利用PCR—DGGE技術研究稻草與黑麥草混合青貯過程中菌群的動態變化

劉蓓一　丁成龍　喬偉艷　李健　許能祥　潘孝青　秦楓　張霞　顧洪如

摘要：為了探討稻草與黑麥草混合青貯發酵過程中微生物的動態變化規律，以稻草、黑麥草為青貯原料，從青貯后1、5、12、21、31、61、99、154 d的稻草、黑麥草混合青貯樣中取樣，分別測定pH值，采用培養方法計數乳酸菌、酵母菌、霉菌數量的變化，使用PCR-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術分析青貯過程中菌群組成多樣性。結果表明：黑麥草與稻草混合青貯pH值在青貯初期下降迅速，乳酸菌數量在5d達到最高峰，然后逐漸下降，酵母菌數量呈先降后升再降等波動變化，稻草與黑麥草混合青貯過程中優勢菌主要有植物乳桿菌（Lactoacillus plantarum）、類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）、食竇魏斯氏菌（W. cibaria）、短乳桿菌（L.brevis），且隨著青貯時間延長，優勢菌數量下降。由結果可知，將DGGE和16S rRNA序列分析技術結合，能有效地研究青貯細菌的遺傳多樣性和組成的變化。

關鍵詞：青貯；微生物培養；動態變化；PCR-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）

中圖分類號： S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）11-0123-04[HS）][HT9.SS]

秸稈的飼料化利用，是其資源化利用的有效途徑之一，也是促進農區草食動物發展的重要措施。我國農作物秸稈總量達52 056萬t以上，其中稻草21 129萬t[1]。稻草與其他禾本科牧草青貯原料相比，干物質含量高，但莖葉上自然附著的乳酸菌數量少，可溶性碳水化合物含量低[2]，所以常規青貯很難調制出高品質的青貯料。多花黑麥草具有可溶性碳水化合物含量高、纖維素和木質素含量低的優點，但其含水量高，直接青貯容易產生大量的滲出液，導致青貯飼料酸度大，從而降低青貯飼料的營養成分[3]。水稻秸稈和黑麥草混合青貯，不僅能解決稻草可溶性碳水化合物含量低、青貯不易成功的問題，還能解決黑麥草水分含量高、不易青貯的問題。李君臨等指出，黑麥草單獨青貯不易成功，與水稻秸稈按7 ∶[KG-*3]3混合青貯時發酵品質最佳，顯著降低了氨態氮占總氮的比例以及乙酸、丙酸和丁酸的含量[4]。青貯飼料是個復雜的微生物共生體系，主要包括乳酸菌、酵母菌、霉菌及其他腐敗細菌[5]，而青貯飼料品質的優劣直接取決于乳酸菌的增殖與變化。在發酵初期，乳酸菌開始增殖，隨著pH值的逐漸下降和厭氧程度的加強，乳酸菌在數量上逐漸形成絕對優勢，其他微生物的生長受到抑制，乳酸菌產生大量乳酸，使pH值進一步下降，其他微生物的活性進一步減弱，當pH值下降到一定程度以后，乳桿菌的活性也受到了抑制[6]。可見，青貯過程中微生物數量及種群的動態變化研究十分重要。包慧芳等指出，玉米秸稈青貯飼料發酵過程中優勢菌主要有植物乳桿菌（Lactoacillus plantarum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），且采用菌劑處理后青貯玉米pH值下降更快，其優勢細菌種類更豐富[7]。詹發強等研究發現，乳桿菌屬、片球菌屬是青貯玉米發酵的啟動菌之一，在發酵前期一直存在，但在發酵后期，乳桿菌屬是玉米青貯過程中乳酸菌的主要菌群[8]。楊云貴等指出，在玉米青貯過程中，主要微生物隨著青貯時間的延長呈現逐步減少的趨勢，而乳酸菌在青貯第6、7天數量最高，之后呈現緩慢下降的趨勢[9]。目前，有關黑麥草與稻草混合青貯發酵過程中微生物動態變化規律沒有相關報道。

本研究通過跟蹤微生物數量在稻草與黑麥草混合青貯過程中的變化情況，以及利用PCR-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）方法對稻草與黑麥草混合青貯中細菌多樣性進行研究，從而了解青貯發酵過程中微生物動態變化規律，以期為青貯微生物研究及復合型添加劑的研制提供科學依據。

