3 種高溫大曲發酵過程中細菌群落結構演替規律

黃魏，李浪金，謝丹，吳成，程平言，張健，尤小龍，胡峰

（貴州習酒股份有限公司，貴州 習水 564622）

高溫大曲是醬香白酒的糖化發酵劑，是保證其質量和風格的關鍵，高溫大曲制作過程采用自然固態發酵，發酵倉內不同部位溫度、水分等存在差異，導致安曲曲坯在入倉發酵后產生黃曲、白曲、黑曲3 種形態。入倉堆積于中層，溶氧較好易形成黃曲；入倉堆積于中下層，溶氧少，濕氣重，水分大，熱曲時間長則易形成黑曲；入倉堆積于上層，水分揮發快，熱曲時間短則易形成白曲[1]，3 種大曲在生產中自然形成的比例約為黃曲88%，白曲9%，黑曲3%[2]，3 種大曲發酵過程動態變化如圖1 所示。

圖1 黃曲、白曲、黑曲發酵過程動態變化Fig.1 Characteraction during fermentation process of yellow Daqu，white Daqu and black Daqu

近年來，針對3 種高溫大曲的差異研究陸續見報道，班世棟等[3]研究了不同顏色大曲酶活差異，發現白曲的液化酶、糖化酶、酸性蛋白酶和脂肪酶活力相對較高，黑曲的中性和堿性蛋白酶、纖維素酶和果膠酶活力較高，黃曲酶活力介于兩者之間。Deng 等[4]研究了不同顏色高溫大曲的差異：白曲表現出更高的蛋白酶活性和更低的酸度，黃曲糖化率最高，酯化率最低；功能預測表明，白曲和黃曲中編碼細菌酶的基因豐度較高，與白曲（59%）和黃曲（87%）中Kroppenstedtia 豐度較高有關，黑曲Thermomyces 豐度最高（80%）導致編碼真菌酶的基因豐度最高。張巧玲等[5]基于18 種游離氨基酸建立拆倉的白曲、黃曲、黑曲判別模型，提供了新的醬香型大曲類型判別方法。陳良強等[6]研究了出倉白曲（20 個）、出倉黃曲（21 個）、成品曲（113 個），結果表明微生物群落結構信息與3 種典型曲種具有強關聯性并以此為依據建立了高溫大曲類別判別模型。柳習月等[7]利用多組學技術對黃曲、白曲、黑曲進行解析，明確了不同曲種中微生物、代謝物的組成及差異，揭示了微生物以及代謝物之間的關聯性。Gan 等[8]對半成品曲（黃曲、白曲）微生物組成進行研究，填補了成熟大曲微生物群中間階段的研究空白，同時對比分析了半成品曲和成品曲在微生物組成和功能方面的差異，揭示了茅臺大曲微生物群落與功能特性關系。

3 種高溫大曲具備不同功能，對醬香白酒生產都有重要意義，目前業界對3 種高溫大曲的研究主要集中在其發酵結束階段，即半成品曲之間的差異，但由于3 種大曲在發酵之初就已形成差異，因此，本研究首次采用可培養結合未培養方法，深入解析黃曲、白曲、黑曲細菌菌群結構演替規律，同時探究物種相關性和理化因子對菌群結構多樣性的貢獻，從內在和外在初步揭示細菌菌群演替的驅動因素和調控機制，為保障3種高溫大曲產量連續性，提高制曲優質品率提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品的采集與保存

樣品采集自貴州習酒股份有限公司制曲車間，壓制成型的曲坯作為安曲樣品（發酵第0 天，直接取500 g作為一個樣品），分別于一次翻曲（發酵第8 天）、二次翻曲（發酵第14 天）、拆曲（發酵第39 天）各采集3 塊黃曲，粉碎混勻后取500 g，白曲、黑曲樣品采集方式參照黃曲，同時對樣品進行編號：AQ 代表安曲；YF-Y 代表一次翻曲黃曲，EF-Y 代表二次翻曲黃曲，CQ-Y 代表拆曲黃曲；YF-W 代表一次翻曲白曲，EF-W 代表二次翻曲白曲，CQ-W 代表拆曲白曲；YF-B 代表一次翻曲黑曲，EF-B 代表二次翻曲黑曲，CQ-B 代表拆曲黑曲，以上共計10 個樣品，于-80 ℃冰箱中密封保存、備用。

