原發性閉角型青光眼動物模型研究進展

潘金花 趙瑛 相波 宋姍姍

·綜述·

原發性閉角型青光眼動物模型研究進展

潘金花 趙瑛 相波 宋姍姍

青光眼是一組伴有特征性視神經損害和視野缺損的視神經病變,是世界上三大致盲性眼病之一。青光眼性失明,就目前醫學治療手段而言是無法使其逆轉而恢復的。目前關于青光眼的發病機制還不清楚。但可以明確的是高眼壓是造成青光眼的危險因素。因此在青光眼研究領域中,利用動物模型來研究青光眼的發病機制或治療等已經成為必不可少的研究工具。本文主要概述了近些年來關于原發性角閉型青光眼高眼壓動物模型的研究進展。

原發性閉角型青光眼; 動物模型; 綜述

青光眼有很多種分類方法,可以根據病因學,解剖學和發病機制等分類,通常主要分為原原發性開角型青光眼(Primary Open Angle Glaucoma,POAG),原發性閉角型青光眼(Primary Angle Closure Glaucoma PACG),原發性先天性青光眼(Primary Congenital Glaucoma,PCG)等三大類。西方國家青光眼患病人數中POAG 和PCG 是最常見的類型[1],而亞洲地區主要是以開角型青光眼為主。Quigley[2]等根據世界各地以人群為基礎的流行病學研究,用聯合國2010年和2020年世界人口推算,2010年全球青光眼人數將達到6050萬,而到2020年青光眼人數將增加到7960萬。原發性閉角型青光眼主要分布于亞洲,尤其是我國最常見[3]。青光眼的發病機制目前主要有機械壓力學說和血管缺血學說,目前青光眼的發病機制尚不清楚,但是高眼壓是最主要的危險因素。因此利用動物模型來研究青光眼的發病機制及治療是一個重要的手段。目前開角型青光眼造模運用的動物有小鼠,大鼠,兔。不同種屬動物造的青光眼模型各有不同。以下分別對這幾種動物模型分別介紹。

1 小鼠動物模型

1.1小鼠眼球與人眼的相似性

研究表明,小鼠的眼睛與其他的動物眼相比人的眼相比有很多的相似之處。其中包括眼的解剖結構,房水的生成過程[4],房水的外流途徑[5],眼壓的日周期變化[6],以及對降眼壓藥物的反應[7-10]等。Smith等研究結果顯示:孕14.5天時小鼠虹膜角膜角開始形成,至生后42天才完全發育成熟。其形態生成的順序與人眼相似,不同的是人眼發育的時間比鼠眼更長,出生后8年房角結構才完全發育成熟。在結構方面,小鼠亦有成熟的睫狀體、小梁網、Sclllemm管、視網膜等。在房角的發育機制方面,小鼠亦與人類相似。Lindsey和Weinreb[11]用熒光標記的右旋糖酐證明了小鼠同時存在2種房水外流途徑,而且以葡萄膜鞏膜外流途徑為主。前列腺素類藥物能夠降低人眼眼壓,其機理是促進房水的葡萄膜鞏膜外流。由于小鼠的房角結構以及房水循環途徑與人的相似,因此這類藥物也能夠被運用來降低小鼠的眼壓,此外是人和小鼠房角結構和房水循壞的相似性為研究新型降壓藥物提供了新的研究領域。

1.2小鼠青光眼動物模型的優缺點

小鼠房角的發育以及房水循環與人眼相似,小鼠青光眼造的動物模型更加接近人眼。同時小鼠性情較溫和,體型小便于飼養和管理,對于實驗室的要求不高。實驗者在造模時操作方便,小鼠性成熟早,繁殖能力強因此可以根據實驗需求提供大量的樣本。此外小鼠價格便宜。這些因素都使得小鼠作為青光眼造模的常用動物。但是用小鼠作為青光眼動物模型的缺點是小鼠膽小,對環境的適應性低,不耐寒熱,過冷過熱均會造成死亡,不耐強光和噪聲,對疾病抵抗力差。眼球小,測量眼壓困難,篩板,視網膜中央動脈及靜脈移位到視神經下方。

