白芍總苷對全腦缺血再灌注損傷保護作用的研究*

史晴晴杜 歡于紅梅黃 寧郭洋洋

（1.河北省廊坊市第四人民醫院，河北 廊坊 065700；2.河南省三門峽市中心醫院，河南 三門峽 472000）

·研究報告·

白芍總苷對全腦缺血再灌注損傷保護作用的研究*

史晴晴1△杜 歡2于紅梅1黃 寧1郭洋洋1

（1.河北省廊坊市第四人民醫院，河北 廊坊 065700；2.河南省三門峽市中心醫院，河南 三門峽 472000）

目的觀察白芍總苷對全腦缺血再灌注損傷的保護作用并初探其機制。方法采用四血管夾閉20min的方法制備大鼠全腦缺血再灌注模型，白芍總苷（50、100、200mg/kg）術前30min灌胃給藥。再灌注6 h后，記錄各組大鼠翻正反射恢復時間和腦電恢復時間，檢測腦組織含水量，HE染色法觀察大腦海馬CA1區神經元形態結構變化，TUNEL法觀察海馬CA1區神經元凋亡狀況；測定海馬組織中炎癥細胞因子含量，抗氧化酶活性和丙二醛（MDA）含量。結果中、高劑量白芍總苷能夠顯著降低全腦缺血再灌注大鼠翻正反射和腦電恢復時間并降低腦組織含水量（P<0.05或P<0.01），明顯改善海馬CA1區神經元病理性改變和凋亡狀況，顯著降低凋亡指數（P<0.01），顯著降低炎癥細胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）含量（P<0.05或P<0.01），顯著改善抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）活性并降低MDA含量（P<0.05或P<0.01）。結論白芍總苷對全腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，可能與其保護海馬CA1區神經元、抑制氧化應激和炎癥反應有關。

白芍總苷 全腦缺血再灌注 細胞凋亡 炎癥 氧化應激

局灶性腦缺血和全腦缺血是缺血性腦血管病的兩種類型，前者多由腦血管栓塞所致，而全腦缺血多與心臟驟停、休克、窒息、外科手術所致低壓低氧等有關［1-2］。及時恢復血流供應是挽救腦缺血患者的關鍵，緊急藥物溶栓和介入手術是臨床上的常用技術手段，但血液灌流恢復后往往出現腦缺血損傷進一步加重的現象，即腦缺血再灌注損傷，病理生理學研究發現炎癥反應和氧化應激損傷是導致神經元繼發性死亡的主要原因［3-4］，因此以抑制炎癥反應和氧化應激損傷為切入點，研發有效抑制再灌注損傷的新型藥物或許是改善腦缺血疾病治療效果的有效途徑。白芍總苷為傳統中藥白芍的主要活性成分之一，具有抑制自身免疫、抗炎、抗氧化等多種活性［5］，但白芍總苷對全腦缺血再灌注損傷是否具有保護作用的研究報道尚不多見。本實驗擬通過制備全腦缺血再灌注大鼠模型并給予白芍總苷進行干預治療，研究白芍總苷對全腦缺血再灌注損傷的影響并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級SD大鼠 （雌雄不限）100只，體質量200～240 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（冀）2013-1-003。

1.2 試藥與儀器

白芍總苷膠囊（寧波立華制藥有限公司）。TUNEL試劑盒 （北京博奧森生物技術有限公司）；白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（美國CST公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶 （CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）試劑盒（安徽欣樂生物技術有限公司）。

1.3 分組與給藥

將大鼠隨機分為假手術組、模型對照組和白芍總苷低、中、高劑量（50、100、200 mg/kg）組，每組20只。術前30 min，白芍總苷各劑量組分別灌胃給藥，假手術組和模型對照組大鼠均給予等體積0.9%氯化鈉注射液。精確稱量適量白芍總苷加入適量0.9%氯化鈉注射液制備濃度為40mg/mL的白芍總苷溶液，并依次稀釋制備濃度為20mg/mL、10mg/mL的白芍總苷溶液；各組給藥劑量為5mL/kg。

