放牧對冷蒿根際微生物區系及土壤酶活性的影響

張洪芹，臧曉琳，蔡宙霏，程路蕓，馬元丹，寶音陶格濤，張汝民，高 巖

（1.浙江農林大學 省 部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室,浙江 臨 安 3 11300；2.內蒙古大學 生 命科學學院,內蒙古呼和浩特010021）

放牧對冷蒿根際微生物區系及土壤酶活性的影響

張洪芹1，臧曉琳1，蔡宙霏1，程路蕓1，馬元丹1，寶音陶格濤2，張汝民1，高 巖1

（1.浙江農林大學 省 部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室,浙江 臨 安 3 11300；2.內蒙古大學 生 命科學學院,內蒙古呼和浩特010021）

為了揭示放牧對退化草原冷蒿Artemisia frigida群落阻擊草場進一步退化的機制，以小區控制放牧試驗（不放牧、輕度放牧、重度放牧）冷蒿根際與非根際土壤為對象，研究了不同程度放牧干擾對冷蒿根際土壤微生物數量、類群和酶活性的影響及其相互關系。結果表明：各放牧區土壤微生物數量均表現為細菌＞放線菌＞真菌；各處理之間冷蒿根際土壤微生物細菌、放線菌、真菌數量均顯著高于非冷蒿根際土壤（P＜0.05）。冷蒿根際土壤氨化細菌和好氧纖維素分解菌數量高于非冷蒿根際土壤；輕度放牧區冷蒿根際土壤氨化細菌和好氧纖維素分解菌數量顯著增加（P＜0.05）。冷蒿根際土壤輕度放牧后堿性磷酸酶、脫氫酶、淀粉酶、轉化酶、脲酶、硝酸還原酶活性明顯高于對照和重度放牧；各放牧區冷蒿根際土壤7種酶活性顯著高于非冷蒿根際土壤（P＜0.05）。相關分析表明，氨化細菌與堿性磷酸酶、脫氫酶、淀粉酶、轉化酶、硝酸還原酶活性存在極顯著正相關關系（P＜0.01），好氧纖維素分解菌與酶活性存在正相關（P＜0.05）。重度放牧后土壤中微生物數量減少，酶活性降低，輕度放牧使冷蒿根際土壤微生物數量和酶活性顯著增加，改善土壤微生態環境。合理放牧有助于冷蒿阻擊草原進一步退化。圖1表3參33

土壤學；放牧；冷蒿；根際微生物；土壤酶活性

放牧是草地利用的主要方式之一。過度放牧會導致草地發生不同程度的退化［1］。土壤微環境的退化伴隨著不同程度的土壤微生物數量的減少和酶活性的下降［2］。土壤微生物和酶是土壤養分轉化和循環的動力，參與有機質分解和腐殖質的形成等各個生化過程，能敏感地反映土壤中各種微環境的變化［3-5］。根際是植物根系、土壤、微生物形成的動態微域。植被的生長能有效維持土壤生態系統的動態平衡［6－7］。研究表明：根際土壤微生物數量普遍高于非根際土壤［8］。隨放牧強度的增加，土壤中纖維素酶、多酚氧化酶、脲酶、蛋白酶、堿性磷酸酶和蔗糖酶活性逐漸降低［9］；土壤微生物量碳、氮等與脲酶活性呈負相關，與蔗糖酶和堿性磷酸酶活性呈正相關［10］；目前，關于放牧對根際土壤微生物及酶活性的影響研究較少，多集中在放牧對土壤養分、土壤微生物功能及遺傳多樣性的影響等方面［11－12］。內蒙古典型草原是中國西北地區重要的生態屏障，其功能的正常發揮對維持全球及區域性生態系統平衡具有極其重要的作用。由于長期過度放牧和刈割等人類活動的強烈干擾，草原生態環境惡化，退化現象日趨嚴重［13］。冷蒿Artemisia frigida是菊科Asteraceae蒿屬Artemisia多年生草本植物，廣布于草原帶或荒漠草原帶，具有耐旱耐寒、耐踐踏、耐土壤貧瘠，生根萌蘗的再生生長能力強等特性［14－15］，特別在重度放牧時，即使經過家畜強烈啃食后，仍然能夠繼續更新繁殖使植株叢擴大，保持一定的生產力水平［16］，是過度放牧引起草原退化的指示植物，伴隨著草原退化演替的各個階段。目前，對于冷蒿繁殖特性、構件變化［17－18］，及其揮發物和浸提液對牧草的影響等已有相關報道［19］，然而關于放牧對其根際土壤微生物數量及酶活性的影響研究還鮮見報道。本研究通過小區控制放牧試驗對錫林浩特毛登牧場不同放牧強度處理下冷蒿根際土壤與非根際土壤微生物區系和酶活性進行研究，探討草原生態系統冷蒿根際土壤微生物和酶活性對放牧擾動的響應機制，為研究冷蒿阻擊草原進一步退化的機理提供土壤學方面的理論基礎和參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地區概況