1.1.2 試劑

孟加拉紅培養基、營養瓊脂：北京奧博星生物技術有限責任公司；WL 培養基：上海博微生物科技有限公司；E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit 試劑盒：美國OMEGA BioTek 公司；Qubit3.0 DNA 檢測試劑盒：美國Life Invitrogen 公司；聚合酶鏈式反應引物：上海翌圣生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

無菌操作臺（SW-CJ-2F）：蘇州凈化設備有限公司；自動蒸汽滅菌器（KG-AP32L）：日本ALP 公司；電泳儀（DYCZ-21）：北京市六一儀器廠；凝膠成像系統（FR-1000）：上海復日科技有限公司；Qubit3.0 熒光定量儀：美國Life Invitrogen 公司；PCR 儀（ETC811）：北京東勝創新生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 可培養細菌分離篩選、鑒定

稱取10 g 樣品于90 mL 無菌水中，150 r/min 振蕩30 min 得到10-1原液，然后吸取1 mL 加入9 mL 無菌水中得到10-2樣液，進一步梯度稀釋為10-3、10-4，取10-2、10-3、10-4涂布，每個梯度3 個平行，37 ℃靜置培養2 d，挑取每個培養皿上不同形態的菌落劃線分離，得到純種菌株，每種形態采用甘油管平行保藏3 株，選取代表菌株送生工生物工程（上海）有限公司進行分子鑒定，測序結果運用美國生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI） 數據庫的堿基局部對準檢索工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）進行序列比對。

1.3.2 樣品DNA 提取、測序及生物信息學分析

總DNA 提取及聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）：采用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒提取樣本總DNA，具體操作流程見試劑盒說明。引物341F （5＇-CCTACGGGMSGCAGCAG-3＇）和805R（5＇-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3＇），PCR 擴增條件：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性20 s；55 ℃退火20 s；72 ℃延伸30 s；25 次循環；72 ℃終延伸5 min 降至4 ℃。PCR 反應體系：2×HieffR Robust PCR Master Mix 15 μL，正向及反向引物各1 μL，DNA 模板20～30 ng，使用ddH2O 補齊體系至30 μL。

測序：使用Illumina MiseqTM測序平臺，分別對細菌16S rRNA 基因V3～V4 區進行高通量測序。

物種注釋：下機數據經預處理得到有效序列，按照97%相似性對非重復序列（不含單序列）進行操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU）聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU 代表序列，采用核糖體數據庫（ribosomal database project，RDP）完成比對。

多樣性分析：用chao1 算法估計群落中含OTU 數目的指數；用Shannon、Simpson 指數估算樣品中微生物多樣性。用Coverage 表征各樣品文庫覆蓋率，反映測序結果是否代表樣本的真實情況[9]。

1.3.3 理化指標檢測

大曲溫度測量方式為取樣時將特制溫度計插入曲坯中心，待溫度穩定后讀取、記錄數據；還原糖采用斐林法[10]測定；酸度、水分、糖化力參考QB/T 4257—2011《釀酒通用大曲分析方法》進行測定[11]。

1.4 數據處理

1.4.1 物種間相關性分析

選取所有樣品中屬水平相對豐度≥1 %的物種，采用SPSS24.0 軟件計算Spearman 相關性系數，選擇顯著性p＜0.05 的物種，采用Cytoscape5.0 軟件繪制相關性網絡圖。

1.4.2 冗余分析（redundancy analysis，RDA）

采用理化指標與所有樣品中屬水平相對豐度排名前10 的優勢物種豐度數據，使用Canoco5.0 軟件進行RDA 分析。

2 結果與分析

2.1 3 種高溫大曲發酵過程可培養細菌差異性

3 個曲種發酵過程共分離篩選到8 個屬的12 種細菌，共保藏132 株，其中，發酵初始階段即安曲樣品共分離篩選到4 種細菌，黃曲發酵過程共分離篩選到7 種細菌，白曲發酵過程共分離篩選到6 種細菌，黑曲發酵過程共分離篩選到8 種細菌，見表1。

