/皿，用濾紙吸干水，置于離心管中，-80 ℃保存待測。試驗用水為經過曝氣的自來水，水溫為（18±1）℃，pH值7.4，溶解氧≥5 mg/L，每24 h換水約1/2。胚胎發育過程中，及時清除未受精卵、死卵及異常發育的胚胎。

1.2樣品制備與測定

樣品制備參照孔祥會等的方法[6]進行。粗提液蛋白定量參照Bradford的測定方法[7]進行，標準蛋白為牛血清白蛋白（BSA，購于AMRESCO公司）。超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）的活性及丙二醛（MDA）的含量，均采用北京澳聯雅實驗設備中心的試劑盒進行，具體測定方法參照試劑盒說明書。

1.3數據統計與分析

試驗數據用平均值±標準差（x[TX-*5]±s）（n=6，3個平行，2個重復）表示。采用SPSS 17.0軟件進行數據統計和分析，用多重比較法進行組間差異顯著性分析，顯著水平為0.05。

2結果與分析

在顯微鏡下觀察，水溫為（18±1）℃、pH值為7.4、DO（溶氧量）≥5 mg/L 等的條件下，受精卵在受精192 min發育至16胞期，305 min發育至囊胚晚期、1 263 min發育至原腸晚期、2 418 min 發育至心跳形成期、3 512 min發育至出膜前期。試驗過程中，各取樣點涵蓋了胚胎發育從受精至剛孵化出仔魚整個過程。

2.1超氧化物歧化酶活性的變化

由圖1可知，錦鯉胚胎發育過程中SOD活性變化呈現出上升的趨勢。在受精初期，SOD的活性最低，為（48.252±2.43）U/mg；發育至囊胚期、原腸期時分別為（50.309±2.14）、（53.251±2.32）U/mg，差異不顯著（P>0.05）；由原腸期經胚體及器官形成期，至出膜前期SOD活性顯著上升（P<0.05），在出膜前期達到最高，為（85.981±3.25）U/mg，為受精初期的1.78倍。

2.2酸性磷酸酶、堿性磷酸酶的活性變化[JP2]

由圖2可知，錦鯉胚胎發育過程中ACP、AKP活性的變化均呈現出上升趨勢，并具有協同性。[JP]在受精初期，ACP、AKP的活性最低，分別為（1.158±0.024）、（0.026±0.013）U/g；[JP]當發育至原腸期時，酶活性明顯增強，分別為（2.679±0031）、（0.042±0.005） U/g，[CM（12*2]與之前各時期相比差異顯著[CM）]

（P<0.05）；當發育至胚體及器官形成期時，ACP、AKP的活性分別上升至（2.738±0.025）、（0.048±0.008）U/g，但與原腸期相比差異不顯著（P>0.05）；當發育至出膜前期時，酶活性繼續上升，且顯著高于以前各個時期（P<0.05），此時期ACP、AKP的活性分別為受精初期的3.62、23.41倍。

2.3丙二醛含量的變化

由圖3可知，錦鯉胚胎發育過程中MDA的含量呈現出逐漸增多的趨勢。受精初期MDA含量最低，為（8.023±0.42）nmol/mg，從受精初期發育至卵裂期、囊胚期MDA含量無顯著性變化（P>0.05）；當發育至原腸期時MDA含量為（10.295±0.56）nmol/mg，顯著增多（P<0.05）；當發育至出膜前期時，MDA含量繼續上升至（15.436±0.81）nmol/mg，且顯著高于以前各個時期（P<0.05），為受精初期的192倍。

3討論

胚胎發育過程中各種酶的作用極為復雜，其活性變化也受到多種因子的影響，尤其是胚胎發育后期要經歷神經管、脊索、肌節、尾芽、心臟等的形成。同時，胚胎運動、胚胎孵化等均需要大量的生理代謝和信息傳導。在本研究中，超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性在錦鯉胚胎發育過程中持續協同增加，主要是滿足胚胎發育的需要。

Swain等認為魚類主要通過卵子母源性抗體傳遞給子代[8-9]。并有研究顯示，生命早期發育過程中免疫力也可由自身的合子基因表達[10]。熊鏵龍等在研究普安銀鯽（Carassius auratus）胚胎發育中，抗氧化酶活性變化時，發現在普安銀鯽早期發育中，超氧化物歧化酶在成熟卵子中就具有活性，說明普安銀鯽胚胎發育中超氧化物歧化酶是由母體傳遞而來，并非胚胎合子基因的合成[11]。Kumano等對海鞘（Halocynthia roretzi）胚胎中堿性磷酸酶活性的研究顯示，胚胎中雖然含有少量母源性堿性磷酸酶，但是在胚胎內胚層發育時堿性磷酸酶主要來源于堿性磷酸酶基因的表達[12]。在本研究中，首次取樣點為受精初期，即在魚卵剛受精時立即取樣，可見樣品中應含有受精卵和成熟卵子，通過生化測定超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶均具有活性，因為剛受精立即取樣，胚胎合子基因還未進行充分的表達、合成，所以初步判斷錦鯉胚胎發育過程中超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶可由母體帶來，屬于母源性酶類。隨著錦鯉胚胎的持續發育，以上3種酶活性逐漸增加，這種變化趨勢與王書平等對金魚（Carassius auratus）胚胎[13]、孔祥會等對金魚胚胎[14]、熊鏵龍等對普安銀鯽的研究[11]基本相似。在本研究中，以胚胎發育至原腸期為節點，除超氧化物歧化酶外，其余2種酶活性均顯著上升（P<0.05），是否有合子基因開始表達，還有待進一步研究。當胚胎發育至出膜前期時，酶活性繼續上升，且顯著高于以前各個時期（P<0.05），此時期超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性分別為受精初期的1.78、3.62、23.41倍，這時可能是有合子基因表達參與代謝的結果。因為在胚胎發育至出膜前期時，卵黃囊中貯存的蛋白質、脂質等營養物質已經基本耗盡，這時酶活性的增強可能是由于合子基因表達的結果。

