基于轉(zhuǎn)錄組序列的夏蠟梅SSR位點(diǎn)特征與引物開發(fā)

黃耀輝，張 超，周莉花，趙宏波

（浙江農(nóng)林大學(xué) 風(fēng) 景園林與建筑學(xué)院，浙江 臨 安311300）

基于轉(zhuǎn)錄組序列的夏蠟梅SSR位點(diǎn)特征與引物開發(fā)

黃耀輝，張 超，周莉花，趙宏波

（浙江農(nóng)林大學(xué) 風(fēng) 景園林與建筑學(xué)院，浙江 臨 安311300）

夏蠟梅Sinocalycanthus chinensis是中國(guó)二級(jí)瀕危植物。為了開發(fā)基于夏蠟梅轉(zhuǎn)錄組序列的表達(dá)序列標(biāo)簽SSR（EST-SSRs）引物，從夏蠟梅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)組裝的125 014條unigene序列中檢測(cè)到26 564個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSRs），平均密度為5.18 kb，最豐富的類型是2堿基重復(fù)、單堿基重復(fù)和3堿基重復(fù)，分別占總SSRs的42.43%，29.50%和23.25%，其中主導(dǎo)類型是（AG/CT）n。利用L16（45）正交試驗(yàn)獲得夏蠟梅的最優(yōu)簡(jiǎn)單重復(fù)序列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（SSR-PCR）體系：20.0μL含Taq酶0.6 U（1 U=16.67 nkat），鎂離子（Mg2+）1.50mmol·L－1，三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTP）0.25mmol·L－1，引物0.20μmol·L－1，DNA 75 ng。針對(duì)所有EST-SSRs共設(shè)計(jì)出15 585對(duì)符合要求的引物，隨機(jī)選擇了220對(duì)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增，其中120對(duì)（54.55%）成功擴(kuò)增出產(chǎn)物，14對(duì)在不同種群個(gè)體中擴(kuò)增出多態(tài)，平均擴(kuò)增等位基因數(shù)為2.64，7對(duì)在同一種群個(gè)體中擴(kuò)增出多態(tài)。這些多態(tài)引物的開發(fā)可為夏蠟梅的遺傳分析提供更豐富的標(biāo)記。圖3表4參35

植物學(xué)；夏蠟梅；ESR-SSR；引物篩選；擴(kuò)增體系；正交實(shí)驗(yàn)

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）是一種由1~6個(gè)核苷酸為單位多次串聯(lián)重復(fù)組成的核苷酸序列，廣泛分布于生物基因組中［1－2］。SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有共顯性、多態(tài)性高、遺傳信息量大、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)［3－5］，已被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、基因定位、功能基因挖掘等領(lǐng)域［1,6－7］。傳統(tǒng)的基因組SSR標(biāo)記技術(shù)（genomic-SSR）需要構(gòu)建DNA文庫(kù)，耗時(shí)耗力［6,8］。表達(dá)序列標(biāo)簽SSR（expressed sequence tag SSR，EST-SSR），來源于基因的轉(zhuǎn)錄組區(qū)，相對(duì)genomic-SSR更簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)且信息量大、通用性好［6,9］。宋躍朋等［10］利用楊樹Populus對(duì)genomic-SSR和EST-SSR這2種標(biāo)記的遺傳差異做了比較研究，發(fā)現(xiàn)在鑒定基因型方面EST-SSR相對(duì)更精確。目前，基于轉(zhuǎn)錄組序列的SSR標(biāo)記在很多植物上得到應(yīng)用［11－16］。夏蠟梅Sinocalycanthus chinensis隸屬于蠟梅科Calycanthaceae夏蠟梅屬Sinocalycanthus，為第三紀(jì)孑遺植物［17］，其系統(tǒng)地位特殊，且具有較高的觀賞價(jià)值。由于自然種群規(guī)模小，生境片段化使夏蠟梅不同種群間存在不同距離的隔離［18］，種群間基因交流少，內(nèi)部近交率增加，導(dǎo)致種群內(nèi)遺傳多樣性低，種群間遺傳分化增加［19－24］。盡管已有多種標(biāo)記［同工酶［19］，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA（RAPD）［20,22,24］，ISSR［21,24］和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分子標(biāo)記（AFLP）［25］］用于夏蠟梅的遺傳多樣性和交配系統(tǒng)分析，但之前標(biāo)記均是顯性標(biāo)記，且所揭示的多態(tài)性信息普遍偏低。因此，開發(fā)共顯性的SSR標(biāo)記用于夏蠟梅的遺傳多樣性相關(guān)研究勢(shì)在必行。本研究以之前獲得的夏蠟梅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析SSR位點(diǎn)特征，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，建立最優(yōu)的SSR-PCR體系，從不同水平（種群間和種群內(nèi)）篩選高效、多態(tài)的引物。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

