基于聚對苯二甲酸乙二醇酯薄膜的石墨烯/金納米粒子/葡萄糖氧化酶柔性電極的制備及檢測葡萄糖

徐杰+孫文+賀路影+張芹+蘇文金

摘 要 采用化學氣相沉積法生長多晶石墨烯（Graphene， G），轉移至聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）薄膜表面，通過控制金溶膠蒸發速率，在多晶石墨烯表面組裝均勻分布的亞單層金納米粒子（AuNPs）；然后修飾巰基乙酸，通過共價交聯反應將葡萄糖氧化酶固定于AuNPs表面，構建基于PET膜的石墨烯/金納米粒子/葡萄糖氧化酶（G/AuNPs/GOD）柔性電極。此電極在工作電位0.6 V（vs.SCE電極）、pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液、室溫25℃條件下，差分脈沖伏安法響應電流與被測葡萄糖濃度在0.05～10.55 mmol/L范圍內呈線性關系，線性方程為I（108A）=0.2629 C（mmol/L）+1.4149，線性相關系數 r=0.9955，檢出限1 μmol/L （3σ）。 G/AuNPs/GOD柔性電極的制備可為特定環境和可穿戴設備的葡萄糖檢測提供了新的途徑和方法，拓展了葡萄糖檢測的應用范圍。

關鍵詞 葡萄糖； 柔性電極； 葡萄糖氧化酶； 石墨烯； 金納米粒子

1 引 言

葡萄糖的檢測在醫學、工業生產、食品、環境等領域均有廣泛的應用 [1]。其中，基于葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase， GOD）的電化學檢測方法是應用最廣泛的方法之一，例如長期使用的生化分析儀或植入式的血糖傳感器等設備均采用了此方法。葡萄糖氧化酶電極主要利用酶對底物的專一選擇性和催化反應的高效性，可在復雜樣品（如血液）中直接、高靈敏地檢測葡萄糖的催化氧化產物，而不易受其它成分干擾；同時具有較高的穩定性，可多次或長期使用。與所有的生物酶電極類似，葡萄糖氧化酶電極制備的關鍵是如何將酶長期穩定固定在電極表面，保持酶的活性。目前已經發展了許多酶的固定方法，如電化學法[2，3]、層層自組裝法[4]，共價交聯法[5]、溶膠-凝膠法[6～8]等。新的納米材料的出現，如金納米粒子[9]、碳納米管[10]、石墨烯[11～13]、石墨烯/金納米粒子復合物[14～16]等，不但具有高的比表面以固定更多的酶，還可以增強電子傳遞的能力。在已報道的石墨烯相關研究中，主要使用其微納米顆粒或懸浮液形式進行加工，如Hui等[11]將石墨烯粉末懸浮液滴涂在金盤電極上，滴加葡萄糖氧化酶和Nafion溶液成膜，制備葡萄糖檢測電極；Wang等[14]在玻碳電極上滴加石墨烯懸浮液，干燥后再浸入氯金酸溶液，利用電化學法共合成石墨烯/金納米粒子復合物，再滴加葡萄糖氧化酶形成葡萄糖檢測電極。這些研究充分利用了石墨烯納米結構（片或卷）大的比表面積和良好的電子傳遞能力，顯著改善了葡萄糖酶電極的性能。但石墨烯作為可大面積制備的二維納米材料，在柔性電極和可穿戴裝備方面的應用仍較少。

本研究將化學氣相沉積法生長于銅箔上的多晶石墨烯轉移至聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）薄膜表面，通過控制金溶膠蒸發速率，在多晶石墨烯表面組裝均勻分布的亞單層金納米粒子，修飾巰基乙酸，然后將葡萄糖氧化酶共價固定于金粒子表面，構建了基于PET薄膜的石墨烯/金納米粒子/葡萄糖氧化酶G/AuNPs/GOD柔性電極，利用電鏡、傅立葉變換紅外（FTIR）光譜、電子能譜對電極進行表征，考察了柔性電極對葡萄糖檢測的線性范圍、檢出限、穩定性、重復性、選擇性等性能。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Hitachi S-4800掃描電子顯微鏡（日本日立公司）；CHI 760 D電化學工作站（上海辰華儀器公司）；Rigaku Ultima IV型 X-射線衍射儀（日本理學公司）；NicoletAvatar 330傅里葉變換紅外光譜儀 （美國熱電公司）；Mill-Q超純水機（美國Millipore公司）。

