L—谷氨酰胺對麻瘋樹再生不定芽生根效果的影響

劉穎 唐家年 黃川騰 劉國選 林詩婉 高美芳 吳東霖 陳建平

摘要 [目的]建立促進麻瘋樹再生不定芽生根的組培體系。[方法] 通過在誘導麻瘋樹再生不定芽分化生根的培養基（MS+0.3 mg/L IBA）中添加一定濃度的L-谷氨酰胺（Gln）來達到促進芽條生根的效果。[結果] 在誘導麻瘋樹再生不定芽分化生根的培養基中添加20 mg/L Gln，可以顯著提高芽條的生根率，生根率可達40%～50%。同時，可以在短時間內就獲得較高的生根率，顯著縮短了獲得完整植株的周期。此外，還減少了生根過程中常見的再生植株葉片發黃、容易脫落現象的發生，顯著提高了所獲得的再生完整植株的質量。[結論] 麻瘋樹生根培養基的最優組合為添加0.3 mg/L IBA和20 mg/L Gln的MS培養基，應用該研究建立的組培體系可顯著改善麻瘋樹再生不定芽的生根效果。

關鍵詞 麻瘋樹；L-谷氨酰胺；再生不定芽；生根

中圖分類號 S184；Q949.9 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）07-0125-05

Effect of L-Glutamine on the Rooting of Regenerated Shoot Buds of Jatropha curcas

LIU Ying1，TANG Jia-nian1，HUANG Chuan-teng2，CHEN Jian-ping3* et al （1.Faculty of Agricultural Science，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088；2.Hainan Provincial Forestry Institute，Haikou，Hainan 571100；3.Faculty of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088）

Abstract [Objective] To establish a tissue culture system for promoting rooting of regenerated buds of Jatropha curcas.[Method] L-glutamine （Gln） was added into rooting medium （MS+0.3 mg/L IBA） for improving the rooting efficiency of regenerated buds of J.curcas.[Result]When 20 mg/L Gln was supplemented into rooting medium，the rooting efficiency of regenerated shoot buds could be significantly increased （raised up 40%-50%）.In addition，satisfactory rooting rate was obtained in a short time （10～20 days），and the cycle of gaining a complete plant was shortened significantly.Moreover，reducing the chances of this happening that the leaves were easy to be yellowing and fall down from regenerated plants in the process of rooting，and then the quality of regenerated whole plants was obviously improved.[Conclusion] The optimal combination of rooting medium was MS medium supplemented with 0.3 mg/L IBA and 20 mg/L Gln.The rooting effect of regenerated buds of J.curcas could be significantly enhanced via application of the tissue culture system established in this study.

Key words Jatropha curcas；L-glutamine；Regenerated shoot buds；Rooting

麻瘋樹（Jatropha curcas L.）又名小桐子、黃腫樹，為大戟科（Euphorhiaceae）麻瘋樹屬（Jatropha）多年生的落葉灌木或小喬木[1]。麻瘋樹原產于中美洲，主要分布于熱帶和亞熱帶地區[2]，在我國主要生長在四川、云南、貴州、廣東、廣西、海南和臺灣等省（區）。麻瘋樹組織提取物中的毒蛋白、麻瘋酮等活性成分可以被開發為藥物，常用于消腫散淤、清熱解毒等，近年來還發現這些物質具有顯著的抗癌活性[3-4]，還可用于生物病蟲害防治[5]。麻瘋樹種子含油量高達40%～60%，提取的種子油可用于生產優質的“生物柴油”[6-8]，有利于緩解當前全球石油能源短缺的問題。麻瘋樹被認為是一種重要的可再生能源，受到世界各國科學家的廣泛關注[7-8]。然而，麻瘋樹生長區域有限以及種子產量低限制了麻瘋樹生物柴油產業化的發展。通過遺傳改良可以提高麻瘋樹種子含油量以及改變油脂的組分，增強麻瘋樹的抗病害能力和對環境的適應能力，擴大其種植面積[9]。

目前，植物遺傳改良主要是采用農桿菌介導的遺傳轉化，但是進行此類遺傳轉化，需要一個良好的植株組織培養再生體系。植物組織培養技術在麻瘋樹的遺傳改良和良種繁育方面得到了廣泛應用。現已建立起來的誘導麻瘋樹再生不定芽生根的方法仍然存在芽條生根效率低、再生不定根的質量較差、所獲得再生植株生長狀態不佳、整個培養周期較長等缺點，難以滿足實際應用的需要。