夏蠟梅不同野生種群材料：選擇浙江天臺(tái)的經(jīng)過坪（JGP）和搗臼孔（DJK），浙江臨安的龍?zhí)辽剑↙TS），西坑（XK），前坑（QK）和安徽績(jī)溪的龍須山（LXS）等6個(gè)野生種群，采集新鮮葉片，硅膠干燥低溫保存，隨機(jī)選取個(gè)體3個(gè)·種群－1。

同一野生種群材料：選擇經(jīng)過坪（JGP）種群，按比例估算采樣植株的間距和大小，采集24個(gè)個(gè)體葉片樣本（間隔距離視種群大小適當(dāng)調(diào)整），各年齡級(jí)采集數(shù)量大致相等，硅膠干燥低溫保存。

1.2 基因組DNA的提取

實(shí)驗(yàn)采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取基因組DNA［26］。

1.3 SSR位點(diǎn)開發(fā)與引物設(shè)計(jì)

基于夏蠟梅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)組裝的125 014條unigene序列，運(yùn)用MISA進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索［27］：重復(fù)單元長(zhǎng)度為1~6個(gè)核苷酸，最少重復(fù)次數(shù)為12，6，5，5，4，4次；SSR位點(diǎn)側(cè)翼序列的長(zhǎng)度≥150 bp。據(jù)檢測(cè)到的位點(diǎn)，用Primer 3.0引物批量設(shè)計(jì)程序設(shè)計(jì)引物［4］：引物序列中沒有SSR；序列在DNA保守序列區(qū)內(nèi)；長(zhǎng)度為15~30 bp；上下游引物不存在互補(bǔ)序列；引物自身不存在互補(bǔ)序列；引物退火溫度（Tm）為53~63℃；上下游引物的Tm值相差≤5℃；鳥嘌呤和胞嘧啶所占的比率（GC含量）為40%~ 60%。隨機(jī)挑選2~6核苷酸重復(fù)基序的引物220對(duì)（編號(hào)：XLM001~XLM220），由上海生工生物工程股份有限公司合成，用于后續(xù)SSR引物篩選。

1.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增體系的優(yōu)化

以夏蠟梅葉片DNA為模板，SSR-PCR擴(kuò)增程序參考WU等［28］：94℃預(yù)變性3 min；30個(gè)循環(huán)（94℃變性30 s，最佳Tm退火30 s，72℃1min），72℃延伸10min。

SSR-PCR擴(kuò)增采用20.0μL體系，利用五因素四水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L16（45）（表1）篩選Taq酶，鎂離子（Mg2+），DNA，dNTP和引物5種因素的濃度，建立夏蠟梅SSR-PCR擴(kuò)增體系。選擇編號(hào)XLM78和XLM91的2對(duì)引物用于優(yōu)化PCR擴(kuò)增體系。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用體積分?jǐn)?shù)為8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，160 V電壓，90min，銀染顯色。

1.5 SSR引物篩選和驗(yàn)證

利用優(yōu)化的PCR擴(kuò)增體系和6個(gè)種群（個(gè)體3個(gè)·種群－1）對(duì)合成的220對(duì)引物進(jìn)行多態(tài)性篩選［29］：根據(jù)條帶擴(kuò)增情況統(tǒng)計(jì)能夠穩(wěn)定擴(kuò)增出清晰目的條帶的引物；根據(jù)條帶遷移情況統(tǒng)計(jì)目標(biāo)范圍內(nèi)出現(xiàn)相異條帶的引物；根據(jù)條帶大小的不同分類標(biāo)記帶型 “A，B，C，D，…”，純合子條帶可記為“AA，BB，CC，DD，…”，雜合子條帶根據(jù)帶型表示為 “AB，BD，CD，BD，…”，帶型數(shù)據(jù)可用于后續(xù)遺傳多樣性等遺傳分析。

