膝痹消熏洗顆粒藥效學研究*

郭 亮郭劍華劉渝松李 卿馬善治王 健謝 輝

（1.重慶市中醫骨科醫院，重慶 400010；2.重慶市中藥研究院，重慶 400065）

·研究報告·

膝痹消熏洗顆粒藥效學研究*

郭 亮1郭劍華1劉渝松1李 卿2馬善治1王 健1謝 輝1

（1.重慶市中醫骨科醫院，重慶 400010；2.重慶市中藥研究院，重慶 400065）

目的觀察膝痹消熏洗顆粒的藥效學作用。方法給大鼠涂抹膝痹消熏洗顆粒，以大鼠急性抗炎鎮痛和急性血瘀為模型，觀察其藥理作用。結果膝痹消熏洗顆粒高劑量組（16.0mg生藥/cm2）對棉球肉芽腫增生程度、二甲苯所致小鼠耳腫脹以及冰醋酸所致小鼠扭體反應有明顯的抑制作用，同時對二甲苯所致小鼠皮膚毛細血管通透性增高有明顯的抑制作用，并且能明顯降低大鼠的全血黏度、血漿黏度及高切還原黏度的作用。結論膝痹消熏洗顆粒對急性炎癥有較強的抗炎鎮痛作用，同時還具有一定活血化瘀作用。

膝痹消熏洗顆粒 藥效學

膝痹消熏洗顆粒是臨床上膝痹病的外用熏洗經驗方，通過優化處方和劑型改良為外用熏洗顆粒，其功能主治為活血化瘀、通調氣血、祛風祛濕、消腫止痛，臨床用于治療膝關節骨性關節炎。本研究擬通過動物試驗，觀察膝痹消熏洗顆粒抗炎鎮痛和活血化瘀的藥理作用，為臨床用藥提供參考依據?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

KM小鼠，SPF級，雌雄各半，體質量18～22 g，中國人民解放軍第三軍醫大學實驗動物中心提供。實驗動物生產許可證號：SCXK（軍）2012-0011。動物合格證號：0020231。KM小鼠，SPF級，雌雄各半，18～22 g，由重慶市中藥研究院實驗動物研究所提供，實驗動物生產許可證號SCXK（渝）2012-0006，動物合格證號0002231。SD大鼠，SPF級，雌雄各半，體質量120～160 g，由重慶市中藥研究院實驗動物研究所提供，實驗動物生產許可證號SCXK（渝）2012-0006，動物合格證號0002221。SD大鼠，SPF級，雌雄各半，體質量200～260 g，由中國人民解放軍第三軍醫大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK（軍）2012-0011，動物合格證號0020251。

1.2 藥物與試劑

冰醋酸：重慶川東化工（集團）有限公司化學試劑廠生產，批號20150901。0.9%氯化鈉注射液：太極集團西南藥業股份有限公司生產，批號16041016。戊巴比妥鈉：SIGMA公司生產，批號908M031。注射用青霉素鈉：太極集團西南藥業股份有限公司，批號151007。二甲苯：重慶川東化工 （集團）有限公司生產，批號20131101。丙酮：重慶川東化工（集團）有限公司生產，批號20150501。依文思蘭：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司生產，批號111D0316。硫酸鈉：重慶川東化工（集團）有限公司生產，批號20150101。氯化鈉：重慶川東化工（集團）有限公司生產，批號20150501。鹽酸腎上腺素注射液：重慶迪康長江制藥有限公司生產，批號160801。HCT：濟南希森美康醫用電子有限公司生產，批號G5365。膝痹消熏洗顆粒：由重慶市中藥研究院藥化研究所提供，每毫升相當于2.4 g藥材，批號160602。雙氯芬酸二乙胺乳膠劑（扶他林）：北京諾華制藥有限公司生產，批號VP0345。EDTA一次性真空采血管：河北鑫樂醫療器械科技股份有限公司生產，批號16109002。肝素鈉一次性真空采血管：河北鑫樂醫療器械科技股份有限公司生產，批號16078802。