表1 可培養細菌來源及形態Table 1 Source and morphology of culture-dependent bacteria

由表1 可知，分布頻率較高的菌種有Bacillus amyloliquefaciens、Bacilluslicheniformis、Virgibacillusnecropolis、Kroppenstedtiasp.，尤其是Bacillusamyloliquefaciens，在所有曲種每個發酵階段均有檢出，Bacillus屬細菌可以產生淀粉酶、糖化酶以及吡嗪等風味物質[12-14]。僅在安曲樣品篩選到的可培養細菌有Staphylococcus gallinarum、Weissella confusa，僅在黃曲發酵過程篩選到的菌有Bacillus subtilis，研究報道黃曲糖化率高[4]，可能與Bacillus subtilis 產淀粉酶和糖化酶有關，僅在黑曲發酵過程篩選到的有Staphylococcus saprophyticus、Micrococcus sp.，Staphylococcus 作為大曲樣品中的可培養核心細菌，具有可耐受高酸、高乙醇等特性[15]，而白曲發酵過程未分離篩選到特有菌種，整體而言，黃曲和黑曲發酵過程的可培養細菌多樣性高于白曲。

2.2 3 種高溫大曲發酵過程未培養細菌差異性

2.2.1 α 多樣性

本次測序共檢出307 869 條有效序列，共檢出15 個門、44 個綱、84 個目、157 個科、276 個屬、404 個種的細菌，α 多樣性指數見表2。

樣品文庫的覆蓋率均達到99.8%以上，表明此次測序結果足以代表樣本真實情況。由表2 可知，白曲Chao1 指數低于黃曲和黑曲，說明白曲物種豐富度低于黃曲和黑曲。黃曲和黑曲Simpson 指數和Shannon指數呈現動態變化，說明黃曲和黑曲發酵過程中其微生物多樣性發生了較大的演變。白曲Simpson 指數呈現增加趨勢，Shannon 指數呈現減少趨勢，說明隨著發酵進行白曲細菌多樣性不斷減少。AQ 樣品Shannon 指數最低，Simpson 指數最高，其微生物多樣性最低。

2.2.2 細菌菌群結構多樣性

屬水平相對豐度見圖2。

圖2 屬水平相對豐度圖Fig.2 Plot of relative abundance at genus level

安曲曲坯微生物主要來源于母曲、原料等[16]，優勢細菌有Weissella （93.06%）、Kroppenstedtia （2.17%）、Enterobacter（2.00%），其中，Weissella 是絕對優勢菌，周天慈等[17]研究中高溫大曲微生物來源時也發現，該曲種在發酵開始階段Weissella 是主要細菌，并且初步探明了在該生產工藝下，Weissella 主要來源于室內草席，值得一提的是，Weissella 在黃曲和黑曲后續發酵階段均未呈現優勢，表明Weissella 菌屬可能并非這兩種曲形成的關鍵微生物。