利用同一種群（JGP）的24個(gè)個(gè)體對(duì)篩選的種群間多態(tài)性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)目標(biāo)范圍內(nèi)出現(xiàn)相異條帶的引物。讀帶方法同上。

表1 夏蠟梅SSR-PCR擴(kuò)增體系（20.0μL）正交設(shè)計(jì)表L16（45）Table 1 Orthogonal experimental design of SSR-PCR technique system for Sinocalycanthus chinensis

2 結(jié)果與分析

2.1 夏蠟梅轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)的分布頻率與基序特征

從夏蠟梅125 014條unigene序列 （總覆蓋長(zhǎng)度為137.52 Mb）中檢測(cè)到22 113條序列上包含了共26 564個(gè)SSR位點(diǎn)（21.25%），平均密度為5.18 kb。其中含有2個(gè)或2個(gè)以上SSR位點(diǎn)的序列有3 664條（16.57%），復(fù)合SSRs有1 066條（4.01%）。

夏蠟梅不同重復(fù)類型的EST-SSRs分布頻率不同（表2）。最豐富的類型是二堿基重復(fù)型，占42.43%；其次是單堿基重復(fù)型和三堿基重復(fù)型，分別占了29.50%和23.25%； 四堿基重復(fù)型、五堿基重復(fù)型、六堿基重復(fù)型較少，占4.82%。從重復(fù)次數(shù)看（表2），二堿基及二堿基以上重復(fù)型中，以5~7次重復(fù)為主，其次是8~10次重復(fù)：二堿基重復(fù)型集中在6~10次；三堿基重復(fù)型、四堿基重復(fù)型集中在5~6次；五堿基重復(fù)型、六堿基重復(fù)型集中在4次。從SSR重復(fù)基元出現(xiàn)的頻率看（表3）：?jiǎn)螇A基重復(fù)型以（A/T）n形式為主，占99.07%；（C/G）n極少，僅占0.93%。二堿基重復(fù)型以（AG/CT）n形式為主，占85.33%，占SSR總數(shù)的36.21%；（CG/CG）n最少僅占本類基序比例的0.21%，占SSR總數(shù)的0.09%。堿基重復(fù)型以（AAG/CTT）n形式最多，占 40.8%，其次是（ATC/ATG）n和（AGC/CTG）n，分別占 18.26%和11.69%，（ACT/AGT）n最少，占1.12%。四堿基重復(fù)型、五堿基重復(fù)型、六堿基重復(fù)型的重復(fù)基元種類較多，占SSR總數(shù)比例較少（4.82%）。

表2 夏蠟梅EST-SSR的分布特征Table 2 Distribution of the SSRmotifs in Sinocalycanthus chinensis

表3 夏蠟梅EST-SSR主要基序類型分布Table 3 Distribution of types for EST-SSR in Sinocalycanthus chinensis

2.2 夏蠟梅SSR-PCR體系優(yōu)化結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1）顯示：5，9，10，13號(hào)組合均可擴(kuò)增出比較清晰、穩(wěn)定的帶且雜帶較少（XLM078擴(kuò)增結(jié)果），重復(fù)試驗(yàn)（XLM091擴(kuò)增結(jié)果），結(jié)果一致。

選用6個(gè)種群的18個(gè)樣本（隨機(jī)選擇樣本3個(gè)·種群－1）驗(yàn)證以上4種體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：僅9號(hào)組合可重復(fù)穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出清晰的條帶（圖2）。為此選擇9號(hào)體系作為夏蠟梅SSR-PCR最優(yōu)體系：20.0μL體系含Taq酶0.6 U（1 U=16.67 nkat），鎂離子 1.50 mmol·L－1，dNTP 0.25 mmol·L－1，引物 0.20μmol·L－1，DNA 75.0 ng。

圖1 正交實(shí)驗(yàn)SSR-PCR產(chǎn)物電泳圖譜Figure 1 Electrophoresis pattern of orthogonal test for SSR-PCR products