1.4 模型制備

腹腔注射10%水合氯醛（3.0mL/kg）麻醉后，參照PulsinelliWA等［6］報道的四動脈夾閉的方法制備全腦缺血大鼠模型，以腦電圖波幅下降到原來的1/4以下，翻正反射消失，瞳孔顏色變得灰白為全腦缺血成功標志，缺血20 min后恢復血流灌注；假手術組行手術通路，但不做夾閉血管處理。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 記錄翻正反射和腦電恢復時間 觀察并記錄翻正反射恢復時間；通過生物機能實驗系統 （BL-420E型，成都泰盟科技有限公司）監測腦電振幅，達到正常振幅的75%即可認定為腦電恢復，記錄所需的時間。

1.5.2 腦含水量的測定 每組隨機取6只大鼠，麻醉后斷頭取腦，去除小腦和低位腦干后稱大腦組織質量，即濕質量 （W）；110℃恒溫烘烤48 h后稱重為干質量（D）：腦含水量（%）=［（W-D）/W］×100%。

1.5.3 大腦海馬CA1區神經元形態及凋亡狀況的觀察 每組隨機取6只大鼠，參照1.5.2的方法取大腦組織，于4%多聚甲醛溶液中固定72 h，然后行石蠟包埋、切片、展片和脫蠟水化處理，行常規HE染色后通過倒置光學顯微鏡觀察大腦海馬CA1區神經元形態；行TUNEL染色觀察海馬CA1區神經元凋亡狀況，每張圖片隨機選取互不重疊的5個視野并分別計數細胞總數和凋亡細胞數，然后計算凋亡指數（AI），AI（%）=（凋亡細胞數/細胞總數）×100%。

1.5.4 炎癥細胞因子含量、抗氧化酶活性和MDA含量的測定 每組取剩余的8只大鼠，參照1.5.2的方法取大腦并剝取海馬組織，加入適量冷裂解液行研磨勻漿，離心（3000 r/min，10 min）取上清液，按ELISA試劑盒步驟處理后通過酶標儀測定海馬組織勻漿液中炎癥細胞因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）含量；分別按照試劑盒方法步驟處理后通過紫外-可見分光光度計測定SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠翻正反射和腦電恢復時間的影響

見表1。模型對照組大鼠翻正反射和腦電均基本恢復需35min；經中高劑量白芍總苷干預治療能夠顯著降低全腦缺血再灌注大鼠翻正反射和腦電恢復時間，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。模型對照組含水量較假手術組顯著升高（P<0.01）；經中、高劑量白芍總苷干預治療能夠顯著降低全腦缺血再灌注大鼠腦組織含水量（P<0.05或P<0.01）。

表1 各組大鼠翻正反射和腦電恢復時間、腦含水量結果比較（±s）

表1 各組大鼠翻正反射和腦電恢復時間、腦含水量結果比較（±s）

與假手術組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

翻正反射恢復時間（min）腦電恢復時間（min）0.0±0.0 0.0±0.0 27.13±7.58**25.11±7.28**25.27±8.18 22.34±7.49白芍總苷中劑量組 20 78.64±0.79△腦含水量（%）假手術組 20 76.81±0.48模型對照組 20 79.87±0.81**白芍總苷低劑量組 20 79.09±1.13組別 n 21.93±7.52△18.02±6.57△△白芍總苷高劑量組 20 18.64±5.93△△15.67±5.28△△78.02±0.41△△

2.2 各組大鼠大腦海馬CA1區神經元形態的影響

見圖1。假手術組海馬CA1區神經元未見異常：層次清晰（3～5層），排列整齊，形態完整，胞質染色均勻，核膜、核仁清晰。模型對照組海馬CA1區神經元形態結構呈現明顯異常：層次紊亂，神經元數量減少、排列稀疏、間隙增大，胞體腫脹變形，部分神經元胞核固縮或溶解，核仁消失等。與模型對照組比較，白芍總苷各劑量干預治療組海馬CA1區神經元病變呈不同程度減輕，該藥理學作用呈現一定的劑量依賴性，以白芍總苷高劑量組效果最為顯著。