黃曲發酵前期的優勢菌屬主要為Kroppenstedtia、Arthrobacter、Bacillus、Thermoactinomyces、Saccharopolyspora 以及Virgibacillus，發酵中期由Saccharopolyspora、Bacillus、norank_Bacteria、Pantoea、Kroppenstedtia、Thermoactinomyces 替代，發酵后期的絕對優勢菌屬為Kroppenstedtia，豐度達到90%以上，據文獻報道，Kroppenstedtia 菌屬耐熱能力強，在高溫大曲中經常被檢測到，但針對其發酵特性研究較少，需進一步揭示[18]，而Saccharopolyspora 在黃酒麥曲中作為優勢菌屬被報道，麥曲發酵最高溫度能達到50 ℃～60 ℃，表明該菌屬能在極端環境下以芽孢的方式生存[19]。白曲發酵初期 以 Bacillus、Saccharopolyspora、Lactobacillus、Weissella、Thermoactinomyces、Kroppenstedtia 為主，發酵中期演替為Bacillus、Saccharopolyspora、Weissella、Lactobacillus、Thermoactinomyces、Pantoea、Kroppenstedtia，而其發酵后期則由Thermoactinomyces、Bacillus、Psychrobacter、Acinetobacter 主導，Thermoactinomyces 菌屬的微生物具有較好的耐高溫特性，常在高溫大曲中檢出，如Thermoactinomyces daqus 分泌的高溫蛋白酶對大曲原料降解及大曲特征風味前體物質的形成具有潛在價值[20-21]。黑曲發酵過程中，norank_Bacteria、Arthrobacter、Kroppenstedtia、Bacillus 是發酵初期的優勢微生物，發酵中期優勢菌群為Saccharopolyspora、Bacillus，而發酵后期Thermoactinomyces、Arthrobacter、Acinetobacter 成為優勢細菌，Li 等[22]研究茅臺大曲中心黑色部分的細菌結構發現，排名前三的種分別是Bacillus sp.（45%）、Thermoactinomyces sp.（24%） 以及Saccharopolyspora sp.（21%），在本研究中，這3 個屬的微生物豐度也占了相當大一部分比例，與該研究相似。

2.3 可培養與未培養方法結果比較

未培養測序技術具有快速分析鑒定樣本中微生物群落組成的能力，特別是小類菌群的組成，可培養方法能夠獲得實體菌株，其可作為后續研究的物質基礎。本研究通過未培養方法檢測到的豐度排名前十的菌屬為Kroppenstedtia、Weissella、Saccharopolyspora、Thermoactinomyces、Bacillus、Arthrobacter、norank_Bacteria、Lact-obacillus、Psychrobacter、Pantoea，可培養方法分離篩選到的優勢菌屬有Kroppenstedtia、Weissella、Bacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Virgibacillus、Caldibacill-us、Micrococcus，兩種方法均檢測到了Kroppenstedtia、Weissella、Bacillus，但是可培養方法并未篩選得到未培養檢測到的其他優勢菌屬，是由于可培養方法存在工作量大、篩選不徹底等局限性，但就目前而言，可培養方法依然是獲得實體菌株并研究其生長代謝特征不可或缺的手段，兩種方法聯用能夠優勢互補，更全面解析菌群結構多樣性及其功能。

2.4 優勢物種相關性

細菌屬水平相關性網絡圖見圖3。

圖3 細菌屬水平相關性網絡圖Fig.3 Horizontal correlation map of bacteria at genus level

由圖3 可知，24 個菌屬間存在74 個正相關，9 個負相關關系，絕大多數細菌為正相關關系。其中，Weissella、Pediococcus 與其他菌屬間只存在負相關關系，尤其是Weissella，與Arthrobacter 呈顯著的負相關關系，Arthrobacter 在黃曲（23.58%）和黑曲（10.27%）發酵初始階段均作為優勢菌存在，但在白曲發酵初期其豐度接近于零，這可能是Weissella 生長受到Arthrobacter 的抑制，并未在黃曲和黑曲發酵過程保持其生長優勢的原因。

Psychrobacter 與Thermoactinomyces 為正相關關系，兩者在白曲發酵過程中，豐度均呈現逐漸增長的趨勢，最終形成了以這兩種菌屬為優勢的白曲菌群結構（豐度之和達到65.11%）；黑曲發酵過程中，Arthrobacter與Thermoactinomyces 間的顯著正相關關系，可能驅動黑曲最終形成以Arthrobacter 與Thermoactinomyces 為主導（豐度之和達到73.67%）的菌群結構，而黃曲發酵過程的優勢菌屬Kroppenstedtia 與任何一種細菌間無顯著相關性，可能是由于黃曲發酵的環境因子更適合該菌屬的生長，最終黃曲形成以該菌做為絕對優勢菌的菌群結構。

2.5 優勢物種與理化指標RDA 分析

理化指標結果見表3。優勢物種與理化因子RDA分析圖見圖4。

表3 理化指標Table 3 Physicochemical index

圖4 優勢物種與理化因子RDA 分析圖Fig.4 RDA analysis diagram of dominant genus and physicochemical factors