2.3 SSR引物篩選和驗(yàn)證

試驗(yàn)選取6個(gè)種群的18個(gè)樣本（隨機(jī)選擇樣本3個(gè)·種群－1）對(duì)隨機(jī)選擇合成的220對(duì)引物（編號(hào)：XLM001~XLM220）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明（表4）：總體而言，共120對(duì)引物擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物，有效擴(kuò)增率為54.54%，其中14對(duì)引物擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，占引物總數(shù)的6.36%。220隨機(jī)引物對(duì)應(yīng)的SSRs中，最多的為二堿基重復(fù)型、三堿基重復(fù)型，最少的為四堿基重復(fù)型。各自類型的引物中，可成功擴(kuò)增出產(chǎn)物的引物比例與總體（54.54%）相差不大，其中最高的是四堿基重復(fù)型（64.29%），最低的為三堿基重復(fù)型（48.57%）；就多態(tài)性引物所占各自類型引物總量的比例而言，二堿基重復(fù)型SSRs對(duì)應(yīng)的引物最高（7.79%），其次是四堿基重復(fù)型（7.14%），最低的為五堿基重復(fù)型（4.35%）。14對(duì)多態(tài)性引物共擴(kuò)增出37個(gè)等位基因，平均擴(kuò)增為2.64，其中五堿基重復(fù)型SSRs對(duì)應(yīng)的引物擴(kuò)增的等位基因數(shù)最高（平均為4），其次是四堿基重復(fù)型（平均為3），最低的為六堿基重復(fù)型（平均為2）。

選取經(jīng)過坪（JGP）種群24個(gè)樣本，對(duì)上述具有種群間多態(tài)性的14對(duì)引物進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：7對(duì)引物（3.18%）擴(kuò)增出多態(tài)性條帶：即XLM003，XLM007，XLM021，XLM035，XLM078，XLM139和XLM146，其中XLM007和XLM139擴(kuò)增產(chǎn)物條帶比較豐富，等位變異較多，XLM007在經(jīng)過坪（JGP）種群的個(gè)體中擴(kuò)增出4個(gè)（圖3A），XLM139擴(kuò)增出5個(gè)（圖3B）。

圖2 不同種群夏蠟梅DNA的PCR產(chǎn)物電泳圖譜Figure 2 Electrophoresis pattern of DNA PCR products in different population of Sinocalycanthus chinensis

表4 220對(duì)引物的對(duì)應(yīng)的SSR類型與擴(kuò)增情況Table 4 SSR types and amplification results of 220 primers

圖3 引物XLM007和XLM139擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜Figure 3 Electrophoresis pattern of amplification by primer XLM007 and XLM 139

3 討論

3.1 EST-SSRs分布頻率與特征

夏蠟梅轉(zhuǎn)錄組序列中的SSRs較為豐富，從125 014條unigene序列中共檢測(cè)到26 564個(gè)SSR位點(diǎn)，發(fā)生頻率為21.25%，平均5.18 kb就有1個(gè)SSR位點(diǎn)，其中含有2個(gè)或2個(gè)以上SSR位點(diǎn)的序列有3 664條（16.57%），復(fù)合SSRs有1 066條（4.01%）。就SSR位點(diǎn)發(fā)生頻率而言，夏蠟梅比蠟梅Chimonanthuspraecox（12.35%）［3］高，相較其他觀賞植物，如百合Lilium（5.98%）［31］，蝴蝶蘭Phalaenopsis（3.19%）［32］，辣椒Capsicum annuum（7.83%）［4］，南方紅豆杉Taxus chinensis var.mairei（2.24%）［5］和紅掌Anthurium andraeanum（12.70%）［16］等也是如此；就SSR位點(diǎn)平均密度而言，夏蠟梅（1/5.18 kb）與蠟梅（1/5.00 kb）［30］相差無(wú)幾，顯著高于上述幾種觀賞植物。SSRs發(fā)生頻率和平均密度除了因物種的不同而差異較大外，還可能與搜索標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)據(jù)庫(kù)的大小有關(guān)［4］。

研究表明：多數(shù)物種的EST-SSRs中以三堿基重復(fù)型出現(xiàn)的頻率較高［33］。夏蠟梅不同重復(fù)類型的EST-SSRs最豐富的類型是二堿基重復(fù)型，占42.43%，其中以（AG/CT）n形式的二堿基重復(fù)型最多，占總SSRs的36.21%，這與蠟梅［44.81%，（AG/CT）n占總SSRs的39.85%］［30］一致；三堿基重復(fù)型中都以（AAG/ CTT）n為主要的重復(fù)基元［30］，兩者四、五、六堿基重復(fù)型所占比例都相對(duì)較少；就重復(fù)次數(shù)而言，除單核苷重復(fù)外，兩者都以4~10次重復(fù)為主［30］。有所不同的是，夏蠟梅轉(zhuǎn)錄組中單堿基重復(fù)型［基本為（A/ T）n］所占數(shù)量?jī)H次于二堿基重復(fù)型，蠟梅轉(zhuǎn)錄組中三堿基重復(fù)型［比例最大的為（AAG/CTT）n］要多于單堿基重復(fù)型［30］。形成這種差異的原因除了基于植物本身的EST-SSR特點(diǎn)不同外，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源和數(shù)量也有關(guān)系［4］。