研究區位于內蒙古錫林浩特市毛登牧場，其地理位置為116°28′56.8″N，44°10′02.4″E，海拔1 160 m。屬于半干旱大陸性氣候，冬季寒冷干燥，夏季在一定程度上受海洋季風氣候影響。全年平均氣溫為2.6℃，最冷月（1月）平均氣溫－22.3℃，最熱月（7月）平均氣溫18.8℃，≥0℃年積溫為2 410.0℃，≥10℃積溫為1 597.9℃，無霜期91.0 d，全年植物生長期為150 d左右。全年平均降水量為365.6mm，集中于6－9月，占年降水量的80%左右。研究區植物主要有羊草Leymus chinensis，糙隱子草Cleistogenes squarrosa，克氏針茅Stipa krylovii，大針茅S.grandis，防風Saposhnikovia divaricata，冷蒿，瓣蕊唐松草Thalictrum petaloideum，阿爾泰狗哇花Heteropappus altaicus等。土壤為栗鈣土。

1.2 試驗設計

2012年5月至2014年9月連續2 a對草場進行不同放牧強度處理，每年放牧時間為5－9月。試驗按照放牧強度不同設置3個處理，對照處理（ck）：不放牧；輕度放牧（light grazing,LG）：5月、7月每月21日放牧1 d，全年利用2次；重度放牧（heavy grazing,HG）：連續放牧，5－9月每月21日放牧1 d；受天氣因素的影響，每次放牧時間延后，分別設置重復3個·處理-1，共9個小區，各個重復小區面積為33.3m×33.3m。試驗用羊為當年生烏珠穆沁羊Caprahircus ujumqin，各放牧季節羊放牧率為6只·小區-1。

1.3 土壤樣品的采集與保存

土壤樣品采集于2014年7月冷蒿生長高峰期，采用五點取樣法，隨即選取4~5叢冷蒿，以冷蒿株叢為中心，用鐵鏟將冷蒿植株叢完整挖起（0~10 cm），用抖落法取冷蒿根際土壤，仔細去除附著的大塊土，將根系粘著的土壤抖入無菌塑料封口袋中，剔除石塊、植物根系等雜物帶回實驗室，把5個點的土壤混勻作為此樣地的土樣。設重復3個·小區－1。帶回的土樣按四分法取一部分，過2mm篩用于土壤酶活性的測定；另一部分保存在4℃條件下供土壤微生物數量和類群的測定。

1.4 測定方法

1.4.1 土壤微生物數量的測定 細菌、真菌、放線菌計數采用稀釋涂抹平板法［20］。細菌培養采用葡萄糖牛肉膏蛋白胨培養基，真菌采用馬丁孟加拉紅培養基，放線菌采用淀粉硝酸鉀培養基（高氏1號）。微生物數量以每克樣品的菌數表示。每克樣品的菌數=同一個稀釋度幾次重復的菌落平均數×5×稀釋倍數。

1.4.2 土壤微生物生理類群的測定 氨化細菌、氨氧化細菌、硝化細菌、反硝化細菌、好氧纖維素分解菌均采用特化液培養基進行培養，用最大或然數計數法（MPN）進行測定，根據試管中菌生長的情況由最大或然數計表查出近似值，計算每克土中所含的活菌數［20］。