1.3小鼠急性高眼壓的動物模型的造模方法

1.3.1轉基因技術

近些年來一種新型的自發性急性高眼壓轉基因小鼠CLR(calcitonin receptor-like receptor)的發現[12]為急性閉角型青光眼的動物造模提供了新的途徑。通過轉基因技術將使瞳孔括約肌上 CLR /RAMP2 AM 受體過度表達導致AM介導的瞳孔括約肌的松弛,從而導致功能缺陷,使小鼠在出生后1～3月之內,會出現眼壓急性、暫時性的升高,而對比在野生型小鼠中卻沒有出現眼壓升高的情況[12]。

1.3.2激光光凝鞏膜淺層靜脈

C.T.Fu and D.Sretavan,R.L.Gross,J.Ji,P.Chang等[13-15]研究顯示激光光凝小鼠鞏膜淺層靜脈4周內,眼內壓會升高,同時還伴有視網膜神經節細胞的損失,視網膜神經節細胞軸突的損傷。

1.4小鼠慢性高眼壓的動物模型的造模方法

1.4.1轉基因技術

K.Fujikawa,T.Iwata,K.Inoue,[16]等利用轉基因技術敲除小鼠的Vav2和Vav3,Vav2和Vav3的缺失會導致眼壓的升高,最終形成青光眼。此外Vav2和Vav3喪失會引起虹膜角膜角的改變并最終導致慢性閉角型青光眼。

1.4.2激光光凝

2003年Aihara等[17]首次用二極管激光(波長532nm,能量200mW,間隔O.OSs,光斑200wm)照射小鼠的角膜緣,出現持續的眼壓升高。他們用玻璃微管抽掉鼠眼的一部分房水使前房變淺后實施激光照射,并在前房插人玻璃微針測量術后12周內眼壓的變化情況。在實驗的22只NIH black Swiss小鼠中,15只術眼于術后1周、9只術眼于術后4周、5只術眼于術后12周眼壓升高均超過30%。組織學分析顯示激光光凝眼的房角閉合,未觀察到Schlemm管,亦未發現角膜緣有炎性細胞。結果證明,此種二極管激光光凝引起小鼠眼壓升高的方法是有效的,能在一次手術后即產生較高的成功率。然而,由于該法可能導致眼內炎癥且眼壓升高程度及持續時間變化較大,有一定的局限性。

1.4.3燒灼鞏膜淺層靜脈

Ruiz-Edrra和Verkman[18]模仿大鼠青光眼模型的制作方法,燒灼小鼠的三支鞏膜上靜脈,堵塞其房水外流途徑而達到升高眼壓的目的。由于小鼠眼球過小,該手術操作難度較大,易損傷鞏膜及眼周組織,且可能引起眼內炎癥,眼壓升高并不明顯,持續時間變異較大,因此這種技術尚待進一步研究。

2 大鼠動物模型

2.1大鼠眼球與人眼的相似性

大鼠眼與人眼相比有很多相似之處與前面所講的小鼠類似。不同的是大鼠缺乏篩板,無黃斑,85%～90%視神經軸突會交叉到對側大腦。這與人眼有差別,但在房水循環方面與人眼球近似。

2.2大鼠青光眼動物模型的優缺點

大鼠青光眼動物模型的優點是:基因組與人類有同源性;價格低,易飼養,數量多,個體小,易抓取、眼球,視神經及上丘皆可以在實驗室中觸及。其缺點即:缺乏篩板,無黃斑,85%-90%視神經軸突會交叉到對側大腦。不利于進一步研究青光眼引起的視神經病變。因此會受到制約,但總體來講以下幾種實驗模型是目前青光眼動物造模常選擇的方式。

2.3大鼠急性高眼壓的動物模型的造模方法

2.3.1眼外靜脈結扎術

Yu S等[19]研究表明眼外鞏膜靜脈結扎,術后1天會眼壓開始升高,可持續7個月的中度高眼壓。同時實驗結果還顯示高眼壓會導致視網膜神經節細胞的死亡及視神經的病變。