L-谷氨酰胺（Gln）是一種在植物生命活動中起著重要作用的氨基酸。它是構成蛋白質的基礎氨基酸，又是合成含氮生物物質的氮源，與組織生長和發育有著密切的關系。在不同植物組織中Gln具有不同的代謝作用，起著非常重要的生理作用。Gln常常被當作有機氮源應用于植物組織培養[10]。許多研究結果表明，培養基中添加適宜濃度的Gln可以改善外植體的再生效果[11-13]。還有研究報道，培養基中添加一定濃度的Gln可能會對一些植物再生不定芽的生根產生積極作用[14-16]。截至目前，關于Gln對麻瘋樹再生不定芽分化生根影響的研究鮮見報道。該研究通過添加一定濃度的Gln來考察其誘導麻瘋樹再生不定芽生根效率的影響，為解決麻瘋樹再生不定芽生根困難提供一種方法。

1 材料與方法

1.1 植物材料

研究采用的麻瘋樹種子（M-19）均采自海南省海口市東山林場[17]。將這些種子剝殼后進行表面滅菌，在培養基上進行12 d萌發培養后，從實生苗上獲得子葉葉柄外植體[18-21]。

1.2 試驗方法

1.2.1 Gln母液的配制。準確稱取一定量的Gln粉末，用去離子水充分溶解后，再用去離子水定容，配制成2 mg/mL的Gln母液。使用前用0.22 μm的水系濾膜對已配制好的Gln母液進行過濾滅菌。

1.2.2 培養基及培養條件。

該研究所有試驗都是在相同培養環境下進行。培養基均使用1 mol/L NaOH溶液調整pH至5.8～6.0，然后在121 ℃，0.1 MPa的條件下高壓滅菌20 min。組織培養室培養條件為光照強度2 000 lx、光照時間12 h/d和培養溫度（25±1）℃。在無特殊說明情況下，所用培養基均添加了100 mg/L肌醇、3%蔗糖和0.6%瓊脂。

1.2.3 麻瘋樹再生不定芽的獲取。采用實驗室已報道的方法[18-21]，利用高濃度TDZ溶液誘導麻瘋樹子葉葉柄外植體再生不定芽，從而獲得大量優質的麻瘋樹再生不定芽，然后將帶有再生不定芽的外植體接種至添加了0.5 mg/L BA（芐氨基腺嘌呤）、0.2 mg/L KT（激動素）、0.4 mg/L GA3（赤霉素）和0.2 mg/L IAA（吲哚乙酸）的MS培養基上進行15 d不定芽伸長培養，之后從培養瓶中取出高度大于1 cm且至少有2個伸展葉片的不定芽外植體，用滅過菌的手術刀對伸長的再生不定芽進行橫向切割，切去其他部分，只保留長度約為1 cm的不定芽芽條。注意切割的方向與伸長的再生不定芽的中軸相垂直，切口平齊。

1.2.4 麻瘋樹再生不定芽生根培養。

1.2.4.1 采用傳統方法誘導麻瘋樹再生不定芽生根。將獲取芽條以豎插方式（使芽條的中軸與培養基表面相垂直，芽條的形態學下端插入培養基中的深度為0.2～0.4 cm）接種至6種傳統生根培養基上進行生根培養，培養10、20、30、40 d后分別統計再生不定芽的生根情況[22]。

6種生根培養基分別為無激素MS培養基[23]，無激素1/2MS培養基[24]，添加了3.0 mg/L IBA（吲哚丁酸）、1.0 mg/L IAA和1.0 mg/L NAA（萘乙酸）的1/2MS培養基[25]，添加了0.1 mg/L IAA的MS培養基[24]，添加了1.0 mg/L NAA的1/2MS培養基[23]，添加了0.5 mg/L IBA的1/2MS培養基[26]。

1.2.4.2 采用在培養基中添加Gln的方法誘導麻瘋樹再生不定芽生根。將獲取芽條以豎插方式（使芽條的中軸與培養基表面垂直，芽條的形態學下端插入培養基中的深度為0.2～0.4 cm）分別接種至添加了0、5、10、20、40、80、160 mg/L Gln和0.3 mg/L IBA的MS培養基上進行生根培養，培養10、20、30、40 d后分別統計再生不定芽的生根情況。