1材料與方法

1.1青貯的制作與采樣

將新鮮的多花黑麥草、水稻秸稈切短至2～3 cm，按多花黑麥草 ∶[KG-*3]水稻秸稈質量比=7 ∶[KG-*3]3進行混貯，用聚酯乙烯（52 cm×38 cm）青貯，每袋裝至半袋（約500 g），沒有加入添加劑，用真空封口機封口。分別于青貯后1、5、12、21、31、61、99、154 d開袋取樣。

1.2青貯pH值測定

稱取25 g樣品，加入200 mL三角瓶中，加入700 mL蒸餾水后置于4 ℃冰箱內浸提24 h。然后通過2層紗布和濾紙過濾，測定濾液pH值。

1.3菌株分離培養方法

稱取樣品10 g放入已滅菌的小三角瓶中，加入90 mL無菌生理鹽水，密封，在搖床上以120 r/min搖2 h。用1層無菌紗布過濾青貯草渣，然后逐級稀釋，接種10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀釋梯度的懸浮液于MRS培養基（CM036，Oxoid）上，37 ℃厭氧培養48 h，計算乳酸菌數量。將梯度稀釋的懸浮液接種于葡萄糖麥芽浸膏培養基上，30 ℃培養24 h，計算酵母菌數量。將梯度稀釋的懸浮液接種于馬鈴薯培養基（CM0139，Oxoid）上，30 ℃培養24 h，計算霉菌數量。

選取MRS培養基上光滑、圓形、灰白色菌落進行乳酸菌計數；選取葡萄糖麥芽浸膏培養基上大而厚、濕潤、表面光滑、多數不透明、黏稠、菌落顏色單調的菌落進行酵母菌計數；選取馬鈴薯培養基上菌絲細長，菌落疏松，呈絨毛狀、蛛蛛網狀、棉絮狀菌落進行霉菌計數。對菌落數在10～100個的培養皿進行有效性計數：

[JZ]樣品中活菌數A=N×D/m。

式中：N為菌落數，個；D為稀釋倍數；m為取樣量，g。

1.4青貯飼料菌群總DNA提取

取青貯飼料樣10 g，加入90 mL無菌生理鹽水，密封，在搖床上以120 r/min搖2 h。用1層無菌紗布過濾青貯草渣，8 000 g 離心15 min收集細菌菌體，然后按照DNeasy Tissue Kit（Qiagen，USA）說明書提取青貯飼料菌群的總DNA。

1.516S rDNA V3區域的PCR擴增

以純化后的基因組DNA為PCR反應的模版，擴增16S rDNA V3區的基因，引物參照Muyzer，引物序列：F338，5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′；R518，5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，擴增片段為200 bp。

PCR反應體系（25 μL）：2.5 μL 10×PCR buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTP，2.5 μL 25 mmol/L MgCl2，1 μL 10 μmol/L引物，0.2 μL 5 U/μL Taq DNA酶，加ddH2O至25 μL。

PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個循環；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。用1.0%瓊脂糖電泳檢測PCR產物。

1.6DGGE分析

參照Muyzer等的方法[10]，將16S rDNA V3區的PCR擴增產物于8%聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離。變性劑濃度范圍為45%～60%，變性梯度方向與電泳方向一致。電泳采用D-code DGGE系統（Bio-Rad），電泳緩沖液為1×TAE，240 V電壓預電泳30 min，在恒溫60 ℃下的1×TAE緩沖液中進行，80 V電泳15 h，電泳結束后用AgNO3染色，顯色定影后用Vilber凝膠成像掃描系統照像。凝膠拍照成像后，用滅菌刀片切下含目的條帶的凝膠塊，將凝膠塊轉移至微量離心管中，用槍頭將膠塊搗碎，加入 50 μL ddH2O，98 ℃煮沸 10 min 后于4 ℃過夜。在進行第2次PCR前，于 12 000 r/min 離心5 min以上，吸取上清作為模板。

