氣相色譜—質譜聯用技術分析大氣細顆粒物對小鼠肺組織代謝輪廓的影響

史純珍+毛旭+韓茜+樊沖+金萌

摘 要 建立了基于氣相色譜質譜聯用技術（GCMS）分析大氣細顆粒物（PM2.5）滴注對小鼠肺組織代謝輪廓的影響的研究方法。通過分析肺組織細胞內代謝物的變化，研究不同濃度PM2.5對小鼠肺組織代謝的毒性機制。鼻腔分別滴注0、7.5、20.0和37.5 g/L的PM2.5懸液，提取肺組織胞內物質，預處理后進行GCMS分析，結合主成分分析法（PCA）、偏最小二乘判別分析法（PLSDA）進行數據解析，通過PLSDA得分圖可將不同PM2.5染毒濃度下的肺組織胞內物質明顯區分。運用PLSDA載荷圖及模型的變量重要性因子（VIP）值，發現了7種代謝物可作為區別不同濃度PM2.5下代謝組的潛在生物標志物，分別為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、鳥氨酸、延胡索酸、檸檬酸、嘌呤（p<0.01）。代謝途徑分析結果表明，PM2.5滴注使小鼠肺組織受到氧化損傷，氧化應激反應增強，抑制了三羧酸循環（TCA循環）及嘌呤代謝。本研究為深入解析PM2.5致毒機理提供了新的方法及理論依據。

關鍵詞 大氣細顆粒物； 代謝輪廓； 主成分分析； 毒性機理

1 引 言

大氣細顆粒物（PM2.5）是指空氣動力學直徑小于2.5 μm的顆粒物，含有有機/無機碳（OC/EC）、硫酸鹽、硝酸鹽、重金屬和多環芳烴（PAHs）等多種有害物質[1，2]。PM2.5顆粒隨呼吸進入人體肺泡后，可破壞肺泡組織，導致矽肺病，其攜帶的重金屬、PAHs等可進入血液系統，危害人體健康[3]。在中國城市環境中，PM2.5中的PAHs及其衍生物是導致人體患肺癌的主要原因[4]。目前，研究PM2.5的健康效應主要采用流行病學及毒理學研究方法。流行病學研究證實，PM2.5的污染程度會影響人群的發病率和死亡率，大氣中PM2.5濃度每升高10 μg/m3，人群呼吸系統疾病的死亡率從2.1%升高到3.75%[5]。PM2.5可在肺部沉積，導致慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary diseases， COPD）或肺癌[6]。目前，定量分析PM2.5劑量效應關系的研究都是基于環境流行病學研究數據，而毒理學研究結果可為流行病學研究所發現的顆粒物健康效應提供機理解釋[7]。PM2.5的成分復雜，并隨著時空變換而不斷變化，其損傷程度和機制也會相應改變，這類研究是當今PM2.5研究中的熱點。

代謝組學是研究健康效應的有力工具，其揭示的小分子代謝產物變化是機體內基因、蛋白質、酶等功能變化的一系列事件的最終結果，直接反映了生物體系的最終狀態，可反映機體特定病理生理狀態下整體代謝物質的變化，為疾病診斷、揭示致病機理提供新的研究思路[8，9]。Belén等[10]采用直接輸注電噴霧電離四極桿飛行時間質譜（DIESIQTOFMS）和氣相色譜質譜聯用（GCMS）檢測肺癌（LC）組和對照組的支氣管肺泡灌洗液（BALF）代謝物差異，采用偏最小二乘法（PLSDA）分析和篩選生物標志物，發現肺癌導致谷氨酸鹽和谷氨酰胺代謝途徑的變化，并評估及驗證了其潛在的生物標志物。Izabella等[11]對在空氣污染中暴露的人肺灌洗液進行多平臺代謝組學研究，結果表明，結合GCMS、液相色譜質譜聯用（LCMS）、核磁共振（NMR）可檢測出支氣管液（BW）和支氣管肺泡灌洗液中的82種代謝物，其中46種代謝物顯示出由于生物柴油暴露導致的代謝差異。