1.2.5 麻瘋樹再生植株的馴化移栽。

從培養瓶中小心取出麻瘋樹再生小植株，在自來水下洗去植株根部所帶有的培養基后，將其種植在已經滅菌的培養基質（土∶沙礫=1∶1）中，保鮮膜覆蓋保濕培養14～21 d后，將植株移栽至盛有土壤的培養盆中繼續生長。

1.2.6 試驗結果記錄與數據處理。該研究所有試驗處理均重復3次，每個重復包括30個外植體，試驗數據均用3次重復的平均值±標準差（SD）表示。數據采用SPSS Statistics 17.0統計分析軟件進行方差分析和鄧肯多重比較。

2 結果與分析

2.1 采用傳統方法誘導麻瘋樹再生不定芽生根的效果

將獲取芽條以豎插方式接種至6種傳統生根培養基上培養，分別在培養10、20、30和40 d后進行生根效果統計。由表1可知，在6種誘導芽條生根培養基中，誘導芽條生根效果最好的是添加了0.5 mg/L IBA的1/2MS培養基，芽條在這種培養基上培養40 d后，生根率為18.07%，平均每個芽條上的根數為2.61條，平均根長為2.27 cm，都為最大值；而培養30 d后，其生根率為16.15%，平均每個芽條上的根數為2.56條，平均根長為2.14 cm（圖1Ⅵ），所獲得的結果與40 d時都沒有差異顯著性。因此為了縮短培養時間，更快地獲得再生植株，采用30 d的培養時間為宜。芽條在無激素培養基（MS和1/2MS）中都不能產生不定根（圖1Ⅰ和Ⅱ），而在添加較高濃度生長素的培養基（1/2MS+3.0 mg/L IBA+1.0 mg/L IAA+1.0 mg/L NAA、1/2MS+1.0 mg/L NAA和1/2MS+0.1 mg/L IAA）上生根率較低（圖1Ⅲ～Ⅴ），這說明添加過高濃度的生長素會對芽條生根產生一定的抑制作用。此外，在試驗過程中還發現，采用常見生根培養基來誘導麻瘋樹再生不定芽生根，培養后所獲得完整植株上的葉片容易發黃甚至脫落。

綜上所述，采用傳統方法誘導麻瘋樹再生不定芽生根的效果不佳，存在生根率較低、培養周期較長、生根質量較差、難以獲得生長狀態良好的再生植株等問題。

2.2 Gln對麻瘋樹再生不定芽生根效果的影響

將獲取芽條以豎插方式接種至添加了0.3 mg/L IBA和0、5、10、20、40、80、160 mg/L Gln的MS培養基以及2組對照培養基CK1（無激素MS培養基）和CK2（僅添加20 mg/L Gln的MS培養基）上培養，培養10、20、30、40 d后分別統計再生不定芽的生根情況。由表2可知，在未添加Gln的生根培養基中，誘導芽條生根的效果較差，生根率最高為21.52%；而在添加Gln的生根培養基中，隨著添加Gln的濃度提高，芽條生根率先增加，到20 mg/L時，芽條的生根效果最佳，生根率最高為49.32%，平均每個芽條上的根數最多為6.52條，平均根長最長為5.15 cm，繼續提高Gln的濃度，芽條的生根效果變差，生根率降低，到160 mg/L時，生根率最高僅為13.62%，平均每個芽條上的根數最多為2.02條，平均根長最長為2.18 cm。由此可見，在培養基中添加Gln的濃度太低或者太高都不利于芽條不定根再生，Gln的最適添加濃度為20 mg/L。

培養時間為10 d時，芽條在添加10～40 mg/L Gln的生根培養基中，生根率為23.36%～29.31%，特別是在添加了20 mg/L Gln的生根培養基中芽條的生根效果最佳，生根率最大為29.31%，平均每個芽條上的根數為2.26條，平均根長為1.32 cm（圖1Ⅶ）；而此時芽條在未添加Gln的生根培養基中的生根效果不佳，生根率僅為8.53%，平均每個芽條上的根數為1.32條，平均根長為0.65 cm。隨著培養時間的延長，芽條的生根率也逐漸增加，然而當培養時間達30 d后，繼續增加培養時間，芽條的生根率并沒有顯著增加（圖1Ⅷ）。

此外，芽條在無激素MS培養基上不能再生出不定根，并且芽條的生長狀態不佳，葉片易發黃；而在只添加了20 mg/L Gln的MS培養基上生根效果也非常差，生根率最高僅為12.32%，平均每個芽條上的根數為1.67條，平均根長為1.79 cm，此時芽條的生長狀態也不好，葉片難以繼續伸展（表1、2）。