1.3 儀器與設備

UW-4200S電子天平：島津國際貿易有限公司生產。BSA3202S電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司生產。BS224S電子天平：北京賽多利斯儀器系統公司生產。Allegra X-12離心機：美國貝克曼庫爾特有限公司生產。FASCO-3010B全自動血液流變快測儀：重慶大學維多生物工程研究所提供。756PC型紫外可見分光光度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司生產。XT-2000i全自動動物血液分析儀：日本希森美康株式會社生產。LDZM50立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠。

2 方法與結果

2.1 膝痹消熏洗顆粒抗炎鎮痛作用［1-5］

2.1.1 各組對大鼠棉球肉芽腫增生的影響 1）實驗方法。SD大鼠50只，雌雄各半，待檢疫及適應飼養期結束后，采用隨機區組法（以體質量為主要關鍵字、隨機數字為次要關鍵字）分為5組，每組10只，即溶媒對照組（純化水）、膝痹消熏洗顆粒高、中、低劑量組（16.0、8.0、4.0 mg生藥/cm2）和陽性對照組（雙氯芬酸二乙胺乳膠劑0.5mg/cm2）。各組于給藥前1 d備皮，用6%的硫化鈉脫毛劑將動物背部脊柱兩側毛發脫去，去毛范圍約4 cm×10 cm。將各樣品均勻涂抹于整個脫毛區，在上面用二層滅菌紗布覆蓋 （溶媒對照品用滅菌紗布吸附后貼敷于脫毛區），再用膠布固定，6 h后，去除覆蓋物，用溫水去除殘留的各樣品。給藥體積為2.0mL/只，每日1次，連續7次。SD大鼠分組后腹腔注射45mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，在每只大鼠的左右蹊部用碘酊消毒，75%酒精棉球脫碘后，切1 cm切口，用眼科鑷子將20 mg的高壓滅菌棉球 （經氨芐青霉素0.2 mL浸泡、烘干），從切口處分別植入左右皮下，隨即縫合皮膚。從手術當日開始記做給藥第1天，連續給藥7 d。第8日，動物麻醉后，打開原切口，將棉球連同周圍結締組織一起取出，剔除脂肪組織后，以70℃烘干并稱質量。將稱得的質量剪去棉球原質量，即肉芽腫質量，比較各組肉芽腫質量差異。2）結果。見表1。與溶媒對照組比較，膝痹消熏洗顆粒高劑量組的肉芽腫增生程度明顯降低（P<0.01），提示膝痹消熏洗顆粒對炎性增生有明顯的抑制作用。

2.1.2 各組對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 1）實驗方法。KM小鼠50只，雌雄各半，隨機分為5組，每組10只，即溶媒對照組、膝痹消熏洗顆粒高、中、低劑量組（16.0、8.0、4.0 mg生藥/cm2）、陽性對照組（雙氯芬酸二乙胺乳膠劑0.4mg/cm2）。各組于給藥前1 d備皮，用6%的硫化鈉脫毛劑將動物背部脊柱兩側毛發脫去，去毛范圍3 cm×3 cm。將各樣品均勻涂抹于整個脫毛區，在上面用二層滅菌紗布覆蓋 （溶媒對照品用滅菌紗布吸附后貼敷于脫毛區），再用膠布固定，6 h后，去除覆蓋物，用溫水去除殘留的各樣品。給藥體積均為0.4mL/只，每日1次，連續給藥5 d。末次給藥后1 h，于小鼠右耳涂抹二甲苯0.02mL/只，20min后脫頸處死動物，打孔器打下動物左右耳，精密稱取耳片質量，計算耳腫脹度（右耳質量-左耳質量），耳腫脹抑制率=（溶媒對照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度）／溶媒對照組平均腫脹度×100%。2）結果。見表2。與溶媒對照組相比，膝痹消熏洗顆粒高、中劑量組的腫脹度明顯降低（P<0.05），提示膝痹消熏洗顆粒對二甲苯所致小鼠耳腫脹有明顯的抑制作用。

