芎芷地龍湯不同時間預防給藥對偏頭痛動物模型PKCγ、PKCεmRNA的影響*

胡 坤王永麗趙永烈，2△岳廣欣

（1.北京中醫藥大學第三附屬醫院，北京 100029；2.北京中醫藥大學東方醫院，北京 100078；3.中國中醫科學院，北京 100053）

·研究報告·

芎芷地龍湯不同時間預防給藥對偏頭痛動物模型PKCγ、PKCεmRNA的影響*

胡 坤1王永麗1趙永烈1，2△岳廣欣3

（1.北京中醫藥大學第三附屬醫院，北京 100029；2.北京中醫藥大學東方醫院，北京 100078；3.中國中醫科學院，北京 100053）

目的觀察芎芷地龍湯不同時間預給藥對偏頭痛動物模型PKCγ、PKCεmRNA表達的影響。方法將健康雄性SD大鼠36只，隨機分為生理鹽水組、模型組、舒馬普坦組、芎芷地龍湯1 d、3 d、7 d預給藥組，每組6只。按照預定給藥，造模結束后2 h取材，real-time PCR法測定三叉神經節、三叉神經脊束核丘腦、硬腦膜PKCγ、PKCεmRNA表達情況。結果與生理鹽水組比較，模型組PKCγmRNA在三叉神經節、三叉神經脊束核、硬腦膜表達水平明顯升高，在丘腦表達水平明顯降低（P<0.01），給藥干預后，三叉神經節、三叉神經脊束核、硬腦膜PKCγmRNA表達水平均降低，其中以預防給藥7 d組和舒馬普坦組降低明顯（P<0.01）；丘腦PKCγmRNA表達水平有所升高，以1 d組、3 d組、舒馬普坦組明顯（（P<0.05或P<0.01）。與生理鹽水組比較，模型組PKCεmRNA在硬腦膜、三叉神經節、三叉神經脊束核表達水平明顯升高（P<0.01），在丘腦表達水平降低（P<0.01）；給藥干預后，PKCεmRNA在三叉神經節、三叉神經脊束核表達水平降低，以預防給藥7 d組和舒馬普坦組降低明顯（P<0.01），在硬腦膜表達水平降低，以3 d組和舒馬普坦組（均P<0.01）較1 d組和7 d組（均P<0.05）明顯；PKCεmRNA在丘腦表達水平升高，各組升高水平均有統計學意義（P<0.01）。結論芎芷地龍湯預防給藥可以減少NTG誘發的三叉神經節、三叉神經脊束核PKCγmRNA、PKCεmRNA表達，而以預防給藥7 d效果好于預防給藥3 d、1 d。

偏頭痛 芎芷地龍湯 預防給藥 PKCγmRNA PKCεmRNA

偏頭痛是一種常見的神經血管性疾病，其病情特征為反復發作、一側或雙側搏動性的劇烈頭痛且多發生于偏側頭部，可合并自主神經系統功能障礙如惡心、嘔吐、畏光和畏聲等癥狀，約1/3的偏頭痛患者在發病前可出現神經系統先兆癥狀［1］。藥物治療包括頭痛發作期治療和頭痛間歇期預防性治療［2］，對患者進行預防性治療的目的是降低發作頻率、減輕發作程度、減少失能、增加急性發作期治療的療效［3］。本課題組前期研究了應用芎芷地龍湯預防給藥對偏頭痛模型痛閾及血管活性物質的影響［4］，為更深入探討相應機理，本實驗擬研究芎芷地龍湯不同時間點預防給藥后，三叉神經血管系統中三級神經元中PKCγ、PKCεmRNA表達情況。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級成年雄性SD大鼠，體質量（200±20)g；由維通利華實驗動物技術有限公司提供。動物許可證號：SCXK（京）2012-0001。

1.2 藥物與試劑

芎芷地龍湯（川芎、白芷、生石膏、地龍、延胡索）由北京中醫藥大學東方醫院制劑室提取 （每毫升含生藥2.0 g）；硝酸甘油注射液，5mg/mL，北京益民藥業有限公司生產；琥珀酸舒馬普坦片，25 mg/片，海南先聲藥業有限公司生產；DEPC（焦碳酸二乙酯），購于北京欣經科生物技術有限公司；氯仿（三氯甲烷），購于北京化工廠；異丙醇，購于無錫縣化學試劑廠；TRIZOL Reagent（Invitrogen）；High Pure RNA Tissue Kit（Roche REF12033674001）；Go Taq 2-Step RT-qPCRsystem（Promega A6010）；Go TaqqPCR Master Mix（Promega A6002）。