2.3.2前房灌注生理鹽水

前房灌注生理鹽水使眼壓升高的機制是使視網膜缺血,導致視網膜電圖(ERG)在短時間內迅速消失。羅學港等[20]選健康大鼠45只,戊巴比妥鈉腹控注射麻醉。校正二道記錄儀描筆至零位,將穿刺針水平刺入右眼前房,記下正常眼內壓曲線(共測量27例,平均壓力14,96mmHg,SD 2.72mmHg)。升壓至60mmHg持續3小時,逐漸降壓后拔出穿刺針。實驗中,隨著壓力升高,伴有角膜混濁、瞳孔擴大等高眼壓體征。高壓眼視網膜神經節細胞細胞色素氧化酶活性明顯下降。

2.4大鼠慢性高眼壓的動物模型的造模方法

2.4.1鞏膜表層靜脈注射高滲鹽水

嚙齒類動物開創慢性高眼壓模型始于1997年,Morrison[21]等通過鞏膜表層靜脈注射高滲鹽水形成慢性高眼壓模型。他們采用采用 Brown Norway 大鼠,將聚丙烯環置于眼球赤道部,暴露鞏膜表面靜脈,將微針頭朝向角膜緣并與血管壁平行插入血管腔,并立即注射50μL 1.75 mol / L的高滲鹽水,注射速度為2 500 n L / s。注射后7 ～ 10 d,小梁網壞死,房水外流途徑受阻,引發眼壓升高,并可一直持續200 d。前房角檢查顯示小梁網發生前粘連,但是 schlemm管、集合管、房水靜脈都是開放的。

2.4.2前房注射透明質酸

Benozzi J[22]等通過單次注射注射 25μL 10mg /m L 的透明質酸入大鼠前房,可使大鼠實驗眼眼壓高于對照眼兩倍,持續5d,形成急性高眼壓模型。但如果每周重復注射一次,持續注射 9w,大鼠眼壓可持續穩定升高達 10 w,形成慢性高眼壓模型。

2.4.3燒灼鞏膜淺層靜脈

燒灼鞏膜淺層靜脈來提高眼壓。最初由Shared[23]等提出,通過燒灼角鞏膜緣2～3 mm范圍內的2～3條鞏膜淺層靜脈而增加小梁網后阻力。。此方法誘導的高眼壓水平與燒灼靜脈條數大致呈正比[24]:l條時,眼壓不升高;2條時,眼壓升高至少1.5倍,維持數周;3條時,眼壓升高1.9～2.3倍,維持4～10周;4條時,則眼球明濕突出致暴露性角膜病變,并使虹膜移位、前房變深。與激光及高滲鹽水法相比,此方法技術要求略低,不涉及眼內操作,不引入外源性物質,誘導過程類似于繼發性青光眼,高眼,維持時間長且穩定,可重復性,但在實際操作中,要求手術者能識別靜脈解剖標志及其變異,且燒灼阻斷眼的靜脈引流系統,可引起視網膜的不同程度的損傷[24]。

3 兔閉角型青光眼動物模型

3.1兔眼與人眼的相似性

兔眼與人眼相似主要表現在解剖結構相似。兔眼有角膜但是角膜較人眼相比較薄、前房淺、晶狀體相對大、更凸、玻璃體容積小、白兔眼底無色素、有黃斑區無黃斑中心凹、視網膜血管分布不同、有鞘神經纖維。

3.2兔青光眼動物模型的優缺點

兔作為青光眼動物模型的優點有:兔眼眼球體積大,兔眼球解剖結構與人相似。虹膜內有色素細胞,前房淺;性情溫和,好飼養,眼球大便宜觀察。同時其繁殖能力強,能夠提供大樣本。此外它的缺點為:兔眼硬度比人眼低很多,因為其鞏膜壁很薄。所以對兔眼的處理一定要精細,研究者對眼球的一些消毒及機械損傷都很可能傷及研究所需觀察的細胞或眼內結構。兔眼的視網膜色素上皮層同神經上皮層結合比人類的緊密。分離這兩層常常要用酶消化。而人的可以機械分離。兔眼的大部分細胞都比較脆弱,不容易分離和培養,耐受性差。不像人眼細胞,還是很容易培養的。因為很少有針對兔子的抗體,選擇兔子為實驗動物,抗體很難買。