王曉飛等[12]利用LCMS的代謝組學技術，分析了經PM2.5懸液氣管滴注暴露后成年雄性大鼠睪丸代謝組的全局變化，采用偏最小二乘判別分析（PLSDA）和非參數檢驗進行統計分析，最終鑒定了56種差異代謝物，并發現PM2.5暴露會引起大鼠睪丸的氨基酸和核苷酸代謝紊亂、脂類代謝異常和類固醇激素代謝失衡。但該研究未對大鼠肺臟進行PM2.5毒理研究。Wang等[13]利用超高效液相色譜質譜聯用技術（UPLCMS）對成年大鼠以1 mg/kg/周的劑量進行PM2.5懸液滴注，連續滴注3月后解析肺組織代謝物，發現31種代謝物含量升高、19種代謝物含量降低，通過代謝途徑分析推測PM2.5可干擾助氧化抗氧化平衡，并與磷脂、甘油磷酸、鞘脂和嘌呤的變化密切相關。但該研究主要針對單一濃度下的PM2.5對大鼠肺組織的健康效應，并未研究PM2.5濃度變化對其影響。本研究通過采集PM2.5樣品，并配制成不同濃度懸浮液（7.5、20.0和37.5 g/L），對小鼠進行鼻腔滴注，通過對實驗組與對照組的代謝物進行主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLSDA），研究其對小鼠肺組織的濃度效應關系，尋找不同濃度PM2.5影響肺組織代謝的潛在生物標志物，及其對相關代謝的影響。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

TH150C型智能中流量空氣總懸浮微粒采樣器（武漢市天虹儀表公司）； Trace130型氣相色譜質譜聯用儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）； QL861 型旋鍋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）； TB215D型（十萬分之一）電子天平（美國DENVER公司）； 114 型低溫高速離心機（德國Sigma公司）； SANYO MDF382型超低溫冰箱（日本SANYO公司）。

乙醚、氯化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）； 乙腈（美國Thermo Fisher Scientific公司）； 分析純甲氧基胺、吡啶、甲基三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺（MSTFA）、二十二烷、庚烷，均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。實驗用水為超純水。清潔級雄性KM小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，5周齡，體重38～42 g （動物生產許可證號：SCXK（京）20160011）。動物實驗環境：SPF級動物實驗室，控制室內溫度18～22℃，相對濕度40%～50%，小鼠給予標準飼料和飲用水，于室內保持12 h光照、12 h避光循環飼養。

2.2 PM2.5采集與制備

2.2.1 PM2.5采集 本研究采用TH150C型智能中流量空氣總懸浮微粒采樣器與PM2.5切割器配合采樣，采樣濾膜為潔凈的玻璃纖維濾膜。樣品采自北京工商大學東校區（北京市海淀區阜成路11號），連續采樣15 d，每天采樣時間24 h。

2.2.2 采樣濾膜處理及PM2.5懸液制備 采樣后的濾膜，將有塵面兩次對折剪成小塊，用超純水低溫超聲處理3次，每次20 min，6層紗布過濾去掉濾膜，濾液冷凍真空干燥，待其水分完全蒸發，可得到灰色絮狀物，稱重，低溫保存，備用。測定時用生理鹽水分別配制成7.5、20.0和37.5 g/L懸浮液，4℃保存，測定前超聲振蕩使懸液混勻后進行測定。

2.3 動物實驗

28只雄性ICR小鼠隨機分成4組（n=7）：對照組（生理鹽水組）、低劑量組（7.5 g/L）、中劑量組（20 g/L）、高劑量組（37.5 g/L）。采用鼻腔滴入式氣管滴注法，用乙醚將小鼠麻醉，用絲線掛住小鼠上門齒，使其自然懸掛在自制泡沫架上，用移液槍吸取懸浮液并注入鼻腔中，每天滴注一次，滴注量3 mL/kg（60 μL/只），連續滴注3天，滴注后立即恢復自由飲食。于第三次滴注24 h后處死，采集肺組織。