采用16S rRNA片段V3區引物（不帶“GC”夾板）的F338、R518對DGGE膠上切下的目的條帶進行第2次PCR擴增，反應體系、反應條件同“1.5”節。用1.0%瓊脂糖電泳檢測產物，用Axygen膠回收試劑盒回收目的條帶。膠回收產物經pMD19-T載體連接，轉化E.coli DH5α感受態細胞，在含有氨芐青霉素的LB培養基上選擇具有氨芐青霉素抗性的白色轉化子，采用T載體通用引物進行菌落PCR檢測，將菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.7序列分析

采用美國國立生物技術信息中心（NCBI）網站的BLAST程序（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行序列同源性分析。

2結果與分析

2.1青貯過程中pH值及微生物數量的變化過程

從表1可以看出，隨著青貯時間的延長，黑麥草與稻草混合青貯pH值在青貯初期下降迅速，在青貯5 d時pH值降為4.76，12 d時pH值降為4.45，青貯12 d以后pH值下降緩慢；青貯乳酸菌數量在5 d達到最高峰，為9.50×107個/g，然后逐漸下降，到21 d時乳酸菌數量為8.50×106個/g，到 154 d 時乳酸菌數量只有5 200個/g；隨著青貯時間的延長，酵母菌數量先降低，青貯后1 d酵母菌數量最高，達7.45×105個/g，到61 d時酵母菌數量最少，<100個/g；隨著青貯時間的延長，霉菌數量迅速減少，直到青貯 5 d，霉菌數量小于100個/g。

2.2青貯細菌樣品DGGE分析

從圖1可以看出，青貯1 d時多樣性最豐富；條帶2在青貯后1 d存在，青貯5 d后該條帶消失；條帶3、4、8、9在青貯1至99 d持續存在，但隨著青貯時間的延長，亮度減弱；條帶5、6、7從青貯1至61 d持續存在；條帶10存在于青貯12～ 61 d；條帶11、12、13僅存在于青貯61 d；條帶14、15、16、17僅存在于青貯154 d；條帶18僅出現在青貯99 d。

回收上述優勢條帶和變化較明顯的條帶進行測序分析。由表2可知，條帶2為植物乳桿菌（L.plantarum）；條帶3、4、8、9分別為植物乳桿菌、類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）、Uncultured bacterium、Uncultured Weissella；條帶5、6、7分別為類腸膜魏斯氏菌、食竇魏斯氏菌（W. cibaria）、植物乳桿菌；條帶10為短乳桿菌（L.brevis）；條帶11、12、13分別為Uncultured Lactobacillus、植物乳桿菌、米酒乳桿菌（L.sake）；條帶14、15、16分別為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）；條帶17、18分別為阿耶波多桿菌（B. aryabhattai）、寡氧單胞菌（Stenotrophomones acidaminiphila）。

DGGE條帶的亮度高低代表菌所占數量的多少。由表1可知，青貯1 d時乳酸菌數量占比較高。由圖1可見，條帶3（L.plantarum）、條帶4（W. paramesenteroides）在青貯5 d時數量達到最大值；隨著青貯時間延長，條帶3、4的亮度降低，即L.plantarum與W. paramesenteroides隨著青貯時間延長，數量占比下降；到154 d時，條帶3、4很暗，主要菌群是B. licheniformis、B. aryabhattai，這與培養方法計數乳酸菌的結果一致，到青貯154 d時，乳酸菌的數量僅為5 200個/g（表1）。可以看出，稻草與黑麥草混合青貯過程中優勢菌主要有L.plantarum、Weissella paramesenteroides、W. cibaria、L.brevis，故進行菌劑配伍改良時，可適當提高這4種菌的比例。

3討論

3.1稻草與黑麥草混合青貯過程中pH值、乳酸菌的變化

pH值的高低是青貯飼料質量好壞的重要指標，質量良好的青貯要求pH值<4.5。在本試驗中，隨著青貯時間的延長，黑麥草、稻草混合青貯pH值在青貯初期下降迅速，在青貯5 d時pH值降為4.76，12 d時pH值降為4.45，青貯12 d以后pH值下降緩慢，61 d時pH值為4.21，說明青貯質量良好。與玉米青貯相比，黑麥草、稻草混合青貯pH值下降沒有玉米青貯快。楊云貴等指出，玉米青貯的pH值在青貯2 d就能下降到4以下，然后穩定在3.5左右，且全株玉米青貯pH值低于秸稈玉米青貯[9]。即與玉米青貯相比，黑麥草、稻草混合青貯pH值下降沒有玉米青貯快，可能是因為此試驗中黑麥草與水稻秸稈是以質量比7 ∶[KG-*3]3混貯的，水稻秸稈含量比較高，而水稻秸稈可溶性碳水化合物含量低，導致本試驗中pH值下降沒有玉米青貯快。