圖1 各組大鼠大腦海馬CA1區神經元形態（HE染色，400倍）

2.3 各組大鼠大腦海馬CA1區神經元凋亡的影響

見圖2。假手術組大鼠大腦海馬CA1區僅見少量凋亡細胞（TUNEL染色陽性著色：細胞核黃褐色）；模型對照組海馬CA1區神經元凋亡細胞數較假手術組明顯增多；與模型對照組比較，白芍總苷各劑量干預組海馬CA1區凋亡細胞數呈不同程度減少，以白芍總苷高劑量組最為顯著。計算并比較各組大鼠大腦海馬CA1區神經元凋亡指數（AI）：假手術組AI為（2.7±1.1）%，模型對照組AI為（64.9±8.6）%，白芍總苷低、中、高劑量組AI分別為 （59.3±10.4）%、（41.1±6.8）%、（15.6± 3.5）%；模型對照組AI較假手術組顯著升高（P<0.01），經中高劑量白芍總苷干預治療能夠顯著降低全腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區神經元AI（P<0.01）。

圖2 各組大鼠大腦海馬CA1區神經元凋亡狀況（TUNEL染色，400倍）

2.4 各組大鼠腦組織炎癥細胞因子含量的影響 見表2。模型對照組炎癥細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）含量顯著升高（P<0.01）；經中高劑量白芍總苷干預治療能夠顯著降低全腦缺血再灌注大鼠炎癥細胞因子含量（P<0.05或P<0.01）。

表2 各組大鼠腦組織炎癥細胞因子含量比較（nmol/L，±s）

表2 各組大鼠腦組織炎癥細胞因子含量比較（nmol/L，±s）

組別 n TNF-α假手術組 8 24.83±4.94模型對照組 8 56.18±7.09**白芍總苷低劑量組 8 50.63±6.41 IL-1β IL-6 512.78±36.69 101.48±14.17 928.13±94.03**216.27±25.69**873.47±91.72 192.79±28.64白芍總苷中劑量組 8 44.08±6.68△716.38±70.76△171.36±23.47△白芍總苷高劑量組 8 684.18±69.22△△135.17±17.80△△37.47±5.88△△

2.5 各組大鼠腦組織抗氧化酶活性和MDA含量的影響

見表3。模型對照組抗氧化酶活性較假手術組顯著降低且MDA含量顯著升高（P<0.01）；經中高劑量白芍總苷干預治療能夠顯著提高抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）活性并明顯降低MDA含量（P<0.05或P<0.01）。

表3 各組大鼠腦組織抗氧化酶活性和MDA含量比較（±s）

表3 各組大鼠腦組織抗氧化酶活性和MDA含量比較（±s）

組別 n假手術組 8模型對照組 8白芍總苷低劑量組 8 SOD（U/mg）CAT（U/mg）173.27±8.86 5.10±1.42 139.15±8.22**2.71±1.04**144.02±8.60 3.04±1.17白芍總苷中劑量組 8 148.57±9.02△3.54±1.54△白芍總苷高劑量組 8 156.68±9.32△△4.01±1.68△△GSH-Px（U/mg）MDA（μmol/g）20.41±4.08 16.76±3.49 9.79±2.73**30.73±4.28**11.28±3.47 26.41±4.08 12.58±3.21△19.77±3.86△15.11±3.96△△17.46±3.17△△

