小檗堿與綠僵菌復配的相容性及對桃褐腐病菌的抑制作用

薛科科 李映 李朋鈺

摘要[目的]探討小檗堿與綠僵菌復配的可能性。[方法]考察小檗堿對綠僵菌孢子萌發、菌絲生長及產孢的影響，并測定小檗堿與綠僵菌復配對桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）的抑制作用。[結果]試驗濃度的小檗堿對綠僵菌的孢子萌發、產孢量和菌落形成未產生明顯影響；當綠僵菌與褐腐病菌共培養時，綠僵菌處于優勢菌群，褐腐病菌未能影響綠僵菌的生長；小檗堿與綠僵菌復配能完全抑制褐腐病菌的生長。[結論]小檗堿和綠僵菌可混合使用，二者相容性好。

關鍵詞 小檗堿；綠僵菌；桃褐腐病菌；相容性；防治

中圖分類號 S48 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）03-0178-04

Abstract[Objective] The aim was to explore the compatibility of berberine （BBR） with Metarhizium anisopliae.[Method] We investigated influences of BBR on spore germination，hyphal growth and sporulation of M.anisopliae，and examined the inhibition of BBRM.anisopliae complex on Monilinia fructicola，a major brown rot pathogen.[Result] The BBR had no significant effect on conidial germination，spore number and mycelial growth of M.anisopliae.Furthermore，M.anisopliae was the predominant species when cocultured with M.fructicola，and M.fructicola failed to retard the growth of M.anisopliae.[Conclusion]M.fructicola could be totally inhibited by the “mixture” of BBR and M.anisopliae.

Key words Berberine；Metarhizium anisopliae；Monilinia fructicola；Compatibility；Prevention

農藥殘留嚴重危害人體健康，生物農藥安全環保，如何減少農藥使用量是農藥減量和食品安全的重點研究方向。小檗堿作為傳統抗菌藥物，對多種革蘭氏陽性及陰性細菌有效，臨床主要用于治療腸炎，研究證明小檗堿還具明顯的抗癌、治療糖尿病、抗高血壓、治療心律失常等新功能[1]。小檗堿主要存在于黃連、黃柏、三顆針、十大功勞等中藥中，該類中藥資源豐富，小檗堿市場價格低廉，決定了其作為農用殺菌劑的成本優勢。小檗堿作為農用殺菌劑，對作物灰霉病、白粉病、褐腐病、晚疫病等防效較高[2]。

綠僵菌（Metarhizium anisopliae）作為重要的抗昆蟲病原真菌，具有生產容易、無殘留、持效期長、致病力強、對非靶標生物安全等優點，對多種作物害蟲有寄生致死作用，自20世紀60 年代至今，已有50多種綠僵菌制劑注冊登記[3]。但綠僵菌殺蟲速度慢和成本較高的缺點限制了其大面積推廣應用。

殺蟲劑與殺菌劑混合使用將節省人力、物力，減少農藥使用次數，同時提高防效、降低成本，保障食品安全。文獻報道，部分化學殺菌劑，如多菌靈、代森錳鋅和甲基硫菌靈對綠僵菌毒性大，與綠僵菌相容性差[4]。筆者所在課題組前期研究證明，小檗堿對桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）防效好[5]，綠僵菌對多種害蟲有防治作用[3]。基于此，筆者研究了小檗堿對綠僵菌孢子萌發、菌絲生長及產孢的影響，以及二者配伍對褐腐病菌的抑制作用，以期為評價小檗堿與綠僵菌聯合應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

80億孢子/g綠僵菌可濕性粉劑由重慶聚立信生物工程有限公司提供，黃連（Coptis chinensis Franch）中藥材購自北京同仁堂藥店，桃褐腐病菌由北京市農林科學院李興紅研究員惠贈。

1.2 方法

1.2.1 小檗堿提取。黃連粉碎，水浸泡，調pH 5.0，加纖維素酶和果膠酶，40～42 ℃酶解6 h，70%乙醇提取1.5 h，提取液用濃鹽酸調pH 1.5，再加入20% NaCl溶液，攪拌均勻，冰箱隔夜冷藏，產物析出，重結晶得小檗堿，HPLC檢測小檗堿含量為97%。