葡萄糖氧化酶（GOD， 100～250 U/mg，廈門慧嘉生物科技有限公司）；氯金酸（HAuCl4·4H2O）、H2O2（30%）；、檸檬酸鈉（C6H5Na3O7·2H2O）；Na2HPO4、NaH2PO4（國藥集團化學試劑有限公司）；所用試劑均為分析純；實驗用水均為超純水（>18.2 MΩ·cm）。

2.2 G/AuNPs電極的制備

多晶石墨烯/PET薄膜電極由廈門大學物理系蔡偉偉課題組提供，制備方法為在銅箔上采用化學氣相沉積法生長石墨烯，然后通過PMMA轉移至PET薄膜表面制備[17]。

Au納米粒子（AuNPs）按照文獻[8]方法用檸檬酸還原氯金酸制備合成：在沸騰條件下，向200 mL 0.01% （m/V） HAuCl4溶液中快速加入1.4 mL 1% （m/V）檸檬酸三鈉，反應30 min，得到55 nm AuNPs。取100 mL AuNPs原液， 6000 r/min離心，移去上層清液，得到2 mL濃縮液。再加5 mL超純水離心清洗兩次，移去上層清液，制得2 mL備用AuNPs濃縮液。取20 μL滴加到5 mm × 10 mm的石墨烯基電極的一側，將其置于加蓋的培養皿中蒸發直至完全干燥，AuNPs形成0.3 cm半徑的圓形圖案，即制得面積為0.28 cm2的G/AuNPs電極。

2.3 G/AuNPs/GOD電極的制備

將G/AuNPs電極置于含1%（V/V） 巰基乙酸（TGA）溶液中浸泡12 h，用超純水淋洗后將G/AuNPs-TGA電極浸入含0.01 mol/L 4-二甲氨基吡啶（DMAP）的碳二亞胺（EDC，0.05 mol/L）與N-羥基丁二酰亞胺（NHS，0.05 mol/L）[19，20]混合溶液中浸泡1 h，取出后用超純水淋洗，再將其放入10 mg/mL GOD溶液中浸泡2 h，用pH 7.0 的PBS溶液淋洗，即制得G/AuNPs/GOD電極（圖1）。于4℃保存備用。

2.4 葡萄糖濃度檢測

采用三電極體系，以制備的G/AuNPs/GOD電極為工作電極， 飽和甘汞電極為參比電極，鉑片電極為對電極進行實驗。在室溫條件下，于20 mL 0.1 mol/L pH 7.0 的PBS中在0～1.2 V電壓下進行循環伏安測試、控制電位為0.6 V條件下進行計時電流測試， 控制掃速50 mV/s， 在0～1.1 V電壓范圍單向掃描進行示差脈沖伏安測試，分別記錄G/AuNPs/GOD電極對葡萄糖的電流響應。

3 結果與討論

3.1 G/AuNPs/GOD電極的表征

從電鏡結果（圖2）可見，在室溫條件下，于加蓋的表面皿中蒸發干燥的方法可制備得到較大面積、分布比較規整均一的AuNPs亞單層結構。溶液在固體表面蒸干后，會形成明顯邊緣堆積而中央稀薄的現象，即咖啡環效應。通過控制固體表面的親疏水性和蒸發速度，可顯著抑制咖啡環效應，獲得較均勻的沉積效果。由于石墨烯表面富含苯環結構，具有較強的疏水性，本研究使用加蓋的蒸發皿，使其蒸發速率較慢，因而顯著減輕了咖啡環效應，獲得較均勻的亞單層結構。

采用傅立葉變換紅外（FTIR） 光譜對電極修飾過程進行表征。圖3是 AuNPs上修飾巰基乙酸的 FTIR 光譜，在 637 cm1處有一微弱的振動峰，歸屬于CS鍵的對稱振動，說明巰基乙酸在金納米粒子表面成功修飾。圖3c是AuNPs-TGA電極偶聯GOD后的 FTIR 光譜曲線[21]，與修飾前相比，637 cm1處的小峰消失， 而1644 cm1處出現一個新峰，主要歸屬為GOD上CO的伸縮振動，而1095 cm1峰更加明顯，其歸屬于CO單鍵的伸縮振動，這表明葡萄糖氧化酶通過酰胺鍵偶聯到金納米粒子表面。