青貯中乳酸菌是起主要作用的益生菌，它們在厭氧狀態下將原料中的碳水化合物轉化為乳酸。本試驗中青貯乳酸菌數量在5 d達到最高峰，為9.50×107個/g，然后逐漸下降，61 d 時維持在106數量級。此結果與楊云貴等試驗中玉米青貯過程中乳酸菌數量變化結果的趨勢[9]相似。但Li等指出，凋萎多花黑麥草青貯過程中乳酸菌數量是先增加，到第7天時最大，隨后降低，然后又增加、降低，而凋萎的羊草青貯過程中乳酸菌數量在第3天時已經達到最高峰，隨著青貯時間的增加，乳酸菌數量變化得比較小[11]。

3.2稻草與黑麥草混合青貯過程中菌群的演替規律

從DGGE電泳結果可以看出，青貯1 d時多樣性最豐富，青貯過程中，細菌種類經歷了由多到少的變化且種類也發生了變化。韓吉雨等認為，玉米發酵過程中細菌種類只經歷了由多到少的過程，而苜蓿青貯過程中細菌種類沒有發生太大的變化[12]。這可能是由于物料的內部及外部結構不同導致的。

稻草與黑麥草混合青貯過程中優勢菌主要有L.plantarum、W. paramesenteroides、W. cibaria、L.brevis。L.plantarum是同型乳酸菌[13]，是農作物青貯發酵過程中的主要優勢菌[14]。Ennahar等指出，L.plantarum是水稻青貯的主要優勢菌[15]。W. Paramesenteroides是傳統發酵豆制品中的優勢乳酸菌之一[16]。W. Paramesenteroides、L.brevis也是水稻秸稈發酵全混合日糧（TMR）和玉米秸稈發酵TMR中的優勢乳酸菌[17]。W. Cibaria是水稻青貯中的優勢菌，Pang等研究表明，水稻青貯的主要菌群是W.cibaria、W.confusa、L.lactis subsp.lactis和L.plantarum[18]。L.brevis是玉米秸稈的主要優勢菌，占 23.7%[19]。而玉米秸稈青貯過程中主要的優勢菌是Lactoacillus plantarum、Pediococcus pentosaceus、Lactococcus lactis[7]。劉建新認為，青貯起始階段，大腸桿菌大量增殖，直到第3天數量減少，被乳球菌（腸球菌、明串球菌、片球菌、四聯球菌）代替，然后又被生長較慢、產酸較多的乳桿菌代替[20-21]。這與本試驗過程中L.brevis出現在青貯12～61 d及L.sake僅出現在青貯61 d的結果是一致的。但是本試驗在整個青貯過程中沒有發現有乳球菌的存在。McEniry等研究發現，腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、明串珠菌（Leuconostoc carnosum）是青貯第2、6天的主要優勢菌群[22]。Langston等也指出，在青貯早期存在明串珠菌屬（Leuconostoc）菌[23]。但Li等指出，水生拉恩菌（Rahnella aquatilis）、腸桿菌屬（Enterobacter sp.）是多花黑麥草凋萎整個青貯過程中都存在的優勢菌，Enterococcus faecium僅存在于青貯第7、28天，而青貯第120天時出現Pediococcus pentosaceus、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）這2種新的菌[11]。這可能是由于青貯本身材料的不同或添加乳酸菌等添加劑造成的青貯過程中菌群多樣性的不同。李雁冰等的研究[24]也證實了這一點。

4結論

將DGGE、16S rRNA序列分析技術結合，能夠非常有效地研究稻草與黑麥草混合青貯細菌的遺傳多樣性和組成的變化，進一步將其與發酵特性、傳統培養等研究手段一起應該能更好地揭示青貯微生物的功能。

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