1.2.2 綠僵菌純化及孢子懸液制備。

制備PDA培養基，用解剖針蘸取綠僵菌孢子至平板，28 ℃培養，3 d后用0.6% Tween-80水溶液洗孢子，涂布至新培養基，得純化綠僵菌。將綠僵菌孢子逐步稀釋，顯微鏡下觀察，用血球計數板測定孢子含量，將孢子調至試驗所需濃度。

1.2.3 小檗堿抑制桃褐腐病菌EC50測定。以PDA培養基活化桃褐腐病菌，配制不同濃度小檗堿（0、1.500、3.000、6.000、12.000、24.000 μg/mL）的含藥培養基，每濃度3次重復。用打孔器取直徑8 mm的褐腐病菌菌餅，菌絲朝下置于培養基中心，28 ℃培養。7 d后采用十字交叉法測定菌落直徑，計算抑制率和小檗堿EC50[6]。

菌落直徑=測量菌落直徑平均值-8

小檗堿對桃褐腐病菌的抑制率=（空白對照組菌落直徑-帶藥組菌落直徑）/空白對照組菌落直徑×100%

1.2.4 小檗堿對綠僵菌的作用研究。

1.2.4.1 小檗堿對綠僵菌菌絲生長的影響。配制含小檗堿EC50（3.600 μg/mL）、10倍EC50（36.000 μg/mL）和100倍EC50（360.000 μg/mL）的PDA培養基，以不加小檗堿的平板為對照，每濃度重復 5次。取綠僵菌菌餅（直徑8 mm），置于含小檗堿培養基中央（菌絲朝下），28 ℃培養 36 h，采用十字交叉法測定菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。

1.2.4.2 小檗堿對綠僵菌孢子萌發的影響。取1 000孢子/mL孢懸液100 μL，接種于“1.2.4.1”含藥培養基，涂布均勻，以不加小檗堿的平板為對照，每濃度重復5次。25 ℃培養 24 h，顯微鏡下觀察孢子，計算孢子萌發數。

孢子萌發抑制率=（1-處理菌落數/對照菌落數）×100%

1.2.4.3 小檗堿對綠僵菌產孢量的影響。在無菌條件下，于“1.2.4.1”菌落半徑的 1/2 處，用內徑 8 mm 的滅菌打孔器打孔取樣，每菌落以“十”字形取 4 個點，置于裝有玻璃珠、含0.6% Tween-80水溶液，充分振蕩均勻，采用血球計數板計數，計算產孢抑制率。

產孢抑制率=（1-處理產孢量/對照產孢量）×100%

1.2.5 綠僵菌與褐腐病菌間的相互作用研究。

1.2.5.1 綠僵菌對褐腐病菌的作用。將桃褐腐病菌接種于PDA培養基，28 ℃培養6 d，用0.6% Tween-80水溶液配制桃褐腐病菌孢子懸浮液，濃度為1×105孢子/mL，取3 mL孢子液涂布于培養基，取綠僵菌菌餅（8 mm）置于平板中央，倒置，28 ℃培養36 h，觀察并記錄菌落生長情況。

1.2.5.2 褐腐病菌對綠僵菌的作用。制備PDA培養基平板，待培養基溫度降至45 ℃時，取1×105孢子/mL綠僵菌孢子懸浮液置于培養基上，培養基凝固時將褐腐病菌餅置于平板中央，28 ℃培養36 h，觀察并記錄褐腐病菌生長情況。

1.2.6 小檗堿和綠僵菌復配對褐腐病菌的抑制作用研究。

根據等效線法按表1制備含小檗堿 （EC50濃度為3.600 μg/mL，以a表示）和綠僵菌 （濃度為1×105孢子/mL，以b表示）的PDA培養基，培養基凝固時將褐腐病菌餅置于平板中央，28 ℃培養7 d，采用十字交叉法測定菌落直徑，每濃度3次重復。采用共度系數法計算共毒因子[7]。計算復配農藥抑制率，以共毒因子作為復配農藥藥效增效標準。若共毒因子大于20，則表示兩藥之間有協同作用；若共毒系數小于-20，則表示兩藥之間有拮抗作用；若共毒因子為-20～20，則表示兩藥之間作用相加。