3.2 引物有效性評(píng)價(jià)

根據(jù)22 113條EST序列中檢測(cè)到的26 564個(gè)SSR-ESTs，共設(shè)計(jì)出15 585對(duì)引物。在隨機(jī)選擇220對(duì)引物中，有120對(duì)引物（54.55%）成功擴(kuò)增出產(chǎn)物，14對(duì)（6.36%）在不同種群個(gè)體中擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，平均位點(diǎn)數(shù)為2.64；7對(duì)（3.18%）在經(jīng)過坪種群內(nèi)不同個(gè)體間擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，說明夏蠟梅EST-SSR位點(diǎn)多，但多態(tài)性較低，原因是基因轉(zhuǎn)錄區(qū)的具有較高的保守性，使得EST-SSR引物具有較強(qiáng)的種屬間通用性，可以用于親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種［30,34］。胥猛等［35］基于鵝掌楸Liriodendron的6 520條EST設(shè)計(jì)了176對(duì)SSR引物，66對(duì)擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，這66對(duì)中85%在鵝掌楸中有擴(kuò)增，54%在白玉蘭Michelia alba中有擴(kuò)增。宋躍朋等［10］在比較楊樹Populus基因組SSR和EST-SSR這2種標(biāo)記的遺傳差異性中發(fā)現(xiàn)其EST-SSR多態(tài)性明顯低于基因組SSR，保守性很強(qiáng)，通用性高。夏蠟梅EST-SSR引物的種屬間通用性還有待驗(yàn)證。

夏蠟梅EST-SSR引物中有14對(duì)（6.36%）在6個(gè)種群間擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，而僅7對(duì)（3.18%）在同一種群（JGP）中有多態(tài)性條帶，可能源于其種群自然分布的特點(diǎn)：種群規(guī)模小，片段化分布，不同種群間相互隔離，基因流阻斷，種群內(nèi)部近交率增加，種群間遺傳分化增加，導(dǎo)致種群內(nèi)遺傳多樣性低，大部分遺傳多樣性來自種群間［19－24］。

本研究開發(fā)了基于夏蠟梅轉(zhuǎn)錄組的SSR標(biāo)記，為夏蠟梅種群的遺傳多樣性分析、交配系統(tǒng)估算、遺傳圖譜構(gòu)建等提供了新的途徑，同時(shí)夏蠟梅EST序列的開發(fā)為挖掘新的SSR提供了豐富的資源。

［1］ KALIA R K,RAIM K,KALIA S,et al.Microsatellitemarkers:an overview of the recent progress in plants［J］.Euphytica,2011,177（3）:309－334.

［2］ 李滿堂,張仕林,鄧鵬,等.洋蔥轉(zhuǎn)錄組SSR信息分析及其多態(tài)性研究［J］.園藝學(xué)報(bào),2015,42（6）:1103－1111.

LIMantang,ZHANG Shilin,DENG Peng,et al.Analysis on SSR information in transcriptome of onion and the polymorphism［J］.Acta Hortic Sin,2015,42（6）:1103－1111.

［3］ 呂婧,時(shí)秋香,任毅,等.黃瓜23對(duì)高多態(tài)性SSR標(biāo)記的篩選與評(píng)價(jià)［J］.園藝學(xué)報(bào),2011,38（11）:2140－2148.

LüJing,SHIQiuxiang,REN Yi,et al.Screening and evaluation of 23 high polymorphism SSR markers in cucumber［J］.Acta Hortic Sin,2011,38（11）:2140－2148.

［4］ 劉峰,王運(yùn)生,田雪亮,等.辣椒轉(zhuǎn)錄組SSR挖掘及其多態(tài)性分析［J］.園藝學(xué)報(bào),2012,39（1）:168－174.

LIU Feng,WANG Yunsheng,TIAN Xueliang,et al.SSR mining in pepper（Capsicum annuum L.）transcriptome and the polymorphism analysis［J］.Acta Hortic Sin,2012,39（1）:168－174.