1.4.3 土壤酶活性的測定 參照關松蔭［21］的方法測定。堿性磷酸酶用磷酸苯二鈉比色法，酶活性以酚mg·g－1·h－1干土表示；脫氫酶用三苯基四氮唑氯化物（TTC）比色法，酶活性以氫體積μL·g－1·h－1干土表示；淀粉酶用3,5-二硝基水楊酸比色法，酶活性以葡萄糖 mg·g－1·h－1干土表示；轉化酶用3,5-二硝基水楊酸比色法，酶活性以葡萄糖mg·g－1·h－1干土表示；蛋白酶用茚三酮比色法，酶活性以氨基酸μg·g－1·h－1干土表示；脲酶用苯酚鈉比色法，酶活性以NH3-N的mg·g－1·h－1干土表示；硝酸還原酶用酚二磺酸比色法，酶活性以NO3--N的mg·g－1·h－1干土表示。土壤酶活性的測定均設無基質和無土壤對照。

1.5 數據分析

所有數據均被分為2組進行統計分析：一組為冷蒿根際土壤，另一組為非冷蒿根際土壤。每一組的數據均利用Origin 8軟件（美國Origin Lab公司）進行統計分析和作圖。統計方法采用單因素方差分析進行檢驗，并進行Fisher最小顯著差法多重比較（P＜0.05）。每個變量數值表示為平均值±標準誤差。采用雙因素方差分析進行評估土壤類型×放牧相互作用的影響。相關性分析采用SPSS 19.0統計軟件的Pearson相關分析法。

2 結果分析

2.1 放牧對冷蒿根際土壤微生物數量的影響

圖1顯示：土壤類型與放牧及其交互作用對細菌、放線菌、真菌的影響均呈極顯著差異。冷蒿根際土壤細菌數量隨放牧強度增加先增加后減少，輕度放牧后細菌數量為22.78×106菌落形成單位·g－1顯著高于對照和重度放牧，分別高22.0%和37.0%；輕度、重度放牧后非冷蒿根際土壤細菌數量分別比對照降低45.7%和55.7%；各處理均表現為冷蒿根際土壤細菌數量極顯著高于非冷蒿根際土壤（圖1A）。輕度放牧和對照冷蒿根際土壤放線菌數量分別為17.74×105菌落形成單位·g－1和17.32×105菌落形成單位·g－1顯著高于重度放牧，分別高72.5%和76.7%，且極顯著高于非冷蒿根際土壤；各處理間非冷蒿根際土壤放線菌數量變化不明顯 （圖1B）。冷蒿根際土壤真菌數量隨放牧強度增加先增加后減少，輕度放牧后真菌數量為17.30×103菌落形成單位·g－1，顯著高于對照和重度放牧，分別高60.3%和29.4%；輕度放牧、重度放牧后非冷蒿根際土壤真菌數量分別比對照降低47.3%和44.2%；除對照外，輕度放牧、重度放牧冷蒿根際土壤真菌數量均極顯著高于非冷蒿根際土壤，分別高2.5倍和1.5倍（圖1C）。

2.2 放牧對冷蒿根際土壤微生物類群的影響

放牧對土壤中5種微生物生理類群數量變化的影響差異極顯著（表1）；土壤類型對硝化細菌數量變化的影響不明顯，對反硝化細菌數量變化的影響差異顯著，而對其他3種菌數量變化的影響差異極顯著；放牧和土壤類型的交互作用除對氨化細菌、反硝化細菌數量的變化無明顯影響外，對其他3種菌數量變化的影響差異極顯著。冷蒿根際土壤輕度放牧后，除反硝化細菌、好氧纖維素分解菌數量與對照差異不明顯外，氨氧化細菌、硝化細菌數量與對照相比顯著降低，分別降低56.5%和41.0%，而氨化細菌數量與對照相比顯著增加了1.1倍；重度放牧后，除氨氧化細菌數量與對照差異不顯著外，氨化細菌、反硝化細菌數量與對照相比顯著增加，分別增加69.0%和46.8%，而硝化細菌、好氧纖維素分解菌數量與對照相比顯著降低，分別降低37.5%和57.5%。非冷蒿根際土壤輕度放牧后，除反硝化細菌數量與對照相比差異不顯著外，氨化細菌、硝化細菌數量與對照相比增加顯著，分別增加1.32和1.54倍，氨氧化細菌、好氧纖維素分解菌數量與對照相比顯著降低，分別降低112.0%和64.3%；重度放牧后，除了好氧纖維素分解菌數量與對照相比顯著降低了82.0%外，其他4種菌數量與對照相比均顯著增加，分別增加101.5%，32.8%，468.1%和54.2%。