混劑理論抑制率=小檗堿理論抑制率+綠僵菌理論抑制率

共毒因子=[（混劑實際抑制率-混劑理論抑制率）/混劑理論抑制率]×100%

2 結果與分析

2.1 小檗堿抗桃褐腐病菌EC50測定 由表2和圖1可知，隨濃度增加，小檗堿對褐腐病菌的抑制作用逐漸增強，當小檗堿濃度為24.000 μg/mL時，菌落直徑為3.67 mm，根據試驗結果計算得小檗堿EC50為3.599 μg/mL，與Hou等[6]的試驗結果（EC50=4.550 μg/mL）基本一致，表明小檗堿抑制褐腐病菌效果穩定。

2.2 小檗堿對綠僵菌菌絲生長的抑制作用

由圖2可知，當培養基添加小檗堿濃度為EC50（3.600 μg/mL）、10倍EC50（36.000 μg/mL）和100倍EC50（360.000 μg/mL）時，綠僵菌生長均較快，接種第2天，小檗堿即長滿培養皿，表明在試驗濃度范圍內綠僵菌為優勢菌，小檗堿對綠僵菌無抑制作用。這表明，小檗堿在100倍EC50的高濃度時對綠僵菌生長未產生影響，小檗堿防治桃褐腐病的田間使用濃度為0.125‰[5]，二者濃度相差28.8倍，故小檗堿和綠僵菌可復配使用。

2.3 小檗堿對綠僵菌產孢量和孢子萌發的影響

當培養基含小檗堿濃度為EC50（3.600 μg/mL）、10倍EC50（36.000 μg/mL）和100倍EC50（360.000 μg/mL）時對綠僵菌產孢量和孢子萌發均無抑制作用（表3）。可見，在試驗濃度范圍內小檗堿對綠僵菌分生孢子的產生和萌發是安全的。

2.4 綠僵菌與褐腐病菌之間的抑制作用

由圖3可知，當綠僵菌為優勢菌種時，完全抑制褐腐病菌的生長；以褐腐病菌為優勢菌種時，褐腐病菌不生長。總之，綠僵菌與桃褐腐病菌共培養時，綠僵菌均能很快成為優勢菌種，說明綠僵菌可抑制褐腐病菌生長。

2.5 小檗堿與綠僵菌復配對褐腐病菌的抑制作用

將不同濃度小檗堿與綠僵菌復配，制備含藥培養基。結果表明，不同配比的含藥培養基對桃褐腐病菌均具有較強的抑制作用，小檗堿與綠僵菌復配，在5/6a+1/6b、2/3a+1/3b、1/2a+1/2b、1/3a+2/3b、1/6a+5/6b范圍內可完全抑制褐腐病菌（圖4）。

3 結論與討論

試驗考察了小檗堿對綠僵菌孢子萌發、菌絲生長及產孢和菌落的影響。結果表明，試驗濃度的小檗堿對綠僵菌的孢子萌發、產孢量和菌落形成未產生明顯影響；進一步研究發現，當綠僵菌與褐腐病菌共同培養時，綠僵菌始終是優勢菌群，褐腐病菌不能影響綠僵菌的生長；當小檗堿與綠僵菌按一定比例復配時能完全抑制褐腐病菌的生長。國外登記的綠僵菌防治對象中，綠僵菌的靶標害蟲分屬12目33科，其中同翅目沫蟬科、蚜科、飛虱科、粉虱科和蟬科的害蟲對作物危害嚴重[8]。作物生長過程中會遭受病蟲害的危害，因此，防病和防蟲需同時進行，為節省人力、物力，減少農藥使用次數，小檗堿和綠僵菌可混合使用，二者相容性好。鑒于小檗堿原料易得、價格低廉、使用方便，小檗堿與綠僵菌配比宜調整為1∶1～5∶1，研究結果為評價小檗堿與綠僵菌聯合應用提供了理論依據。

參考文獻

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