將肺組織剪成小碎片后置于玻璃勻漿管中，加入2倍質量的生理鹽水，將玻璃勻漿管插入冰水混合物中，上下轉動研磨數十次（6～8 min），充分研碎，使組織勻漿化。將制備好的勻漿于4℃ 3000 r/min離心10 min，收集上清液，80℃保存。

2.4 GCMS分析

GCMS的樣品制備過程包括去蛋白化、甲氧基化和最終衍生化三個基本步驟。將肺組織勻漿樣品從80℃冰箱取出后，冰上解凍，移取100 μL樣品于1 mL離心管中，加入300 μL預冷的乙腈沉淀蛋白，旋渦3 min，氮氣吹干，加入50 μL 15 mg/mL甲氧基胺的吡啶溶液，混勻，80℃水浴振蕩反應15 min。再加入衍生化試劑MSTFA 50 μL，振蕩30 s，80℃水浴振蕩反應15 min； 加入0.1 g/L二十二烷（內標L）的庚烷溶液150 μL。混勻后離心，取上清液到微量進樣管，供GCMS分析。

氣相色譜條件：TGWAX毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）； 進樣口溫度，250℃； 升溫程序：起始溫度50℃，保持1 min，以5℃/min升溫至300℃，保持5 min； 載氣（He）； 流速1.0 mL/min； 進樣量1.0 μL； 分流比20：1。質譜條件：電子轟擊（EI）離子源； 電子碰撞能70 eV； 離子源溫度280℃； 傳輸線溫度250℃； 質量掃描范圍m/z 50～600。全掃描方式掃描； 溶劑延遲8 min； 調諧文件為標準調諧。

2.5 數據處理

采用NIST軟件對總離子色譜圖進行質譜峰的定性和定量分析，獲得代謝物的相對含量（與內標峰的比值）。然后將數據導入SIMCAP進行PCA、PLSDA； 應用SPSS軟件（Version 24.0， IBM）進行顯著性分析。通過得分圖、載荷圖、F檢驗和模型的變量重要性因子（Variable importance factor， VIP）考察不同濃度含量差異并試圖揭示其生物學效應。

3 結果與討論

3.1 方法學考察

3.1.1 精密度與重復性 圖1為所獲得的GCMS生物體液（肺組織勻漿）分析的總離子流（TIC）圖，其中各種代謝物，如氨基酸、有機酸、糖類、 （GCMS）脂肪酸、固醇等依次從GC色譜柱上洗脫。在分析樣品之前，首先對分析方法進行考察，包括進樣精密度、制備重復性、樣本穩定性、線性和檢測限。分別對同一制備好的肺勻漿樣本連續進樣6次，計算主要共有峰的峰面積相對標準偏差（RSD），發現主要共有峰的峰面積RSD<5%。對同一樣本平行制備6份，計算主要共有峰的RSD，肺組織勻漿的RSD<10%。

3.1.2 樣品穩定性 為保證實驗的重復性，生物樣品采集后需要在80℃低溫保存。然而，在反復的凍融過程中，代謝物的組成或濃度可能會發生變化。為了考察樣品在反復凍融后的穩定性，將80℃凍存的樣品取出800 μL，室溫下解凍，取出200 μL進行樣品制備。將剩余的600 μL樣品繼續于80℃凍存，第二天使用同樣方法進行代謝物提取，并進行測定。以此類推，共進行4次凍融。計算共有峰面積的RSD。實驗結果發現，共有峰面積的RSD<15%。

3.1.3 代謝物譜分析與物質鑒定 代謝物的物質鑒定主要基于NIST質譜數據庫，在數據庫匹配中，匹配度（Match）表示所檢物質的質譜圖與庫中標準物質的質譜圖的相似程度，而可能性（Probability）表示該物質可被認為是候選物質的幾率。依據匹配度>900，且可能性>80%，共檢出32種代謝物。