1.3 實驗儀器

手持電動勻漿器，KONTES；分光光度計，Nano Vue plus；三用電子恒溫水箱，SHH.W21，北京中興偉業器儀有限公司；高速低溫離心機，SIGMA 3K15；恒溫震蕩金屬浴，Bioer，MB-102；PCR儀，Bio-RAD CFX96 Real-Time System。

1.4 造模及給藥

SD大鼠隨機分為6組：生理鹽水組、模型組、舒馬普坦組、芎芷地龍湯1 d預給藥組（1 d XZDLT）、芎芷地龍湯3 d預給藥組（3 d XZDLT）、芎芷地龍湯7 d預給藥組（7 d XZDLT）。生理鹽水組：給予10mL/（kg·d）生理鹽水灌胃7 d，普通飼養，末次灌胃30min后頸背部皮下注射2mL/kg生理鹽水。模型組：給予10mL/（kg·d）生理鹽水灌胃7 d，末次灌胃30 min后頸背部皮下注射10mg/kg（5mg/mL）硝酸甘油。芎芷地龍湯組：給予10.8 g/（kg·d）芎芷地龍湯灌胃（1 d，3 d，7 d），末次灌胃30min后頸背部皮下注射10 mg/kg（5mg/mL）硝酸甘油。舒馬普坦組：給予琥珀酸舒馬普坦6 mg/（kg·d）灌胃7 d，末次灌胃30min后頸背部皮下注射10mg/kg（5mg/mL）硝酸甘油。

1.5 標本采集

于造模結束后2 h，用2%戊巴比妥鈉腹腔注射進行深度麻醉（40 mg/kg），迅速斷頭，在超凈臺內冰上取腦，分別剝離出丘腦，三叉神經節、三叉神經脊束核、硬腦膜分別放入1.5mL滅菌的離心管中，埋入液氮中迅速冷凍，-70℃冰箱保存備用。

1.6 大鼠組織總RNA的提取和含量的測定

1.6.1 總RNA的提取 按試劑盒 （High Pure RNA Tissue Kit）說明書嚴格操作：盛有標本組織的離心管中各加400μL Trizol裂解細胞，之后依次加入適量氯仿、異丙醇、75%的預冷乙醇、DEPC水，分別純化、沉淀、洗滌、溶解總RNA。微量分光光度計測定RNA的濃度和純度。根據A260的值計算RNA濃度（μg/μL），并根據A260/A280比值計算其純度，要求為1.8～2.0，比值低于1.6者棄去。

1.6.2 逆轉錄反應（RT)步驟 按試劑盒說明書嚴格操作，20μL反應體系，步驟如下：取1.5 mL離心管配制模板，加入：RNA 11μL，引物（Random Primer）1μL，加入總RNA量1.1μg；放入震蕩型恒溫金屬浴，70℃5min，迅速轉至冰上至少1min；離心使液體收集于管底，加入：5×Reaction buffer 4μL，MgCl225mM 2μL，PCR，Nucleotide Mix 10 mmol/L 1μL，RNase Inhibitor 0.5μL，GoScrpt RT 0.5μL；RNA引物混合液12μL與逆轉錄混合液8μL充分混合，放入震蕩型恒溫金屬浴，25℃5min，放入三用恒溫電子水箱，42℃1 h，放入震蕩型恒溫金屬浴，70℃15min，冷卻；立即PCR反應，放入-20℃冰箱保存。

1.6.3 PCR引物設計 根據Genebank的序列和文獻參考，設計PKCγ、PKCε、GAPDH的引物序列。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列如下：PKCγ-F：5’TGTGGAACGAGACCTTCGTG 3’，PKCγ-R：5’CCCATCCGCACTCTCTCATAC3’，擴增長度：289bp。PKCε-F：5’GAATGTTCACCGTCGATGCG 3’，PKCε-R：5’GTTCCTGGTCACAAGGGGAG 3’，擴增長度：233 bp。GAPDH-F：5’GTTACCAGGGCTGCCTTCTC 3’，GAPDHR：5’GATGGTGATGGGTTTCCCGT3’，擴增長度：177bp。1.6.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time PCR）等量的RT反應產物，分別擴增PKCγ、PKCε、GAPDH基因。5倍稀釋RT反應產物cDNA：Nuclease-FreeWa ter 40μL，cDNA原液 10μL；real-time PCR體系（20μL反應體系）：cDNA稀釋液 4μL，primer F（20 pmol/μL）0.5μL，primer R （20 pmol/μL）0.5μL，Mix 10μL，加Nuclease-Free Water至20μL；輕輕混勻，2000 r/min離心20 s后進行PCR擴增；在95℃30 s，95℃10 s，60℃30 s，15℃30 s下擴增共40個循環。反應結束后，讀取每份樣品中的相應目的基因的Ct值，減去GAPDH的Ct值，得出相對Ct值作為n值，再作1/2n運算，得到每份樣品中目的基因的相對表達量即Quantity（目的基因/GAPDH），校正后得到每份樣品中目的基因PKCγ、PKCε的相對表達量。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠三叉神經節、三叉神經脊束核、丘腦、硬腦膜的pPKCγmRNA的表達