3 討 論

芍藥分為赤芍和白芍，均來源于毛茛科芍藥屬植物的干燥根［7-8］，二者功能主治與臨床應用具有一定的差異［9］。但既往王飛等［10］和徐紅梅等［11］研究發現，赤芍和白芍均能通過提高體內一氧化氮（NO）并降低內皮素（ET）含量而對血瘀大鼠血液流變學異常具有良好的改善作用，楊煜等［12］發現白芍總苷縮短大鼠體外血栓長度，改善血瘀大鼠血液黏度的藥理學作用與赤芍總苷類似，并且白芍對血小板聚集功能的作用優于赤芍［13］。白芍總苷為白芍的主要活性成分，具有多種生物學活性，但白芍總苷對全腦缺血再灌注損傷是否具有保護作用及其可能的作用機制尚未見文獻報道。本實驗參照的PulsinelliWA等［6］報道的四動脈夾閉法是目前國際公認的全腦缺血動物模型制備方法之一［14］，該方法制備的動物模型病理與人腦急性缺血性病變接近，且重復性強、成功率高。腦組織是對缺血缺氧最為敏感的器官，阻斷血流后幾分鐘即可出現無氧酵解而大量生成乳酸，導致酸中毒，其中海馬是對腦缺血最敏感的區域之一，而海馬CAl區的錐體細胞層最為敏感［15］，所以本研究選擇大腦海馬CA1區為觀測區域。炎癥細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）是臨床上監測炎癥反應的常用指標。正常生理狀態下，體內生產的氧自由基（ROS）在SOD和CAT、GSH-Px的催化作用下最終被還原為對人體無害的H2O和O2［16-17］；不飽和脂肪酸是細胞膜的主要組成之一，極易被ROS攻擊而氧化最終生成MDA，因此MDA的含量水平能夠間接反應機體氧化應激損傷程度［18］。

本研究結果顯示，中高劑量白芍總苷干預治療能夠顯著降低全腦缺血再灌注大鼠翻正反射恢復時間和腦電恢復恢復時間、降低腦組織含水量、抑制海馬CA1區神經元病變并抑制其凋亡；降低海馬組織炎癥細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）含量，改善抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）活性并降低MDA含量；提示白芍總苷對全腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，其作用機制可能與白芍總苷保護海馬CA1區神經元、抑制氧化應激和炎癥反應有關。

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Protective Effect of Total G lucosides of Paeony on Global Cerebral Ischem ia-reperfusion Injury

SHIQingqing，DU Huan，YU Hongmei，et al. The Fourth People's Hospital of Langfang，Hebei，Langfang 065700，China.

Objective：To study the protective effect of total glucosides of paeony on cerebral ischemia reperfusion injury in rats and explore itsmechanism.Methods：A ratmodel of global cerebral ischemia reperfusion was prepared by clamping four vesselswith 20min.Total glucosides of paeony（50，100，200mg/kg）were administered by intragastric administration 30 min before operation.Six hours after of reperfusion，the recovery time of righting reflex and the recovery time of EEG were recorded，and the water content of brain tissue wasmeasured.HE stainingmethod was used to observe themorphological changes of neurons in CA1 region of hippocampus.The apoptosis of hippocampal CA1 neurons was observed by TUNEL，and the content of inflammatory cytokines，the activity of antioxidant enzymes and the content of malondialdehyde（MDA）in hippocampus were measured.Results：100，200 mg/kg total glucosides of paeony can significantly reduce the righting reflex and the recovery time of brain electricity and reduce the water content of brain tissue in rats with global cerebral ischemia and reperfusion（P<0.05 or P<0.01）；it could obviously improve the pathological changes and apoptosis of neurons in CA1 region of hippocampus，and significantly reduce the apoptotic index（AI）（P<0.01）；it significantly reduced the levels of inflammatory cytokines（IL-1β、IL-6、TNF-α）（P<0.05 or P<0.01）；it significantly improved antioxidant enzymes（SOD，CAT，GSH-Px）activity and decreased MDA content（P<0.05 or P<0.01）.Conclusion：Total glucosides of paeony have a protective effect on global cerebral ischemia reperfusion injury，whichmay be related to the protection of neurons in the hippocampal CA1 region and the inhibition of oxidative stress and inflammatory response.

The total glucosides of paeony；Global cerebral ischemic-reperfusion；Apoptosis；Inflammation；Oxidative stress

R285.5

A

1004-745X（2017）07-1172-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.07.012

2017-04-27）

河北省廊坊市科技支撐計劃項目（2016013151）

△通信作者（電子郵箱：lfsysqq@163.com）