［5］ 李炎林,楊星星,張家銀,等.南方紅豆杉轉(zhuǎn)錄組SSR挖掘及分子標(biāo)記的研究［J］.園藝學(xué)報(bào),2014,41（4）:735－745.

LIYanlin,YANG Xingxing,ZHANG Jiayin,et al.Studies on SSRmolecularmarkers based on transcriptome of Taxus chinensis var.mairei［J］.Acta Hortic Sin,2014,41（4）:735－745.

［6］ 陳懷瓊,隋春,魏建和.植物SSR引物開發(fā)策略簡(jiǎn)述［J］.分子植物育種,2009,7（4）:845－851.

CHEN Huaiqiong,SUIChun,WEI Jianhe.Summary of strategies for developing SSR primer［J］.Mol Plant Breed, 2009,7（4）:845－851.

［7］ 程小毛,黃曉霞.SSR標(biāo)記開發(fā)及其在植物中的應(yīng)用［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27（5）:304－307.

CHENG Xiaomao,HUANG Xiaoxia.Development and application of SSR markers in plants［J］.Chin Agric Sci Bull, 2011,27（5）:304－307.

［8］ 李齊發(fā),趙興波,羅曉林,等.牦牛基因組微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建與分析［J］.遺傳學(xué)報(bào),2004,31（5）:489－494.

LIQifa,ZHAO Xingbo,LUO Xiaolin,et al.Construction and identification on enriched microsatellite library from yak genome［J］.Acta Genet Sin,2004,31（5）:489－494.

［9］ 李小白,向林,羅潔,等.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）策略及其數(shù)據(jù)在分子標(biāo)記開發(fā)上的應(yīng)用［J］.中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)報(bào), 2013,35（5）:720－726.

LIXiaobai,XIANG Lin,LUO Jie,et al.The strategy of RNA-seq,application and development ofmolecularmarker derived from RNA-seq［J］.Chin JCell Biol,2013,35（5）:720－726.

［10］ 宋躍朋,江錫兵,張曼,等.楊樹Genomic-SSR與EST-SSR分子標(biāo)記遺傳差異性分析［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010,32（5）:1－7.

SONG Yuepeng,JIANG Xibing,ZHANG Man,et al.Genetic differences revealed by genomic-SSR and EST-SSR in poplar［J］.JBeijing For Univ,2010,32（5）:1－7.

［11］ 關(guān)媛,李效尊,潘俊松,等.黃瓜果實(shí)EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)［J］.分子植物育種,2007,5（5）:725－728.

GUAN Yuan,LIXiaozun,PAN Junsong,et al.Development of EST-SSRs in cucumber fruit［J］.Mol Plant Breed, 2007,5（5）:725－728.

［12］ LURO F L,COSTANTINO G,TEROL J,et al.Transferability of the EST-SSRs developed on Nules Clementine（Citrus clementina Hort ex Tan）to other citrus species and their effectiveness for genetic mapping［J］.BMC Genom, 2008,9（1）:287.doi:10.1186/1471-2164-9-287.

［13］ 王麗鴛,姜燕華,段云裳,等.茶樹EST-SSRs分布特征及引物開發(fā)［J］.植物遺傳資源學(xué)報(bào),2009,10（4）:511－516.

WANG Liyuan,JIANG Yanhua,DUAN Yunshang,et al.Characterization of EST-derived microsatellites and development of SSR-markers in tea（Camellia sinensis）［J］.JPlant Genet Resour,2009,10（4）:511－516.

［14］ ZENG Shaohua,XIAO Gong,GUO Juan,et al.Development of a EST dataset and characterization of EST-SSRs in a traditional Chinesemedicinal plant,Epimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim ［J］.BMCGenom,2010,11（1）: 94.doi:10.1186/1471-2164-11-94.

［15］ ZHANG Haiyang,WEILibin,MIAO Hongmei,et al.Development and validation of genic-SSR markers in Sesame by RNA-seq［J］.BMCGenom,2012,13（1）:316.doi:10.1186/1471-2164-13-316.

［16］ 郁永明,田丹青,潘曉韻,等.基于紅掌轉(zhuǎn)錄組序列的SSR標(biāo)記分析與開發(fā)［J］.分子植物育種,2015,13（6）: 1349－1354.