圖1 不同放牧強度下冷蒿根際土壤微生物數量的變化Figure 1 Variation ofmicroorganism of Artemisia frigida rhizosphere under grazing

2.3 放牧對冷蒿根際土壤酶活的影響

表1 不同放牧強度下冷蒿根際土壤微生物類群變化Table 1 Variation of soilmicrobial population of A.frigida rhizosphere under different grazing intensity

由表2可知：與對照相比放牧后7種酶活性的變化均表現為冷蒿根際土壤高于非冷蒿根際土壤。土壤類型及其與放牧的交互作用對土壤酶活性的影響差異極顯著；放牧除對淀粉酶、轉化酶、蛋白酶活性的影響差異顯著外，對其他4種酶活性的影響差異極顯著。冷蒿根際土壤酶活性在不同放牧強度之間有顯著差異；蛋白酶對照區較高，重牧區較低；硝酸還原酶、淀粉酶、轉化酶活性對照區較低，放牧區較高；堿性磷酸酶、脫氫酶、脲酶活性輕牧區較高（表2）。非冷蒿根際土壤酶活性在不同放牧強度之間有顯著差異；淀粉酶、蛋白酶活性均表現出對照區較高，重牧區較低；轉化酶、脲酶活性輕牧區較低；堿性磷酸酶、脫氫酶、硝酸還原酶活性放牧區較高。

表2 不同放牧強度對冷蒿根際土壤酶活性的影響Table 2 Effects of soil enzyme activities of Artemisia frigida rhizosphere under different grazing intensity

2.4 冷蒿根際微生物數量與土壤酶活性的關系

表3顯示：放牧擾動下氨化細菌與堿性磷酸酶、脫氫酶、淀粉酶、轉化酶、硝酸還原酶活性呈極顯著正相關（P＜0.01），與脲酶活性呈顯著正相關（P＜0.05）；氨氧化細菌與土壤脫氫酶、硝酸還原酶活性呈極顯著負相關（P＜0.01），與堿性磷酸酶、淀粉酶活性呈顯著負相關（P＜0.05）；反硝化細菌與蛋白酶活性呈極顯著負相關（P＜0.01），與堿性磷酸酶、淀粉酶活性呈顯著負相關（P＜0.05）；好氧纖維素分解菌與蛋白酶、脲酶呈極顯著正相關（P＜0.01），與堿性磷酸酶、淀粉酶呈顯著正相關（P＜0.05）；真菌與硝酸還原酶活性呈極顯著正相關（P＜0.01），與脫氫酶、淀粉酶活性呈顯著正相關（P＜0.05）。

3 討論與結論

表3 土壤微生物與土壤酶活性的相關性分析Table 3 Correlation analysis between soilmicrobial and soil enzyme activity

一般來說，土壤微生物是草地生態系統的重要組成部分，其活力強弱與植被類型、放牧干擾強度、土壤養分狀況等密切相關［22］。土壤中細菌、真菌、放線菌直接參與土壤碳、氮、磷等營養元素的循環和土壤礦物質的礦化過程，在土壤—植物—根際微生物組成的微生態環境中對有機物質轉化和能量流動起重要作用；土壤中細菌占三大微生物類群的主要部分，而真菌在不同環境中的數量變化較大［23］。在割草和放牧干擾下，大針茅根際土壤有機碳、全氮等養分含量和生物的數量均有不同程度的減少［24］。對內蒙古草原典型植物土壤微生物群落的研究中發現，根際土壤中的細菌、真菌數量普遍高于非根際土壤。本研究發現，不同放牧強度下細菌、真菌、放線菌數量均表現為冷蒿根際土壤顯著高于非冷蒿根際土壤，原因可能是隨放牧強度的增加改變地表植被類型、植被覆蓋度降低，冷蒿種群迅速匍匐蔓延，根系擴大，形成盤狀，大量的冷蒿根系分泌物可使根際微生物的活性增強；重度放牧后非冷蒿根際土壤細菌、放線菌數量明顯降低，可能是重度放牧后，家畜的強烈啃食及踩踏使草地生產力下降，土壤養分含量減少，土壤結構遭到破壞，從而影響土壤微生物的生存與繁殖。這與文都日樂等［25］研究結果一致。不同放牧強度下土壤微生物細菌數量最多，放線菌次之，真菌最少，可能與細菌類群組成的多樣性及冷蒿生長高峰期根系產生大量分泌物創造更為適合細菌生長繁殖的土壤環境有關。這與閆瑞瑞等［26］研究草甸草原土壤微生物數量變化結果相吻合。