3.2 代謝物相關性分析

3.2.1 肺組織勻漿代謝物譜數據處理 應用PCA和PLSDA法對樣本進行數據分析，圖2為不同PM2.5滴注濃度下的小鼠血清代謝PLSDA得分圖和載荷圖。

由圖2A可見，小鼠肺組織在不同濃度的PM2.5滴注下，代謝輪廓呈現明顯差異，中濃度（20 g/L）和高濃度（37.5 g/L）組有個別樣品存在重疊，但仍可區分，且對照組與實驗組差異明顯。隨著滴注濃度增大，小鼠死亡率升高。說明小鼠的耐受性降低，當滴注濃度為37.5 g/L時，小鼠耐受性接近極值，其代謝輪廓也與低、中濃度組及對照組差異明顯。

圖2B為小鼠肺組織的PLSDA載荷圖，圖中每個點代表胞內一個代謝物變量，離原點較遠的點為潛在的生物標志物[14]。圖3為PLSDA的VIP圖，VIP因子可以用來反映代謝物對肺組織代謝差異的貢獻。結合載荷圖、以及第一主成分和第二主成分的VIP值，在0.95的置信區間內，VIP>1的代謝物有：鳥氨酸、延胡索酸、檸檬酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、嘌呤7種代謝物，說明當滴注不同濃度PM2.5懸液時，這些代謝物在肺組織代謝通路中受到影響。

3.2.2 肺組織勻漿代謝物含量的改變 使用F檢驗統計分析法檢查上述備選的潛在生物標志物在對照組和不同PM2.5濃度差異的顯著性，結果表明，對這些代謝物分別進行spss數據分析一般線性模型多變量F檢驗， p<0.01，說明這些代謝物在不同PM2.5濃度組中差異極其顯著，具有統計學意義。最終確定與PM2.5滴注密切相關的關鍵代謝物為鳥氨酸、延胡索酸、檸檬酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、嘌呤。

3.3 代謝物含量變化

由圖4A可知，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、鳥氨酸的相對濃度均隨PM2.5滴注濃度的增加而減少，可能表示支鏈氨基酸代謝紊亂，肺組織細胞處于氧化應激狀態，TCA循環受到抑制。由圖4B可知，延胡索酸濃度下降，延胡索酸是TCA循環的重要中間體，其濃度下降代表TCA循環受到抑制[15]。檸檬酸先增加后減少，可能是由于細胞內活性氧（ROS）含量的升高破壞了TCA循環而造成[16]。

隨著PM2.5染毒濃度的升高，氧化應激反應逐漸增強，嘌呤含量明顯升高（圖4C）。嘌呤的代謝產物為尿酸，由圖4D可見，嘌呤含量逐漸升高，而尿酸含量相應減少，因此PM2.5染毒濃度增加使小鼠肺組織的嘌呤代謝受到了抑制。而尿酸是人體的嘌呤核苷降解途徑中的最終酶催化產物[17]。有研究表明，尿酸尿囊素轉換是血小板濃縮液中氧化損傷的一項生物標志物； 尿酸作為過量的活性氧ROS的淬滅劑，其含量的提高有利于減少生物損傷[18，19]。而通過PM2.5滴注的小鼠出現嘌呤含量升高而尿酸減少，因此可推斷其受到了一定程度的氧化損傷。

4 結 論

本研究利用基于GC/MS的代謝組學方法研究了不同PM2.5染毒濃度對小鼠的肺組織代謝譜的變化。多元統計分析表明，滴注不同濃度PM2.5的小鼠肺代謝譜存在顯著差異。篩選出7種關鍵代謝產物，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、鳥氨酸、延胡索酸、檸檬酸水平隨滴注濃度增加而降低，嘌呤含量呈增加趨勢。結合代謝途徑分析，發現PM2.5滴注時小鼠肺組織受到氧化損傷，氧化應激反應增強，削弱了肺細胞TCA循環，嘌呤代謝受到抑制。此研究為深入解析PM2.5致毒機理提供了新的視角及理論依據。

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