見表1。與生理鹽水組比較，模型組pPKCγmRNA在三叉神經節、三叉神經脊束核、硬腦膜表達水平明顯升高，在丘腦表達水平明顯降低（P<0.01）。給藥干預后，三叉神經節、三叉神經脊束核、硬腦膜pPKCγmRNA表達水平均降低，其中以預防給藥7 d組和舒馬普坦組降低明顯（P<0.01）；丘腦pPKCγmRNA表達水平有所升高，以1 d組、3 d組、舒馬普坦組明顯（P< 0.05或P<0.01）。

表1 各組大鼠不同組織中pPKCγmRNA表達水平比較（±s）

表1 各組大鼠不同組織中pPKCγmRNA表達水平比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與生理鹽水組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別 n生理鹽水組 6模型組 6芎芷地龍湯1d 6三叉神經節 三叉神經脊束核 丘腦 硬腦膜1.0050±0.0357**1.2183±0.1822**2.0000±0.1300**0.7333±0.0414**2.8933±0.0602△△2.5950±0.2166△△0.9167±0.1099△△1.3467±0.0324△△2.1683±0.0774**△△1.7117±0.1551**1.5683±0.1037**△1.2550±0.0170**△△芎芷地龍湯3d 6 2.0600±0.1001**△△1.5667±0.0931**1.2583±0.1388*△△1.1467±0.0382**△△芎芷地龍湯7d 6 1.2783±0.0468**△△1.2667±0.0660**1.0567±0.0371△△0.7167±0.0251**舒馬普坦組 6 1.0667±0.0548**1.2483±0.1338**1.3300±0.0478**△△0.6933±0.0204**

2.2 各組大鼠三叉神經節、三叉神經脊束核、丘腦、硬腦膜的PKCεmRNA的表達

見表2。與生理鹽水組比較，模型組PKCεmRNA在硬腦膜、三叉神經節、三叉神經脊束核表達水平明顯升高（P<0.01），在丘腦表達水平降低（P<0.01）。給藥干預后，PKCεmRNA在三叉神經節、三叉神經脊束核表達水平降低，以預防給藥7 d組和舒馬普坦組降低明顯（P<0.01），在硬腦膜表達水平降低，以3 d組和舒馬普坦組（均P<0.01）較1 d組和7 d組明顯（均P< 0.05）；PKCεmRNA在丘腦表達水平升高，各組升高水平均有統計學意義（P<0.01）。

表2 各組大鼠不同組織中PKCεmRNA表達水平比較（±s）

表2 各組大鼠不同組織中PKCεmRNA表達水平比較（±s）

組別 n生理鹽水組 6模型組 6芎芷地龍湯1 d 6三叉神經節 三叉神經脊束核 丘腦 硬腦膜0.9800±0.0686**0.9100±0.0423**0.9233±0.0581**0.5217±0.0542**1.7100±0.0772△△1.8067±0.0406△△0.6367±0.0570△△0.7833±0.0311△△1.4700±0.1302△△1.4650±0.0784**△△1.3067±0.0789**△△0.5833±0.0656*芎芷地龍湯3 d 6 1.2817±0.1189*1.1800±0.0901**△1.1567±0.0727**△0.4233±0.0327**芎芷地龍湯7 d 6 0.9667±0.1354**1.1600±0.0398**△△0.9983±0.0633**0.6017±0.0813*舒馬普坦組 6 0.5667±0.1198**△1.0400±0.0608**0.9800±0.0635**0.5483±0.0546**

3 討 論

偏頭痛發病機制復雜，目前對三叉神經血管系統研究較多［5］。蛋白激酶C（PKC）是位于調節疼痛解剖部位的家族酶，在調節疼痛中發揮著重要的作用。PKC是一種磷脂依賴性的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，PKCγ對Ca2+和甘油二酯均依賴，屬于經典型PKC，PKCε對Ca2+不依賴而對甘油二酯依賴，屬于新型PKC［6］。其中PKCγ亞單位為腦、脊髓所獨有，在疼痛信號處理及中樞敏感化誘導和維持中起重要作用［7-9］。