YU Yongming,TIAN Danqing,PAN Xiaoyun,et al.Mining and developing SSR molecularmarkers based on transcriptome sequences of Anthurium［J］.Mol Plant Breed,2015,13（6）:1349－1354.

［17］ 張若蕙,劉洪諤.世界蠟梅［M］.北京:中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社,1998.

［18］ 談探,金則新,李均敏,等.瀕危植物夏蠟梅遺傳分化研究［J］.西北林學(xué)院學(xué)報(bào),2008,23（2）:77－82.

TAN Tan,JIN Zexin,LI Junmin,et al.Genetic differentiation of Calycanthus chinensis an endangered plant［J］.J Northwest For Univ,2008,23（2）:77－82.

［19］ 周世良,葉文國(guó).夏蠟梅的遺傳多樣性及其保護(hù)［J］.生物多樣性,2002,10（1）:1－6.

ZHOU Shiliang,YEWenguo.The genetic diversity and conservation of Sinocalycanthus chinensis［J］.Biodivers Sci,2002,10（1）:1－6.

［20］ LI Junmin,JIN Zexin.High genetic differentiation revealed by RAPD analysis of narrowly endemic Sinocalycanthus chinensis Cheng et S.Y.Chang,an endangered species of China［J］.Biochem Syst Ecol,2006,34（10）:725－735.

［21］ 金則新,李鈞敏.珍稀瀕危植物夏蠟梅遺傳多樣性的ISSR分析［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2007,18（2）:247－253.

JIN Zexin,LI Junmin.ISSR analysis on genetic diversity of endangered relic shrub Sinocalycanthus chinensis［J］. Chin JAppl Ecol,2007,18（2）:247－253.

［22］ 張文標(biāo),金則新,李均敏.不同生境夏蠟梅群體遺傳多樣性的RAPD分析［J］.植物研究,2007,27（3）:313－318.

ZHANGWenbiao,JIN Zexin,LIJunmin.Genetic diversity of Sinocalycanthus chinensis in four different habitats revealed by RAPD［J］.Bull Bot Res,2007,27（3）:313－318.

［23］ LIJunmin,JIN Zexin,GU Jingjing.Genetic isolation by distance in the endangered plant Sinocalycanthus chinensis endemic to China［J］.Pak JBot,2012,44（4）:1275－1280.

［24］ 汪瓊,姚青菊,徐增萊,等.基于ISSR和RAPD標(biāo)記的4個(gè)夏蠟梅種群的遺傳多樣性研究［J］.廣西植物,2013, 33（1）:30－34.

WANG Qiong,YAO Qingju,XU Zenglai,et al.Genetic diversity of four populations of Calycanthus chinensis based on ISSR and RAPDmarkers［J］.Guihaia,2013,33（1）:30－34.

［25］ ZHAO Hongbo,ZHOU Lihua,LIU Huahong,et al.Genetic effects of differentmatingmodes in Sinocalycanthus chinensis （Cheng et S.Y.Chang）Cheng et S.Y.Chang,an endangered species endemic to Zhejiang Province,China［J］.Biochem Syst Ecol,2014,54:8－14.

［26］ 王關(guān)林,方宏筠.植物基因工程［M］.2版.北京:科學(xué)出版社,2002.

［27］ GUO Shaogui,ZHENG Yi,JOUNG JG,et al.Transcriptome sequencing and comparative analysis of cucumber flowerswith different sex types［J］.BMCGenom,2010,11（1）:384.doi:10.1186/1471-2164-11-384.

［28］ WU Jing,CAIChangfu,CHEN Fangyun,et al.Characterisation and development of EST-SSR markers in tree peony using transcriptome sequences［J］.Mol Breed,2014,34（4）:1853－1866.

［29］ 袁陽(yáng)陽(yáng),王青鋒,陳進(jìn)明.基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序信息的水生植物莕菜SSR標(biāo)記開發(fā)［J］.植物科學(xué)學(xué)報(bào),2013,31（5）:485－492.

YUAN Yangyang,WANG Qingfeng,CHEN Jinming.Development of SSR markers in aquatic plant Nymphoides peltata（Menyanthaceae）based on information from transcriptome sequencing［J］.Plant Sci J,2013,31（5）:485－492.

［30］ 李響,楊楠,趙凱歌,等.蠟梅轉(zhuǎn)錄組EST-SSR標(biāo)記開發(fā)與引物篩選［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,35（增刊1）: 25－32.