表1 各組對大鼠棉球肉芽腫增生的影響（mg，±s）

表1 各組對大鼠棉球肉芽腫增生的影響（mg，±s）

與溶媒對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組 別 劑量（mg生藥/cm2） n 肉芽腫（mg）溶媒對照組 / 10 89.62±5.86陽性對照組 0.5 10 51.74±5.60**高劑量組 16.0 10 67.85±9.47**中劑量組 8.0 10 80.70±8.54低劑量組 4.0 10 81.00±11.71

表2 各組對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

2.1.3 各組對小鼠鎮痛作用的影響（扭體法） 1）實驗方法。KM小鼠50只，雌雄各半，隨機分為5組，每組10只，即溶媒對照組、膝痹消熏洗顆粒高、中、低劑量組（16.0、8.0、4.0 mg生藥/cm2）、陽性對照組（雙氯芬酸二乙胺乳膠劑0.4mg/cm2）。各組于給藥前1 d備皮，用6%的硫化鈉脫毛劑將動物背部脊柱兩側毛發脫去，去毛范圍3 cm×3 cm。將各樣品均勻涂抹于整個脫毛區，在上面用二層滅菌紗布覆蓋（溶媒對照品用滅菌紗布吸附后貼敷于脫毛區），再用膠布固定，6 h后，去除覆蓋物，用溫水去除殘留的各樣品。給藥體積均為0.4mL/只，每日1次，連續給藥5 d。末次給藥后1 h，各組小鼠均腹腔注射0.8%冰醋酸0.2mL/只，記錄注射冰醋酸后20 min內小鼠出現扭體反應（腹部內凹，伸展后肢，臀部抬高）的次數及潛伏期，并計算扭體抑制率（%）=（對照組平均扭體次數-給藥組平均扭體次數）／對照組平均扭體次數×100%。2）結果。見表3。與溶媒對照組相比，膝痹消熏洗顆粒高、中劑量組的扭體潛伏期明顯延長，扭體次數明顯減少（P<0.05或P<0.01），提示膝痹消熏洗顆粒對冰醋酸所致小鼠扭體反應有明顯的抑制作用，鎮痛效果明顯。

表3 各組對小鼠鎮痛作用的影響（扭體法）（±s）

表3 各組對小鼠鎮痛作用的影響（扭體法）（±s）

組 別 劑量（mg生藥/cm2）n溶媒對照組 / 10陽性對照組 0.4 10高劑量組 16.0 10中劑量組 8.0 10低劑量組 4.0 10潛伏期（s）扭體次數（次）3.81±0.80 22.52±11.20 9.62±4.21**3.90±3.80**7.21±3.52**11.31±8.72*6.51±3.40**12.10±8.34*4.82±2.16 16.83±8.12抑制率（%）/ 82.71 49.82 46.20 25.32

2.2 膝痹消熏洗顆?；钛鲎饔茫?-8］

2.2.1 各組對二甲苯所致小鼠皮膚毛細血管通透性增高的影響 1）實驗方法。KM小鼠50只，雌雄各半，隨機分為5組，每組10只，即溶媒對照組、膝痹消熏洗顆粒高、中、低劑量組（16.0、8.0、4.0 mg生藥/cm2）、陽性對照組（雙氯芬酸二乙胺乳膠劑0.4 mg/cm2），各組于給藥前1 d備皮，用6%的硫化鈉脫毛劑將動物背部脊柱兩側毛發脫去，去毛范圍3 cm×3 cm，同時將小鼠腹部正中部位備皮，去毛范圍2 cm×2 cm。將各樣品均勻涂抹于整個背部脫毛區，在上面用二層滅菌紗布覆蓋（溶媒對照品用滅菌紗布吸附后貼敷于脫毛區），再用膠布固定，6 h后，去除覆蓋物，用溫水去除殘留的各樣品。給藥體積均為0.4mL/只，每日1次，連續給藥3 d。末次給藥后1 h于小鼠尾靜脈注入0.5%的伊文思藍生理鹽水溶液（0.1mL/10 g體質量 ），隨即于小鼠腹部正中去毛部位正中滴二甲苯30μL/只，20 min后小鼠脫頸椎處死，剝下腹部皮膚，翻轉后貼于盤上，根據各藍斑的顏色深淺將其分為10個級別，1個級別記1分。記好評分后，將每塊皮膚用手術剪剪碎，投入具塞玻璃試管內，倒人丙酮-硫酸鈉溶液10 mL，于暗處放置，每日輕輕搖動該試管2～3次，3 d后2000 r/min離心10 min，取上清液于590 nm處測定吸光度（OD值），以未浸泡皮膚的丙酮-硫酸鈉溶液校零，計算抑制率。抑制率=（對照組平均OD值-給藥組平均OD值）／對照組平均OD值×100%。2）結果。見表4。與溶媒對照組比較，膝痹消熏洗顆粒各劑量組的皮膚藍斑色澤深淺評分 （級）和吸光度值均有明顯下降（P< 0.01），提示膝痹消熏洗顆粒對二甲苯所致小鼠皮膚毛細血管通透性有明顯的抑制作用。