綜上所述，麻瘋樹再生不定芽在添加20 mg/L Gln的培養基中的生根效果顯著優于傳統方法，且在較短時間內（10 d）就可以達到較好的生根效果，生根率最高為29.31%，最后還可以獲得生長狀態良好的再生植株（圖1Ⅸ）。

3 結論與討論

麻瘋樹再生不定芽條存在生根難的問題，嚴重阻礙了其組培再生和遺傳轉化的研究進展。生長素是誘導芽條生根的強效激素[27-28]。IBA是一種常見的生長素，常被用于誘導再生不定芽生根。在對麻瘋樹葉柄外植體再生不定芽進行生根誘導時，IBA也是一種常見的生長素，常被用于誘導芽條不定根再生[29-30]。該研究結果表明，雖然麻瘋樹再生不定芽在添加0.3 mg/L IBA的培養基中可以形成不定根，但是生根效果較差，生根率最高僅為22.76%。進一步觀察發現，伸長芽條上的葉片容易發黃甚至脫落，并且這種現象經常發生在將麻瘋樹再生芽轉移至生根培養基中進行生根誘導培養時[31-32]。

Gln作為一種參與植物新陳代謝的重要內源性氨基酸組分，是合成生物體內極其重要的抗氧化劑還原型谷胱甘肽的前體物質，是構成蛋白質中氨基酸和合成含氨生物物質的氮源，與組織生長和修復有密切的關系，在生命活動中起重要作用[33]，并且常常被當作一種有機氮源添加到植物組織培養的培養基中[10]。有很多研究表明，在培養基中添加Gln可以提高外植體的再生效率和外植體的生物量[34-36]。氮的濃度和銨態氮與硝態氮的相對含量可能對植物細胞的生長和形態建成起著至關重要的作用[37-38]。雖然使用添加了氨基酸或者水解蛋白的培養基來促進外植體增殖的報道比較常見，但是氨基酸是如何影響離體器官發生的機理還不清楚。還有些研究結果表明，在培養基中添加Gln可以影響多種植物再生不定芽的生長效果，如Kaur等[39]在誘導兒茶[Acacia catechu（Linn.f.） Willd]再生不定芽生根時發現，在培養基中添加150 mg/L Gln，可以明顯緩解芽條上葉片易發黃和脫落的現象，但是并沒有探究Gln對芽條生根效率的影響。

該研究結果表明，麻瘋樹再生不定芽在未添加IBA的MS培養基上沒有不定根再生發生，而在添加了IBA的培養基上有不定根發生，說明IBA對于芽條再生不定根發生可能是必須的，然而芽條在只添加了0.3 mg/L IBA的培養基上雖然可以生根，但是生根效果較差，葉片容易發黃甚至脫落；如果在添加了0.3 mg/L IBA的1/2MS培養基中再添加一定濃度的Gln，芽條的生根效率會有顯著提高并且葉片可以保持鮮綠，但是芽條在僅添加20 mg/L Gln而沒有添加IBA的MS培養基上的生根效果非常差，由此可以說明Gln對芽條生根具有促進作用并且芽條上葉片生長的改善作用可能是由于Gln與IBA的協同作用所產生的效果。

此外，該研究還發現采用傳統方法對麻瘋樹再生不定芽進行不定根誘導時，對芽條的質量要求較高，一般是要求芽條的長度至少達2 cm，帶有3～4個葉片[40-41]，這在一定程度上減少了可以用于進行生根培養的芽條數量，因而會減少獲得完整再生植株的數量；而采用在生根培養基中添加適宜濃度Gln的方法可以促使質量較差、長度約為1 cm且只帶有2～3個葉片的芽條生根，這在一定程度上提高了可以用于生根培養的再生不定芽的利用效率，最終可以增加獲得完整再生植株的數量。如果將此方法應用于麻瘋樹的遺傳轉化，可能會提高獲得完整轉化苗的效率。在試驗過程中還發現，添加了適宜濃度Gln的試驗組中的芽條培養30 d后，不僅生根效果良好，所獲得再生植株的生長狀態也良好，葉片鮮綠。另外，對于那些沒有生根的芽條還可以將其接種至添加了20 mg/L Gln的生根培養基上進行再次生根培養，這樣可以提高芽條的利用效率，增加完整再生植株的數量。

參考文獻

[1] ATTAYA A S，GEELEN D，BELAL A E H.Progress in Jatropha curcas tissue culture[J].American-Eurasian journal sustainable agriculture，2012，6（1）：6-13.