LIXiang,YANG Nan,ZHAO Kaige,et al.Development and primer selection of EST-SSR molecularmarkers based on transcriptome sequencing of Chimonanthus praecox［J］.JBeijing For Univ,2013,35（supp 1）:25－32.

［31］ 楊素麗,明軍,劉春,等.基于EST信息的百合SSR標(biāo)記的建立［J］.園藝學(xué)報(bào),2008,35（7）:1069－1074.

YANG Suli,MING Jun,LIU Chun,et al.Datamining for simple sequence repeatsmarker development in expressed sequence tags from Lilium L.［J］.Acta Hortic Sin,2008,35（7）:1069－1074.

［32］ 張水明,陳程,龔凌燕,等.蝴蝶蘭EST資源SSR標(biāo)記分析與開發(fā)［J］.園藝學(xué)報(bào),2012,39（6）:1191－1198.

ZHANG Shuiming,CHEN Cheng,GONG Lingyan,et al.Analysis of SSRs information and development of SSR markers from Phalaenopsis ESTs［J］.Acta Hortic Sin,2012,39（6）:1191－1198.

［33］ LIANG Xuanqiang,CHEN Xiaoping,HONG Yanbin,et al.Utility of EST-derived SSR in cultivated peanut（Arachis hypogaea L.）and Arachis wild species［J］.BMC Plant Biol,2009,9（2）:35－48.

［34］ TING N C,ZAKIN M,ROSLIR,et al.SSRmining in oil palm EST database:application in oil palm germplasm diversity studies［J］.JGenet,2010,89（2）:135－145.

［35］ 胥猛,李火根.鵝掌楸EST-SSR引物開發(fā)及通用性分析［J］.分子植物育種,2008,6（3）:615－618.

XU Meng,LIHuogen.Development and characterization ofmicrosatellitemarkers from expressed sequence tags for Liriodendron［J］.Mol Plant Breed,2008,6（3）:615－618.

Development and primer screening of SSRmarkers based on transcriptome sequences in Sinocalycanthus chinensis

HUANG Yaohui,ZHANG Chao,ZHOU Lihua,ZHAO Hongbo
（School of Landscape Architecture,Zhejiang A&FUniversity,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

Sinocalycanthus chinensis,a national second-class endangered species in China with high value for research and appreciation,was used to develop expressed sequence tag （EST）-simple sequence repeat（SSR）primers,which were assembled from transcriptome sequencing data.Then,the best SSR-Polymerase chain reaction PCR technique was determined and primer pairswere designed and amplified to investigate genetic diversity.Results showed 26 564 SSRs were detected from 125 014 unigene sequences.Among these unigene sequences,the average density was 5.18 kb,and themost abundant types were di-nucleotide repeats （42.43%）with （AG/CT）nrepeats occupying the largest number,mono-nucleotide repeats （29.50%）,and tri-nucleotide repeats （23.25%）.Total 15 585 primer pairs can be designed according to distribution of the EST-SSR locus. The best SSR-PCR reaction system in S.chinensis was gained by an L16（45）orthogonal experimental design, namely a 20.0μL SSR-PCR system containing 0.6 U（1 U=16.67 nkat）Taq enzyme,Mg2+1.50mmol·L－1,dNTP 0.25 mmol·L－1,primer 0.20μmol·L－1,and DNA 75 ng.Randomly 220 primer pairs were selected to amplify and 120 primer pairs （54.55%）was successful with bands.Among these primer pairs,14 pairs can amplify polymorphism among different populations （average allele number was 2.64）and seven primer pairs can amplify polymorphism within the population.These polymorphic primers could provide more abundantmarks for the genetic analysis of S.chinensis.［Ch,3 fig.4 tab.35 ref.］

botany;Sinocalycanthus chinensis;EST-SSR;primer screening;amplification system;orthogonaldesign

S718.4

A

2095-0756（2017）04-0589-08

10.11833/j.issn.2095-0756.2017.04.004

2016-03-31；

2016-07-26

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31401902，31101571）

黃耀輝，從事園林植物種質(zhì)資源研究。E-mail：huangyaohui_ok@126.com。通信作者：趙宏波，教授，博士，從事觀賞植物遺傳育種和植物繁殖生態(tài)研究。E-mail：zhaohb@zafu.edu.cn