在本研究中，錦鯉魚卵受精初期丙二醛含量最低，說明抗氧化能力較強。但是，隨著胚胎發育，丙二醛含量逐漸增多，說明胚胎發育過程中持續發生一定的氧化應激反應。當胚胎發育至原腸期時，丙二醛含量顯著增多（P<0.05），為激烈的氧化應激反應所致，此時應為胚胎免疫力和抗氧化能力較弱的時期，此時期一定要增強胚胎管理，才可提高胚胎孵化率和成活率。當發育至出膜前期時，卵黃囊內的營養物質基本耗盡，機體需要更為旺盛的生理代謝來滿足發育的需要，此時期應為產生活性氧自由基最多的時期，同時出膜過程中仔魚與水體直接接觸，水體環境因子也可刺激其產生一定的氧化應激反應，從而導致丙二醛含量上升，這就可以解釋本研究所產生的結果。這與熊鏵龍等對普安銀鯽胚胎[11]、Elena-Díaz等對鱘魚（Acipenser sturio Linnaeus）胚胎的研究結果[15]一致。同時，說明出膜期為受精卵孵化又一關鍵時期，在此時期一定要強化管理，避免胚胎受到各種因素的干擾，同時要保持適宜的水質條件，以保持胚胎正常的發育進程，切不可延長孵化時間。

4結論

本研究顯示，在錦鯉胚胎發育過程中超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性逐漸升高，說明錦鯉胚胎生理代謝逐漸旺盛，信息傳導增多，酶活性持續協同增加，主要是滿足胚胎發育的需要。丙二醛含量逐漸增多，說明胚胎發育過程中持續發生一定的氧化應激反應。當胚胎發育至原腸期、出膜前期時，丙二醛含量均顯著上升，所以這2個時期是胚胎發育免疫能力較弱的時期，一定要強化管理，避免胚胎受到各種因素的干擾。

參考文獻：

[1]何滔. 條石鯛早期發育及相關酶活性的研究[D]. 北京：中國科學院研究生院中國科學院大學，2011：93-94.

[2]Dimitrova M T，Tishinova V，Velchava V. Combined effect of zinc and lead on the hepatic superoxide dismutase-catalase system in carp（Cyprinus carpio）[J]. Comp Biochen Physiol，1994，108（94）：43-46.

[3]閆海燕，曾令兵，羅宇良，等. 氰戊菊酯對鯉SOD活性和MDA含量以及肝腎細胞形態的影響[J]. 華中農業大學學報，2012，31（4）：499-505.

[4]劉麗平，薛暉，葛筱琴，等. 復方中草藥對青蝦肌肉和肝胰臟中幾種非特異性免疫因子的影響[J]. 淡水漁業，2007，37（6）：11-14.

[5]王卓，么宗利，林聽聽，等. 碳酸鹽堿度對青海湖裸鯉幼魚肝和腎SOD、ACP和AKP酶活性的影響[J]. 中國水產科學，2013，20（6）：1212-1218.

[6]孔祥會，王書平，江紅霞，等. 金魚胚胎發育過程中免疫相關酶活性及丙二醛含量的變化[J]. 中國水產科學，2011，18（6）：1293-1298.

[7]Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry，1976，72：248-254.

[8]Swain P，Nayak S K. Role of maternally derived immunity in fish[J]. Fish & Shellfish Immunology，2009，27（2）：89-99.

[9]李彩娟，許鄭超，張振早，等. 赤眼鱒仔魚饑餓試驗和不可逆點研究[J]. 揚州大學學報（農業與生命科學版），2016，37（3）：65-70.[ZK）]

[10]賴德 C C，泰勒 C B. 生物學研究概說（同工酶）[M]. 北京：科學技術出版社，1987：35-54.

[11]熊鏵龍，姚俊杰，安苗，等. 普安銀鯽胚胎發育中抗氧化酶活性及外源維生素C的作用[J]. 水產科學，2014（10）：631-634.

[12]Kumano G，Nishida H. Maternal and zygotic expression of the endoderm-specific alkaline phosphatase gene in embryos of the ascidian，Halocynthia roretzi[J]. Developmental Biology，1998，198（2）：245-252.

[13]王書平，孔祥會，江紅霞，等. 金魚胚胎發育過程中磷酸酶活性的變化[J]. 水產科學，2011，30（7）：405-408.

[14]孔祥會，王書平，江紅霞，等. 金魚胚胎發育過程中免疫相關酶活性及丙二醛含量的變化[J]. 中國水產科學，2011，18（6）：1293-1298.

[15]Elena-Diaz M，Furne M，Trenzado C E，et al. Antioxidant defences in the first life phases of the sturgeon Acipenser naccarii[J]. Aquaculture，2010，307（1/2）：123-129.[ZK）][HT][HJ][FL）]