[2] FOIDL N，FOIDL G，SNCHEZ M，et al.Jatropha curcas L.as a source for the production of biofuel in Nicaragua[J].Bioresource technology，1996，58（1）：77-82.

[3] GUPTA R C.Pharmacognostic studies on ‘Dravanti part.I.Jatropha curcas Linn.[J].Plant science，1985，94（1）：65-82.

[4] OPENSHAW K.A review of Jatropha curcas：An oil plant unfulfilled promise[J].Biomass and bioenergy，2000，19：1-15.

[5] ADEBOWALE K O，ADEDIRE C O.Chemical composition and insecticidal properties of the underutilized Jatropha curcas seed oil[J].African journal biotechnology，2006，5（10）：901-906.

[6] LIBERALINO A A A，BAMBIRRA E A，MORAES-SANTOS T，et al.Jatropha curcas L.seeds：Chemical analysis and toxicity[J].Arquivos de biologia e tecnologia，1988，31（4）：539-550.

[7] MANDPE S，KADLASKAR S，DEGEN W，et al.On road testing of advanced common rail diesel vehicles with biodiesel from the Jatropha curcas plant[J].SAE Technical Paper，2005，26：356-364.

[8] GHOSH A，CHAUDHARY D R，REDDY M P，et al.Prospects for Jatropha methyl ester （biodiesel） in India[J].International journal of environmental studies，2007，64（6）：659-674.

[9] LIU Y，YU L，FU Y L，et al.Development of an in vitro grafting method for the enhancement of growth of isolated shoots and buds in soybean （Glycine max L.）[C]//2012 International Conference on Biomedical Engineering and Biotechnology （iCBEB）.Washington，DC，USA：IEEE Computer Society，2012：1003-1006.

[10] FRANKLIN C I，DIXON R A.Initiation and maintenance of callus and cell suspension cultures[M]//DIXON R A.Plant cell culture：A pratical approach.Oxford：IRL Press，1994：1-25.

[11] OGITA S，SASAMOTO H，YEUNG E C，et al.The effects of glutamine of the maintenance of embryogenic cultures of Cryptomeria japonica[J].In vitro cellular & developmental biology-plant，2001，37（2）：268-273.

[12] SUDARSANA G V，CHANDRA R，POLISETTY R.Role of amino acids in evolution of ethylene and methane，and development of microshoots in Cajanus cajan[J].Biologia plantarum，2001，44（1）：13-18.

[13] VASUDEVAN A，SELVARAJ N，GANAPATHI A，et al.Glutamine：A suitable nitrogen source for enhanced shoot multiplication in Cucumis sativus L.[J].Biologia plantarum，2004，48（1）：125-128.

[14] PEDROTTI E L，JAY-ALLEMAND C，DOUMAS P，et al.Effect of autoclaving amino acids on in vitro rooting response of wild cherry shoot[J].Scientia horticulturae，1994，57（1/2）：89-98.

[15] XIE D，HONG Y.In vitro regeneration of Acacia mangium via organogenesis[J].Plant cell，tissue and organ culture，2001，66（3）：167-173.

[16] LIU J J.Effect of glutamine，lanthanum chloride on the rooting and POD expression of Dendrobium[J].Anhui agricultural science bulletin，2010，16：47-49.

[17] LIU Y，LU J N，ZHU H B，et al.Efficient culture protocol for plant regeneration from cotyledonary petiole explants of Jatropha curcas L.[J].Biotechnology & biotechnological equipment，2016，30（5）：907-914.

[18] LIU Y，TONG X，HUI W K，et al.Efficient culture protocol for plant regeneration from petiole explants of physiologically mature trees of Jatropha curcas L.[J].Biotechnology & biotechnological equipment，2015，29 （3）：479-488.

[19] LIU Y，YIN X G，ZHU H B，et al.An efficient protocol for inducing regeneration in physic nut （Jatropha curcas L.）[J].Bangladesh journal of botany，2016，45（4）：827-833.

[20] 劉穎，楊躍生，劉振蘭，等.一種麻瘋樹葉柄外植體直接再生不定芽的方法：201310133492.7[P].2013-04-17.