3.1兔急性高眼壓動物模型造模方法

研究表明閉角型青光眼動物模型可以通過水負荷法[25-26]來提高眼壓或氬激光光凝小梁網誘導形成急性高壓[27-28]。Liu[29]等給禁飲食24h的清醒家兔以60ml/kg蒸餾水灌胃形成高眼壓,升壓過程約為2h,最高峰出現在30～45min,平均升高約100mm Hg,4小后逐漸恢復正常。李耐三等[30]認為該方法限用于雄性家兔,其實驗采用2～3kg雄性兔,禁食12h后以30%烏拉坦作耳靜脈全麻,用37℃自來水按100m Wkg灌胃形成高眼壓。雖然這些動物模型IOP升高并形成青光眼但是這些模型仍有缺點。例如:在水負荷法模型中,它對整個眼睛都有損害以及眼內壓升高持續時間不足1小時并最終導致RGCs選擇性損失。

3.2兔慢性高眼壓動物模型造模方法

3.2.1a糜蛋白酶方法

a糜蛋白酶方法造模的具體方法是:選擇新西蘭兔體重適宜,然后用戊巴比妥麻醉,用1ml注射器在兔兔的顳側角膜緣穿孔,將濃度為2000U/ml的糜蛋白酶0.2ml經兔瞳孔注入到鼻側后房。為了加深后房,術前用匹魯卡品縮瞳。高眼壓持續的時間可穩定持續兩到三個月。該高眼壓模型的兔眼壓一般呈中度升高,一般在25～35mmHg之間。

3.2.2藥物誘導法

常用藥物誘導法有:結膜下注射倍他米松,地塞米松等皮質內固醇藥物。皮質內固醇方法誘導青光眼的原理是;皮質類固醇誘導酸性黏多糖在前房角組織內異常聚積,造成房水流出過程受阻而導致眼壓的升高。此外還有復方卡波姆法,是利用0.3%卡波姆和0.025%地塞米松混合在酸堿度為4的溶液中,注入眼前房,使房角流出的通道阻滯,誘導建立青光眼的動物模型。

3.2.3甲基纖維素法

甲基纖維素法是利用不溶的甲基纖維素形成凝膠沉積在前房,使房水無法外流,引發眼內壓升高。林桂子[31]首先選取無眼部疾病的健康兔20只,隨機分為4組(n=5),分別采用甲基纖維素M20、甲基纖維素M450、甲基纖維素MCH,在術后2h、4h、12h、24h、48h、96h、1192h和384h測定眼內壓,在3d、6d、12d和18d時對角膜混濁度、血管新生情況進行評分;第18d對試驗兔進行安樂死,摘取眼球進行病理組織學觀察。結果提示甲基纖維素MCH建立的青光眼模型眼內壓穩定,維持時間長,前房角組織結構病變符合青光眼病例的特征。

4 結語

青光眼的造模方法有許多種,各種青光眼動物模型各有各自的特點,同時也存在著許多不足。而本文主要是從高眼壓這一角度去概述了近些年閉角型青光眼的動物造模方法,閉角型青光眼常用的造模動物包括了小鼠,大鼠,兔。嚙齒類動物則以鞏膜表面靜脈注射高滲鹽水,為公認的較為理性的慢性高眼壓青光眼模型。隨著科技的進步,近幾年來基因技術的廣泛運用,利用轉基因小鼠來構造急性高眼壓青光眼模型也越來越受到關注。隨著人們對青光眼動物模型的不斷探究和完善,將會為青光眼的治療,預防帶來新的研究方法。

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Advancesofanimalmodelsofprimaryangleclosureglaucoma

PAN Jin-hua,ZHAO Ying,XIANG Bo,SONG Shan-shan

(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu,Sichuan,610075)

Glaucoma,a group of optic neuropathy with characteristic optic nerve damage and visual defect, is one of the three major blind eye diseases in the world.Glaucoma blindness can not be reversed by current medical treatments.The pathogenesis of glaucoma is not yet known.But it is clear that high intraocular pressure is a risk factor for glaucoma.Therefore,in the field of glaucoma study,the use of animal models to study the pathogenesis or treatment of glaucoma has become an essential research tool.This paper mainly summarizes the progress of the research on the model of primary Angle closed glaucoma in recent years.

Primary angle-closure glaucoma; Animal models; Reviewed

10.3969/j.issn.1674-9006.2017.03.016

R775

610075,四川成都,成都中醫藥大學

趙瑛,E-mail:sczhaoying@sina.com