表4 各組二甲苯致小鼠皮膚毛細血管通透性的影響（±s）

表4 各組二甲苯致小鼠皮膚毛細血管通透性的影響（±s）

組 別 劑量（mg生藥/cm2）n溶媒對照組 / 10陽性對照組 0.4 10高劑量組 16.0 10中劑量組 8.0 10低劑量組 4.0 10藍斑色澤（級） OD值9.32±0.80 0.579±0.039 2.51±1.04**0.286±0.053**2.91±1.23**0.304±0.049**4.86±0.61**0.414±0.041**6.73±0.80**0.470±0.045**抑制率（%）/ 73.12 68.84 48.40 28.00

表5 各組對急性血瘀模型大鼠血液流變學的影響（±s）

表5 各組對急性血瘀模型大鼠血液流變學的影響（±s）

高切（200/s） 中切（30/s） 低切（3/s）溶媒對照組 / 10 4.97±0.61**6.29±0.74**12.54±1.07**0.77±0.09**0.40±0.02 11.81±1.71**14.96±2.05**29.69±4.14**14.87±1.66**?組別 劑量（mg生藥/cm2） n全血黏度 血漿黏度（mpas·s）紅細胞壓積（L/L）高切還原黏度中切還原黏度低切還原黏度紅細胞剛性指數模型組 / 10 8.04±1.47 9.58±1.62 15.57±1.57 1.34±1.19 0.39±0.02 17.95±3.43陽性對照組 0.5 10 5.21±0.60**6.37±0.73**12.24±0.99**0.98±0.30 0.38±0.02 11.03±1.51**21.89±3.79 37.23±3.92 19.91±4.07 14.07±1.82**29.51±2.60**11.86±2.68**高劑量組 16.0 10 6.24±0.78**7.78±1.05*13.93±1.45*1.32±0.26*0.39±0.02 14.37±2.14*18.49±3.80 33.80±4.07 17.54±3.36中劑量組 8.0 10 7.77±0.64*9.03±0.84 15.37±1.21 1.18±0.20*0.38±0.01 17.54±3.15 21.50±3.77 37.19±2.96 19.66±3.23低劑量組 4.0 10 7.96±0.56 9.52±0.56 15.51±0.91 1.25±0.19 0.39±0.02 18.04±2.56 21.84±3.26 37.35±2.69 19.80±3.10