氨化細菌、硝化細菌、氨氧化細菌及好氧纖維素分解菌等都是參與土壤氮素、碳素循環的有益微生物類群，在物質轉化中具有特定的功能［10］。研究表明：長期連作造成土壤微生物區系變化，根際正常的微生物群落及其結構被打破，使微生物多樣性降低，有益的微生物類群減少和不利微生物的增加，使連作植物正常的生長發育過程受到影響。化感水稻PI312777對氨化細菌、亞硝酸細菌、硝酸細菌、好氣性固氮菌、好氣性纖維素分解菌等的生長具有促進作用，而對反硫化細菌、反硝化細菌生長有抑制作用［27］。從本試驗結果來看，氨化細菌、硝化細菌及好氧纖維素分解菌在冷蒿根際土壤高于非冷蒿根際土壤，輕度放牧處理后，含量達到最高，表明冷蒿根際有利于這些菌的生長，加強了土壤的氨化作用、硝化作用和纖維素的分解，從而加速土壤氮素和碳素等營養元素的代謝、循環和利用。

土壤酶是土壤中生化反應的生物催化劑，通過土壤微生物代謝活動參與物質循環和能量流動［28］。土壤堿性磷酸酶活性在一定程度上反映土壤中磷素的豐缺度［29］，促進土壤磷素的循環，提高土壤磷素有效性，增加可以被植物利用的磷含量；土壤脫氫酶能催化有機物質脫氫，增加氧化還原能力；土壤淀粉酶、轉化酶在土壤碳循環中起著重要作用［30］，可以增加土壤中還原糖和可溶性糖；土壤脲酶、蛋白酶及硝酸還原酶參與土壤中氮素的循環［6］，其可以增加土壤中NH3、氨基酸和氨。研究發現輕度放牧土壤酶活性增加，重度放牧土壤酶活性降低［31］。輕度放牧增加蛋白酶活性，脲酶活性降低，重度放牧土壤脲酶活性增加，蛋白酶活性降低［32］。也有研究表明土壤酶活性隨放牧壓力增加而下降［11］。本研究表明：冷蒿根際土壤中的堿性磷酸酶、脫氫酶、淀粉酶、轉化酶、蛋白酶、脲酶、硝酸還原酶活性均顯著高于非冷蒿根際土壤，表明在這些酶的作用下，冷蒿根際土壤中形成了大量可以被微生物吸收、利用的營養物質，冷高根際土壤的營養物質轉化、代謝高于非冷蒿根際土壤；隨著放牧強度的增加，輕度放牧后冷蒿根際土壤除蛋白酶外，其他6種酶活性均達到最大值，標志著適當放牧處理，能增強土壤酶的活性，促進微生物分解作用，加快營養物質轉化［33］，促進微生物代謝活動參與物質循環和能量流動。

從冷蒿根際土壤微生物類群變化可知，氨化細菌含量最高，從微生物數量與土壤酶活性相關性分析可以看出，氨化細菌與6種酶活性呈顯著和極顯著正相關（除蛋白酶），表明，大量的氨化細菌作用，將土壤中的有機氮轉化為氨，為合成各種酶所需的氨基酸提供了氨，氨化細菌貢獻最大。好氧纖維素分解菌與堿性磷酸酶、脫氫酶、淀粉酶、轉化酶、蛋白酶、脲酶呈正相關、顯著和極顯著正相關，表明好氧纖維素分解菌可以加強碳素的分解，增加這7種酶作用的底物，同時能激活土壤中的這些酶活性。土壤功能微生物和酶的相互作用，促進營養物質的轉化和循環，增加了土壤的穩定性。

