椒樣薄荷脫毒苗的規模化生產研究

郭丹麗 王自健 蔣新明 路喆 李敏 徐盼盼 王樸

摘要[目的]更新伊犁地區的椒樣薄荷品種，對伊犁地區椒樣薄荷進行提純及復壯。[方法]采用組培技術對椒樣薄荷品種進行莖尖脫毒、離體快繁及大規模生產。以椒樣5號為材料，研究大規模生產下椒樣薄荷莖尖分化、增殖、生根的最適激素濃度。[結果]可使用白砂糖和瓊脂條代替蔗糖、瓊脂，降低經濟成本；大規模生產時，最適椒樣薄荷增殖培養基為1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA，最適生根培養基為1/2 MS+0.10 mg/L NAA。[結論]大規模組培不同階段所使用基本培養基不同，激素組合也不同，大規模生產時以經濟節約為主；利用莖尖快繁技術可快速更新換代椒樣薄荷品種。

關鍵詞椒樣薄荷；脫毒苗；組織培養；提純；復壯

中圖分類號S567.23+5文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）17-0122-02

Abstract[Objective]To update the peppermint cultivated varieties in Yili area， purify and rejuvenate Yili peppermint. [Method]Shoot tip detoxification， in vitro rapid propagation and mass production of peppermint varieties were conducted by tissue culture technology.Using No.5 pepper as the material， the optimum hormone concentration of peppermint tip differentiation， proliferation and rooting in large scale production was studied.[Result]Sugar and agar bars can be used instead of sucrose and agar to reduce economic costs. In mass production， the optimum proliferation medium of peppermint was 1/2 MS+0.5 mg/L 6BA+0.01 mg/L NAA， and the optimum rooting medium was 1/2 MS+0.10 mg/L NAA. [Conclusion]The basic medium used in different stages of tissue culture was different， and the hormone combinations were different. The technique of rapid propagation of stem tip can be used to quickly update peppermint varieties.

Key wordsPeppermint；Virusfree seedling；In vitro culture；Purify；Rejuvenation

基金項目兵團科技攻關與成果轉化項目（2016AC027）；兵團科技支疆項目（2014AB010）；師域發展創新支持計劃（2015AF011）。

作者簡介郭丹麗（1989—），女，新疆伊犁人，助理研究員，從事特色作物遺傳育種研究。*通訊作者，研究員，從事特色作物研究。

收稿日期2017-04-13

新疆椒樣薄荷的栽培種植已有50多年的歷史，種植面積占到全國種植面積的85%以上，已成為我國最重要的椒樣薄荷栽培基地。由于椒樣薄荷的栽培歷史悠久，品種更新速度慢，再加上容易感染病毒，伊犁地區種植的椒樣薄荷優良性狀退化，嚴重影響了椒樣薄荷的產量和經濟效益，制約了薄荷產業的發展。目前國內主要采用莖尖剝離方式來脫去危害薄荷的主要病毒[1]，此方法可有效解決因病毒病而導致的產量、品質下降問題，不僅可以短時間內獲得大量的無病毒苗，還保證了各品種的優良性狀。莖尖脫毒方法已被廣泛地運用到甘蔗[2]、馬鈴薯[3]、人參果[4]等多種植物中，脫毒效果十分明顯。為了改善品種退化、病毒病等嚴重影響伊犁地區椒樣薄荷產業發展問題，該試驗針對伊犁地區椒樣薄荷主栽品種開展脫毒及組織培養研究，探索在大規模培養條件下椒樣薄荷莖尖成苗的培養基配方。利用莖尖脫毒對伊犁地區種植的椒樣薄荷進行提純復壯，大規模快速生產椒樣薄荷脫毒種苗，為解決伊犁地區椒樣薄荷品種退化問題、大規模生產椒樣薄荷原原種苗奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為伊犁地區主要種植的薄荷品種椒樣5號。

1.2方法

1.2.1培養基制備。

以MS為基本培養基，加入蔗糖3%、瓊脂0.7%，pH調至5.8，在121 ℃高溫下滅菌20 min，等溫度壓力降下來后，取出培養瓶置于超凈工作臺上。

1.2.2外植體消毒。

選取椒樣5號生長健壯的匍匐莖段，流水沖洗30 min，然后剪取帶腋芽莖段或莖尖1 cm左右，70%乙醇浸泡40 s，0.1%升汞消毒浸泡5～6 min，取出材料用無菌蒸餾水沖洗5～6次，每次1 min，沖洗完畢用無菌濾紙吸干水分待用。

1.2.3建立無菌區。

將消毒后的材料用剪刀剪一個斜面，將莖段或莖尖（新剪的切口斜面）放置到事先配制好的普通MS培養基上進行培養，溫度（24±2）℃，光照2 500 lx，光照時間16 h/d。3 d后觀察，如果發現瓶內有霉菌或細菌污染的材料應及時清理，注意要整瓶移走清理，避免污染其他瓶苗。

1.2.4莖尖脫毒。

待瓶苗新的幼芽長至1～2 cm時，可進行脫毒工作。在無菌條件下使用解剖鏡觀察，采用鑷子剝去多余的葉片，露出生長點，用解剖刀切取0.2～0.5 mm的莖尖，放到不同濃度6-BA（1.0、2.0 mg/L）和NAA（0.05、0.10、020 mg/L）組合的培養基中進行培養。20 ℃暗培養22～26 h后，轉到培養溫度為70 ℃，光照強度2 000～2 500 lx，光照時間16 h/d的條件下培養，25 d后統計成活率和脫毒率。