在PKC家族的各亞型中，PKCε被報道主要和特定的參與痛覺敏化過程，在初級傷害感受器和機械痛覺敏化中起重要作用［10-13］。研究表明，應用PKC阻滯劑會抑制痛覺敏化和異常性疼痛［14］，同時也抑制硬腦膜PKCε和PKCγ的磷酸化表達的增加。在NO供體誘發的偏頭痛模型中，PKCγ、PKCε的表達增加，其磷酸化水平也在給予硝酸甘油或硝普鈉后大量升高［15］。

本實驗研究觀察到，注射硝酸甘油后，PKCγ（Thr514）mRNA在硬腦膜、三叉神經節和三叉神經脊束核表達水平明顯升高，與既往研究結果［9］相一致。給藥干預后PKCγmRNA在硬腦膜、三叉神經節和三叉神經脊束核表達水平降低，以預防給藥7 d組和舒馬普坦組下降明顯。注射硝酸甘油后，PKCε（Ser729）mRNA在硬腦膜、三叉神經節和三叉神經脊束核表達水平明顯升高。給藥干預后PKCεmRNA在三叉神經節和三叉神經脊束核表達水平均降低，以預防給藥7 d組和舒馬普坦組下降明顯，而在硬腦膜處以預防給藥3 d組和舒馬普坦組下降最明顯。而PKCγmRNA和PKCεmRNA在丘腦部位的表達與在硬腦膜、三叉神經節、三叉神經脊束核部位的表達不一致，這可能和丘腦所介導的痛覺感知和調控中的重要作用有關。在生理狀態下，其調控作用為“非緊張性存在”，在病理生理狀態下其對痛覺內源性下行易化和抑制作用的強弱并不是恒定、不變的［16］。因此丘腦可能在偏頭痛的痛覺傳遞過程中起著復雜的作用。本研究表明，芎芷地龍湯預防給藥可以減少硝酸甘油誘發的硬腦膜、三叉神經節、三叉神經脊束核PKCγmRNA、PKCεmRNA表達，而且預防給藥7 d的效果好于預防給藥3 d、1 d。

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E ffects of Xiongzhi Dilong Decoction Preadm inistration on PKCγand PKCεm RNA in M igraine Animal at Different Time

HU Kun，WANG Yongli，ZHAO Yonglie，et al. The Third Hospital，Beijing University ofTraditional Chinese Medicine，Beijing 100029，China.

Objective：To study the effect of Xiongzhi Dilong Decoction predministration on PKCγand PKCε mRNA in migraine animal at different time.M ethods：36 healthy male SD rats were random ly divided into six groups：saline group（n=6），migrainemodel group（n=6），sumatriptan group（n=6），1 day preadministration group（n=6），3 day preadministration group（n=6），7 day preadministration group（n=6）.The drug was administered.Tissueswere collected 2 h after successfulmodeling.The expression of PKCγand PKCεmRNA in trigeminal ganglion，spinal trigeminal nucleus，thalamus and duramater were assayed with real-time PCR method.Results：Compared with saline group，the expression of PKCγmRNA in themodel group increased significantly in trigeminal ganglion，spinal trigeminal nucleus and duramater，and decreased significantly in thalamus（P<0.01）. After drug intervention，the expression of PKCγmRNA decreased in trigeminal ganglion，spinal trigeminal nucleus and dura mater，and the preadministration of 7 days group and sumatriptan group decreased significantly（P< 0.01）.The expression of PKCγmRNA increased in thalamus，and the preadministration of 1days group（P< 0.01），3 days group（P<0.05）and sumatriptan group（P<0.01）increased significantly.Compared with saline group，the expression of PKCεmRNA in the model group increased significantly in trigeminal ganglion，spinal trigeminal nucleus and duramater（P<0.01），and decreased significantly in thalamus（P<0.01）.After drug intervention，the expression of PKCεmRNA decreased in trigeminal ganglion and spinal trigeminal nucleus，and the preadministration of 7days group and sumatriptan group decreased significantly（P<0.01）.The expression ofPKCεmRNA decreased in duramater，and the preadministration of 3days group（P<0.01）and sumatriptan group（P<0.01）decreasedmore significantly than preadministration 1days group（P<0.05）and 7 days group（P<0.05）. The expression of PKCεmRNA increased in thalamus，and the increase of all groups was statistically significant（P<0.01）.Conclusion：Preadministration of Xiongzhi Dilong Decoction can reduce the expression of PKCγmRNA and PKCεmRNA in trigeminal ganglion，spinal trigeminal nucleus and dura mater which are induced by NTG.The prevention of 7days is better than thatof 3days and 1days.

Migraine；XiongzhiDilong Decoction；Preadministration；PKCγmRNA；PKCεmRNA

R285.5

A

1004-745X（2017）07-1134-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.07.002

2017-04-07）

國家自然科學基金資助項目（81373591）

△通信作者（電子郵箱：yongy3@126.com）