本研究認為：一方面放牧后冷蒿根際有益微生物活性增強，根際土壤堿性磷酸酶、淀粉酶、蔗糖酶、脲酶等活性提高，使根際微環境形成了在化學及生物特性等方面與土壤主體不同的微域，從而保證冷蒿根際土壤中碳、氮、磷等營養元素的轉化與循環。另一方面土壤微生物數量、生理類群和土壤酶活性均隨著放牧強度的增加呈現先增加后降低的趨勢，冷蒿根際土壤有益微生物數量、種類、土壤酶活性均高于非冷蒿根際，說明不同強度的放牧干擾改變了土壤環境及其養分平衡，特別是冷蒿能夠改善根際土壤微生態環境，減少放牧對其產生的干擾，使冷蒿種群能夠阻擊草原的進一步退化。

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Effects of grazing intensity on soilmicrobial flora and soil enzyme activities in the Artemisia frigida rhizosphere

ZHANG Hongqin1,ZANG Xiaolin1,CAIZhoufei1,CHENG Luyun1,MA Yuandan1, Baoyintaogetao2,ZHANG Rumin1,GAO Yan1
（1.State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China;2. College of Life Science,Inner Mongolia University,Hohhot010021,Inner Mongolia,China）

To reveal how Artemisia frigida growing in degraded grasslands resisted further degradation,the effects of grazing disturbance at varying degrees （no grazing,the control;light grazing;and heavy grazing） to microorganism quantity,physiological groups,and enzyme activities of soil microbes in the A.frigida rhizosphere,along with the interrelationships among them,were studied.Results showed that the number ofmicroorganisms in different grazing areaswas:bacteria＞actinomyces＞fungus.The counts of bacteria,actinomyces, and fungi in the A.frigida rhizosphere were significantly higher than in the non-rhizosphere （P＜0.05）.The count of ammonifying bacteria and aerobic cellulose decomposers in the rhizosphere were also significantly higher（P＜0.05）than that in non-rhizosphere;under light grazing,ammonifying bacteria and aerobic cellulose decomposers in the rhizosphere were significantly higher （P＜0.05）.Compared to the control and the heavy grazing treatment,activities of soil alkaline phosphatase,dehydrogenase amylase,invertase,urease,and nitrate reductase in the rhizosphere with the light grazing treatmentwere higher（P＜0.05）.In each grazing area,sev-en kinds of soil enzyme activities in the rhizosphere of A.frigida were significantly higher than those in the non-rhizosphere （P＜0.05）.The correlation analysis indicated a highly significant positive correlation between ammonifying bacteria and activities of soil alkaline phosphatase,dehydrogenase,amylase,invertase,and nitrate reductase （P＜0.01）;aerobic cellulose decomposers also had a positive correlation with soil enzyme activities（P＜0.05）.After heavy grazing,the number ofmicroorganisms in the soil decreased,and soil enzyme activities decreased both in the A.frigida rhizosphere and non-rhizosphere.Thus,the number of soilmicroorganisms and soil enzyme activities in the A.frigida rhizosphere increased with light grazing and improved the soil ecological environmentmeaning reasonable grazing could help the A.frigida population in degraded grasslands to further resist degradation.［Ch,1 fig.3 tab.33 ref.］

soil science;grazing;Artemisia frigida;rhizospheremicrobe;soil enzyme activity

S154

A

2095-0756（2017）04-0679-08

10.11833/j.issn.2095-0756.2017.04.014

2016-03-02；

2016-05-24

國家自然科學基金資助項目（31270756,31470704）; “十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAC07B01）；國家重點基礎研究發展計劃（“973”計劃）項目（2014CB138805）

張洪芹，從事森林生態學研究。E-mail:893097171@qq.com。通信作者：高巖，教授，博士，從事植物化學和植物發育生理學等研究。E-mail:gaoyan1960@sohu.com