通過X射線能譜（EDS）對制備的各個電極進行了表面元素分析，結果見表1，石墨烯表面分布均勻的金納米粒子主要含有C、O和Au 3種元素；當金納米粒子修飾電極浸入到巰基乙酸溶液中反應一段時間后，其表面新增加了S元素，表明巰基乙酸通過AuS鍵修飾到AuNPs表面；偶聯葡萄糖氧化酶后，電極表面新增加了N元素，其來源只可能是葡萄糖氧化酶，說明葡萄糖氧化酶修飾到柔性電極表面。金納米粒子與PET基底上的石墨烯表面之間主要是較強的物理吸附作用，制備完成后， 即使長時間浸泡在緩沖溶液中，石墨烯表面的金納米粒子也不會脫落。

3.2 G/AuNPs/GOD電極的電化學性能

采用循環伏安法表征了G/AuNPs電極、G/AuNPs/TGA電極及G/AuNPs/GOD 3種電極的電化學性能（圖4）。這3種電極施加相同電壓時，響應電流依次減小，而氧化還原電勢差依次增大，表明在制備過程中，TGA和酶的修飾使電極表面導電性下降，電子交換速率變慢，電極表面電化學反應的不可逆性增加。這些電極在0.9和0.4 V出現氧化還原峰，是金納米粒子吸附O或者OH而產生的氧化還原吸附峰[22]。

圖5A是G/AuNPs/GOD電極對不同濃度的葡萄糖溶液的循環伏安圖。隨溶液中葡萄糖濃度增加，氧化峰電流增大，電流強度與葡萄糖濃度成正相關。由于葡萄糖不具有電化學活性，電流的增加與酶催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和過氧化氫相關。酶反應過程與通常的氧化酶類似，如式（1）與式（2）所示。

FAD以黃素腺嘌呤二核苷酸輔基氧化酶的形式存在。式（3）是電化學反應步驟，主要由葡萄糖過氧化酶中輔酶與葡萄糖反應生成過氧化氫失去電子發生氧化而產生電流[23]。

掃描速度在 5～200 mV/s范圍內變化時，隨著掃速增加，氧化還原電流逐步增大（圖5B），峰電流與掃速的平方根成正比（圖5B內插圖），說明此電極對葡萄糖的電化學氧化還原過程受擴散控制。

3.3 G/AuNPs/GOD柔性電極葡萄糖檢測

圖6A是不同濃度葡萄糖溶液的差分脈沖伏安（DPV）曲線。葡萄糖濃度較低時，濃度增加引起響應電流變化較大；葡萄糖濃度較大時，由于受溶液氧分壓的限制，其濃度的增加引起的電流增量很小。從葡萄糖溶液的計時電流曲線（圖6B）可見，最大響應時間小于10 s，說明此電極對葡萄糖有快速靈敏的響應。定量曲線如圖6B插圖所示，響應電流值隨葡萄糖濃度升高而增大， 在0.05～10.55 mmol/L范圍內呈線性關系，線性方程為I （108A） =0.2629C （mmol/L）+1.4149， 檢出限為 1 μmol/L（3σ），低于文獻[11，14]報道的采用粉末石墨烯懸浮液在玻碳電極和金電極上制備的GOD電極（表2）。

考察了G/AuNPs/GOD電極對葡萄糖響應的穩定性和重現性，對G/AuNPs/GOD電極進行了100次循環掃描結果表明，隨著循環次數的增加， 電流先降低， 隨后趨于穩定，第100次測試得到電流為首次測試電流的65%。電流的衰減可能與循環過程中產生的過氧化氫使酶活性部分喪失有關[27]。采用相同方法制備10支G/AuNPs/GOD電極測定0.2 mmol/L葡萄糖溶液，10電極電流的相對標準偏差為 4.7% （n=10），表明此方法制備的葡萄糖生物傳感器具有良好的重現性。

G/AuNPs/GOD柔性電極在 4℃ 下 pH 6.5 的緩沖溶液中放置20 天后進行測試，對 0.1 mmol/L葡萄糖溶液的響應仍保持初始響應的78%。

為了考察G/AuNPs/GOD電極的對葡萄糖測定的選擇性，測定食品中其它糖類存在時葡萄糖的響應（圖7）。結果表明，制備的酶電極僅對葡萄糖有明顯的電流響應，而對同等濃度的果糖、核糖和半乳糖幾乎均無響應，說明此電極對葡萄糖的檢測具有較好的專一性。

4 結 論

通過在PET薄膜轉移的多晶石墨烯表面組裝AuNPs和GOD，構建了G/AuNPs/GOD柔性電極。在工作電位0.6 V （vs.SCE）、pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液、室溫25℃條件下，構建的生物傳感器具有寬的線性范圍， 檢出限為1 μmol/L。此柔性電極的制備可為特定環境和可穿戴設備的葡萄糖檢測提供新的途徑和方法。

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