2.2.2 各組對急性血瘀模型大鼠血液流變學的影響1）實驗方法。SD大鼠60只，雌雄各半，待檢疫及適應飼養期結束后，隨機分為6組，每組10只，即溶媒對照組、模型組、膝痹消熏洗顆粒高、中、低劑量組（16.0、8.0、4.0mg生藥/cm2）和陽性對照組（雙氯芬酸二乙胺乳膠劑0.5mg/cm2）。各組于給藥前1 d備皮，用6%的硫化鈉脫毛劑將動物背部脊柱兩側毛發脫去，去毛范圍約為4 cm×10 cm。將各樣品均勻涂抹于整個脫毛區，在上面用2層滅菌紗布覆蓋 （溶媒對照品用滅菌紗布吸附后貼敷于脫毛區），再用膠布固定，6 h后，去除覆蓋物，用溫水去除殘留的各樣品。給藥體積為2.0mL/只，每日1次，連續7次。末次給藥后1 h，除溶媒對照組外，其余各組均按0.08mL/100 g體質量皮下注射0.1%的鹽酸腎上腺素注射液，2 h后將動物置于4℃冰水中浸泡5 min，于首次注射后4 h再次給予同等劑量相同途徑的鹽酸腎上腺素注射液，禁食不禁水18 h。次日取血測定紅細胞壓積（HCT），再分別用1%肝素抗凝的試管采血，肝素抗凝血測定全血黏度，再將血離心，測定血漿黏度。2）結果。見表5。與溶媒對照組比較，模型組大鼠全血黏度，血漿黏度，高、中、低切還原黏度和紅細胞剛性指數均明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，膝痹消熏洗顆粒高劑量組能明顯降低大鼠的全血黏度、血漿黏度及高切還原黏度（P<0.05）；中劑量組亦明顯降低大鼠的全血黏度（高切）和血漿黏度（P< 0.05）。提示痛膝痹消熏洗對大鼠急性血瘀模型有一定的活血化瘀作用。

3 討 論

膝痹消熏洗顆粒是郭劍華主任中醫師所創的經驗熏洗方，其功能主治為活血化瘀、通調氣血、祛風祛濕、消腫止痛，臨床用于膝關節骨性關節炎的治療［9-11］。本文主要從以下兩個方面對膝痹消熏洗顆粒進行藥效學評價。

3.1 抗炎鎮痛作用

膝痹消熏洗顆粒高劑量組對大鼠棉球肉芽腫的增生程度明顯降低，對二甲苯所致小鼠耳腫脹的腫脹度明顯降低，對冰醋酸所致小鼠扭體反應的扭體潛伏期有明顯延長作用，并能明顯減少扭體次數；中劑量組亦明顯降低對二甲苯所致小鼠耳腫脹的腫脹度［12-13］，并且能明顯延長對冰醋酸所致小鼠扭體反應的扭體潛伏期和減少扭體次數的作用。提示膝痹消熏洗顆粒有明顯的抗炎鎮痛作用。

3.2 活血化瘀作用

膝痹消熏洗顆粒高、中、低劑量組對二甲苯所致小鼠皮膚毛細血管通透性增高的皮膚藍斑色澤深淺評分（級）和吸光度值均有明顯降低作用［14］；膝痹消熏洗顆粒高劑量組能明顯降低大鼠全血黏度、血漿黏度及高切還原黏度，中劑量組亦對大鼠的全血黏度（高切）和血漿黏度有明顯降低作用［15］。提示膝痹消熏洗顆粒一定的活血化瘀作用。

上述藥效學研究結果表明，膝痹消熏洗顆粒對急性炎癥有較強的抗炎鎮痛作用，同時還具有一定活血化瘀作用，為膝痹消熏洗顆粒臨床應用提供了一定的藥理學依據。

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Pharmacodynam ics of Xibixiao Smoked and Washed Granule

GUO Liang，GUO Jianhua，LIU Yusong，etal.Chongqing Osteology and Traumatology Hospital of TCM，Chongqing 400010，China.

Objective：To observe the pharmacodynamic action of Xibixiao smoked and washed granule.M ethods：The rats were treated with Xibixiao smoked and washed granule，and the acute anti-inflammatory，analgesic and acute blood stasismodels of rats were used as the model to observe their pharmacological effects.Results：Xibixiao smoked and washed granule 16.0 mg crude drug/cm had an obvious inhibitory effect on the proliferation degree of cotton pellet granuloma，mouse ear edema induced by dimethylbenzene，writhing reaction induced by acetic acid in mice and increased capillary permeability induced by dimethylbenzene in mouse skin.Besides，it could significantly reduce the blood viscosity，plasma viscosity and high-shear reduction viscosity.Conclusion：Xibixiao smoked and washed granule has a strong anti-inflammatory and analgesic effect on acute inflammation，and also has the effectof promoting blood circulation and removing blood stasis.

Xibixiao smoked and washed granule；Pharmacodynamics

R285.5

A

1004-745X（2017）07-1156-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.07.008

2017-04-14）

重慶市衛生和計生委課題（ZY20150228）