利用冗余分析（RDA）探究理化因子對優勢物種的影響，結果表明，Kroppenstedtia 與水分呈顯著負相關，較低的水分含量有利于該菌生長，結合黃曲發酵過程來看，隨著發酵進行水分逐漸降低，Kroppenstedtia 豐度逐漸升高，最終成為絕對優勢菌；Saccharopolyspora、Bacillus 與溫度和糖化力呈正相關，該研究結論與左乾程等[23]研究機械化制曲過程中細菌菌群結構演替的結論一致，大曲淀粉轉化力通常用糖化力和液化力來衡量，Bacillus、Saccharopolyspora 與糖化力的正相關關系暗示了這兩種微生物能產生糖化酶，而Bacillus 在白曲發酵前期、中期作為優勢菌存在，這可能是白曲糖化力要高于黃曲和黑曲的主要原因[24]；Thermoactinomyces 與酸度呈顯著正相關，與水分含量呈負相關，結合理化指標來看，黑曲在發酵前期和中期酸度高于其余兩種大曲，相對較高的酸度為該菌屬提供了適宜的生長環境，這可能是該菌屬最終在黑曲發酵結束形成優勢的原因。Weissella 與酸度呈顯著負相關，表明酸度過大會抑制其生長，這就解釋了Weissella 在安曲階段是優勢菌，但是隨著發酵進行，曲坯酸度上升，該菌屬相對豐度銳減。

3 討論與結論

高溫大曲生產采用開放式自然發酵，許多不可控的內生環境因子會影響其微生物菌群結構[25]，而不同的微生物菌群結構代謝特征差異大，因此采用可培養結合未培養方法，具有很好的互補性，兩種技術聯用解析菌群結構與功能特性更全面[26]。本研究中，可培養及未培養結果均表明，相對于黃曲和黑曲而言，白曲細菌多樣性低，結構穩定性高，這與Wang 等[27]研究不同類型成品曲的細菌結構得出的結論一致。

值得一提的是，在本研究中，一是無論是可培養還是未培養方法檢測到的初始階段的絕對優勢菌Weissella，在后續發酵過程并未一直延續其生長優勢，而未培養方法檢測到部分初始豐度極低的細菌反而隨著發酵進程不斷富集，在發酵結束成為了主導微生物，例如黃曲中的Kroppenstedtia；白曲中的Thermoactinomyces、Psychrobacter；黑曲中的Thermoactinomyces、Arthrobacter，上述特征性差異為3 種高溫大曲的最終判別提供了新的借鑒。二是某些細菌在安曲環節并未檢出但在后續發酵過程中檢出，例如可培養細菌Bacillus subtilis，Virgibacillus necropolis 等，未培養檢測中安曲階段豐度為零，但在后續發酵過程檢出，有的甚至在某一階段形成絕對優勢，例如Psychrobacter 在白曲拆曲，norank_Bacteria 在黑曲一次翻曲，這部分細菌的來源及其作用，有進一步研究的價值。

物種相關性分析結果表明，大部分細菌之間存在正相關關系，少部分細菌之間存在負相關關系，發酵過程中微生物間存在的共生、競爭及拮抗等關系，形成了復雜的相互調控機制控制著微生物間的此消彼長，而冗余分析則進一步揭示了理化因子對不同大曲細菌結構的重要影響：黃曲發酵結束時的絕對優勢細菌Kroppenstedtia 與水分呈強負相關；Bacillus 在白曲前兩個發酵階段都作為優勢菌存在，該菌與糖化力呈正相關，這可能是導致白曲糖化力較高的原因；而黑曲發酵后期的優勢細菌Thermoactinomyces 則與酸度呈正相關，與水分呈負相關。最新研究表明，理化性質和代謝圖譜可明確區分3 種不同類型的高溫大曲[28]，在此基礎上，以該類研究為參考，結合代謝組學技術明晰發酵過程微生物菌群與發酵環境、代謝產物的關系，進一步明晰3 種高溫大曲形成的驅動因素，保證不同曲種的產量和質量奠定理論基礎是今后的主要研究方向。