1.2.5優化培養基。

以MS為基本培養基，將MS培養基中的蔗糖用普通的白砂糖代替，瓊脂粉用普通的瓊脂條代替，其余成分不變，配制成優化后的MS基本培養基。分別用普通培養基和優化后的培養基培養幼芽，20 d后觀察其生長情況。

1.2.6繼代培養。

將長出的嫩芽接種到增殖培養基上，以MS培養基和1/2MS培養基為基本培養基，分別添加6-BA（0.5、1.0 mg/L）和NAA（0.01、0.05 mg/L）的激素組合。在培養溫度為28 ℃，光照強度2 500 lx，光照時間16 h/d條件下培養，每5 d觀察1次，25 d后各處理隨機統計5瓶，觀察幼苗的生長情況。

1.2.7生根培養。

將伸長的側芽剪成5～8 cm的莖段，接種到添加6-BA（0、0.5 mg/L）和NAA（0.05、0.10、0.50 mg/L）的1/2 MS培養基上，20 d后統計生根數，各處理隨機統計5瓶。

2結果與分析

2.1不同激素組合對椒樣薄荷脫毒成活的影響

切取椒樣薄荷莖尖0.2～0.5 mm后，放到不同激素配比的培養基中進行試驗，由表1可知，不同激素配比均可誘導莖尖分化出椒樣薄荷幼苗，激素水平不同對其誘導小苗的成活個數有較大的影響，2.0 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA激素處理最有利于莖尖幼苗的成活。不同激素配比對誘導出的幼苗脫毒率沒有明顯影響。

2.2椒樣薄荷基本培養基的優化

由于該研究為大規模工廠化育苗做準備，一切以成本最小化為標準，試驗將基本培養基中的蔗糖換為白砂糖，瓊脂粉換為瓊脂條，其他成分不變。對椒樣薄荷進行培養發現，優化后的培養基對椒樣薄荷組培苗的影響不大。故椒樣薄荷的增殖培養和生根培養采用改良之后的培養基作為基本培養基。

2.3不同激素組合對椒樣薄荷繼代繁殖的影響

通過觀察發現，將幼苗轉入增殖培養基培養10 d后椒樣薄荷莖節明顯伸長并發出少量葉芽，15 d后側芽不斷伸長且長勢良好，20 d后部分外植體莖段基部膨大處有少量根系長出。25 d后側芽長度一般為5～9 cm，平均有2～4個莖節。由表2可以看出，25 d后不同處理側芽生長情況均比較良好，MS基本培養基中側芽的萌發和生長要優于1/2 MS基本培養基中，但二者不存在顯著性差異，所有莖段基部膨大，未出現愈傷組織，部分處理有少量根系生成。外援添加激素可改變外植體的新增莖節數，以激素處理0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA為最好。

2.4不同激素組合對椒樣薄荷生根的影響

增殖培養下，1/2 MS培養基對椒樣薄荷的增殖率沒有顯著影響，暗示無機鹽濃度對椒樣薄荷的生長差異不大，再加上大量培養時從節約成本考慮，生根培養將以1/2 MS培養基作為基本培養基進行試驗。接種10 d后，6個處理莖段基部均長出白色根系，繼續生長，到接種20 d時，每株6～9條根，差異不是很明顯，具體根系生長情況見表3。經比較，生根階段采用1/2 MS+0.10 mg/L NAA有利于根系生長。

3結論與討論

該研究采用莖尖處理對椒樣薄荷進行脫毒，切取0.2～0.5 mm莖尖進行培養，成活率、脫毒率最高，均為77.7%。謝文申等[1]使用熱處理結合莖尖培養法對野薄荷進行脫毒，切取0.3～0.5 mm莖尖培養，其成活率為50%，而脫毒率可達80%，可能是由于莖尖培養所使用的培養基不同引起的。同張倩等[5]的研究一樣，該研究發現在繼代和增殖培養過程中，使用1/2 MS基本培養基就可以滿足椒樣薄荷所需的營養，有效節約了生產成本。

由于過高濃度的激素處理會使組培苗出現玻璃化現象，該研究采用較低濃度的激素進行增殖培養，發現低劑量的激素處理椒樣薄荷，未出現椒樣薄荷玻璃化現象，且新增的莖節數也較多，激素水平為0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA時增殖達到最優，激素水平為0.10 mg/L NAA時生根水平達到最優。該研究對椒樣薄荷進行大規模的組織培養試驗，結果與王小敏等[6]的研究結果有少許出入，可能是由于椒樣薄荷對激素的要求較低，只需要少量的植物激素就可滿足分化增殖條件，也可能是使用的基本培養基不同造成的。

參考文獻

[1] 謝文申，付晏昆，周露，等.野薄荷組織培養脫病毒技術研究[J].現代農業科技，2016（6）：61-62，64.

[2] 陳玉霞，邱建輝，張朝臣，等.甘薯莖尖脫毒培養技術研究[J].安徽農業科學，2016，44（13）：135-137，219.

[3] 劉江娜，李東方，張愛萍，等.不同品種馬鈴薯莖尖脫毒培養方法優化技術研究[J].新疆農業科學，2014，51（2）：284-290.

[4] 翟進升，鄒愛蘭，常興亞.人參果莖尖脫毒培養與快速繁殖[J].植物資源與環境學報，2004，13（3）：41-43.

[5] 張倩，管遠清，李青.不同培養基類型對薄荷組織培養的影響[J].山東農業科學，2014，46（11）：30-31，38.

[6] 王小敏，李維林，梁呈元，等.椒樣薄荷的組織培養研究[J].安徽農業科學，2007，35（11）：3159-3160，3162.