[21] 劉穎，楊躍生，劉振蘭，等.一種促進麻瘋樹外植體再生不定芽的方法：201310333563.8[P].2013-08-02.

[22] 劉穎，楊躍生，劉振蘭，等.一種促進麻瘋樹再生不定芽芽條生根的方法：201310422701.X[P].2013-09-16.

[23] MAZUMDAR P，BASU A，PAUL A，et al.Age and orientation of the cotyledonary leaf explants determine the efficiency of de novo plant regeneration and Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation in Jatropha curcas L.[J].South african journal of botany，2010，76（2）：337-344.

[24] PURKAYASTHA J，SUGLA T，PAUL A，et al.Efficient in vitro plant regeneration from shoot apices and gene transfer by particle bombardment in Jatropha curcas[J].Biologia plantarum，2010，54（1）：13-20.

[25] SHARMA S，KUMAR N，REDDY M P.Regeneration in Jatropha curcas：Factors affecting the efficiency of in vitro regeneration[J].Industrial crops and products，2011，34（1）：943-951.

[26] KHURANA-KAUL V，KACHHWAHA S，KOTHARI S L.Direct shoot regeneration from leaf explants of Jatropha curcas in response to thidiazuron and high copper contents in the medium[J].Biologia plantarum，2010，54（2）：369-372.

[27] VUYLSTEKER C，DEWAELE E，RAMBOUR S.Auxin induced lateral root formation in chicory[J].Annals of botany，1998，81（3）：449-454.

[28] NANDAGOPAL S，RANJITHA KUMARI B D.Effectiveness of auxin induced in vitro root culture in chicory[J].Journal of central european agriculture，2007，8（1）：73-80.

[29] LI Z G，GONG M，YANG S Z，et al.Efficient callus induction and indirect plant regeneration from various tissues of Jatropha curcas[J].African journal of biotechnology，2012，11（31）：7843-7849.

[30] SUJATHA M，MUKTA N.Morphogenesis and plant regeneration from tissue cultures of Jatropha curcas[J].Plant cell，tissue and organ culture，1996，44（2）：135-141.

[31] KUMAR N，ANAND K G V，REDDY M P. In vitro regeneration from petiole explants of non-toxic Jatropha curcas[J].Industrial crops and products，2011，33（1）：146-151.

[32] KUMAR N，REDDY M P.Thidiazuron （TDZ） induced plant regeneration from cotyledonary petiole explants of elite genotypes of Jatropha curcas：A candidate biodiesel plant[J].Industrial crops and products，2012，39（1）：62-68.

[33] CORUZZI G，LAST R.Amino acids[M]// BUCHANAN B，GROISSEM W，JONES R.Biochemistry and molecular biology of plants.Rockville：Wiley，2000：358-410.

[34] FRANKLIN C I，TRIEU T N，GONZALES R A，et al.Plant regeneration from seedling explants of green bean （Phaseolus vulgaris L.） via organogenesis[J].Plant cell，tissue and organ culture，1991，24（3）：199-206.

[35] SHETTY K，ASANO Y，OOSAKA K.Stimulation of in vitro shoot organogenesis in Glycine max （Merrill.） by allantoin and amides[J].Plant science，1992，81（2）：245-251.

[36] HIGASHI K，KAMADA H，HARADA H.The effects of reduced nitrogenous compounds suggests that glutamine synthetase activity is involved in the development of somatic embryos in carrot[J].Plant cell，tissue and organ culture，1996，45（2）：109-114.

[37] HALPERIN W，WETHERELL D F.Ontogeny of adventive embryos of wild carrot[J].Science，1965，147（3659）：756-758.

[38] REINERT J，TAZAWA M，SEMENOFF S.Nitrogen compounds as factors of embryogenesis in vitro[J].Nature，1967，216（1521）：1215-1216.

[39] KAUR K，VERMA B，KANT U.Plants obtained from the Khair tree （Acacia catechu Willd.） using mature nodal segments [J].Plant cell reports，1998，17（5）：427-429.

[40] KUMAR N，ANAND K G V，SUDHEER PAMIDIMARRI D V N，et al.Stable genetic transformation of Jatropha curcas via Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer using leaf explants[J].Industrial crops and products，2010，32（1）：41-47.

[41] SARINA P，BENIWAL V S，LAURA J S.An efficient plant regeneration protocol from petiole explants of physic nut （Jatropha curcas L.）[J].African journal of biotechnology，2012，11（63）：12652-12656.