昆蟲桿狀病毒egt基因研究進展

王海萍，吳小鋒

（浙江大學 動物科學學院，浙江 杭州 310058）

昆蟲桿狀病毒egt基因研究進展

王海萍，吳小鋒＊

（浙江大學 動物科學學院，浙江 杭州 310058）

桿狀病毒是一類大分子的雙鏈環狀DNA病毒，其編碼的蛻皮甾體尿苷二磷酸葡萄糖基轉移酶基因（egt）在感染昆蟲后表達產生EGT酶。EGT酶的催化使宿主體內的蛻皮激素失活，阻止幼蟲蛻皮，從而利于病毒自身的繁殖。已有研究發現，敲除egt基因的桿狀病毒感染的昆蟲，死亡時間縮短，向上攀爬行為減弱。最近的研究還表明轉egt基因的家蠶蠶蛹發育遲緩。從分子水平對EGT酶作用機制及其與宿主蛋白互作關系進行探索，將加深我們對桿狀病毒調控宿主生長發育和行為變化策略的認識，有利于農業生產應用（特別是蠶絲業，如鮮繭繅絲），且為新型高效生物殺蟲劑的研發提供新思路。

桿狀病毒；egt基因；宿主昆蟲；生長發育；行為

1引言

桿狀病毒是一類具有雙鏈、環狀、超螺旋基因組的病毒，被包裹在桿狀核衣殼中，也是已知昆蟲病毒中的最大類群，宿主域僅限于無脊椎動物，特別是鱗翅目昆蟲。桿狀病毒分為α、β、γ和δ四個屬，其中根據病毒表面囊膜蛋白GP64或F蛋白的差異，進一步將α屬分為GroupⅠ和GroupⅡ兩個不同的類別。桿狀病毒的復制周期十分復雜，產生兩種類型的病毒粒子：一種是包涵體衍生型病毒粒子（oc?clusion-derived virus，ODV），保證病毒在昆蟲宿主體外的穩定及對中腸細胞的感染，引起病毒原發性感染周期；另一種是出芽型病毒粒子（budded virus，BV），在昆蟲體內細胞與細胞之間傳播，引起全身性感染［1］。

桿狀病毒egt基因是非必需的早期基因，同時也是最早被發現的在個體水平調控感染宿主的基因。egt基因編碼的蛻皮甾體尿苷二磷酸葡萄糖基轉移酶（ecdysteroid UDP-glucosyltransferase，EGT），能夠催化葡萄糖基從UDP-葡萄糖轉移到蛻皮激素上，使蛻皮激素失活，阻止幼蟲的蛻皮，從而使幼蟲繼續攝食，導致昆蟲體重增加，最終使病毒產量提高［2］。研究發現，從GroupⅡ型桿狀病毒中敲除egt基因，會引起宿主昆蟲攀爬行為減弱，表明桿狀病毒可以通過EGT酶調控昆蟲血淋巴中的蛻皮激素濃度，影響幼蟲的運動行為［3］。也有研究報道，敲除egt基因的病毒感染能夠加速宿主幼蟲的死亡［4］，因此可以通過修飾egt基因位點提高殺蟲速度。本文以桿狀病毒模式種苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovi?rus，AcMNPV）作為代表，對egt基因的基本性質及其對昆蟲生長發育和運動行為的影響作一簡要綜述。

2 egt基因基本性質

egt基因位于AcMNPV基因組上第11426-12964 nt（ORF 15），編碼506個氨基酸，預測分子質量57.01 kD。在所有鱗翅目昆蟲的核型多角體病毒和大部分顆粒體病毒基因組中均發現egt的同源基因，但是在其它進化枝中沒有發現。由于它在昆蟲類固醇代謝中發揮作用，推測編碼這種酶的基因來自于宿主。

egt基因具有兩個鮮明的特征：一是該基因位于桿狀病毒基因組中的一個缺失突變高發區，且可以轉錄成兩個共5’末端的mRNA。這兩種mRNA均不受蛋白合成抑制劑和DNA合成抑制劑的影響，表明egt基因的轉錄不依賴于病毒蛋白合成及病毒DNA復制，屬于桿狀病毒非必需的早期基因［5］；二是egt基因可以分泌表達，編碼區5’端有信號肽序列，編碼的EGT酶成為昆蟲桿狀病毒中第一個已知的分泌型蛋白（圖1）。許多已測序的桿狀病毒均含有egt基因，病毒侵染宿主時，EGT酶能在宿主細胞外聚集且穩定性強，所以不需連續表達合成，便能在整個周期內控制幼蟲蛻皮與化蛹［6］。

圖1 EGT的分子結構Figure 1 The molecular structure of EGT

3 egt基因對宿主生長發育的影響

3.1 egt基因與宿主昆蟲蛻皮

蛻皮與變態是全變態昆蟲典型的發育特征，以家蠶為例，其一生中要經過多次蛻皮，經歷卵-幼蟲-蛹-成蟲（蛾）四個發育階段，完成整個生命周期。控制昆蟲蛻皮的激素主要是蛻皮激素，負責調控昆蟲生長、變態和性成熟等多個相關基因的表達［7］。桿狀病毒感染昆蟲，通過egt基因的糖基化作用使蛻皮激素失活，干涉宿主的生長發育。

在體外試驗中，AcMNPV的EGT催化UDP-半乳糖或UDP-葡萄糖基連接到蛻皮激素的22位碳原子（C22）的羥基上，形成蛻皮激素22-O-β-D吡喃葡萄糖苷，使其失活［2］。向四齡和五齡家蠶注射出芽型的野生AcMNPV，發現幼蟲生長異常，其中部分家蠶齡期延長，另外一些家蠶齡期缺失直接過早化蛹，但最終兩者均在蛹期死亡［8］。2006年Sakano等報道［6］，將非致病性的AcMNPV作為疫苗注射入蠶蛹中，使得其永久保持蠶蛹形態而不蛻變。以上研究表明，egt基因的表達會顯著影響宿主的生長。

利用轉基因技術，張星等［9］研究了轉egt基因對家蠶發育的影響，通過精子介導法將含有家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，Bm?NPV）egt基因和熒光蛋白（gfp）基因的piggyBac轉座載體整合入家蠶卵內，然后在G0代利用G418壓力選擇裝置和GFP雙重篩選，結合分子生物學方法，成功獲得外源基因插入并穩定存在的雌雄轉基因家蠶各一條。通過G0代的交配和G1代的雜交之后發現，egt基因的轉座對家蠶的產卵率和孵化率產生了影響，G1代的產卵率和孵化率較正常的蠶種分別低25%和57.9%，表明蛻皮激素對蠶卵的產生和家蠶胚胎的發育是必需的。與非轉基因家蠶相比，轉基因家蠶G1代的幼蟲期時間明顯變長，G2代蛹期延長4 d，一些蠶蛹到蛾的變態發育甚至停滯。在三齡蛻皮階段，G2代家蠶血淋巴中的蛻皮激素水平降低了90%，表明轉基因家蠶的發育停滯可能是egt基因的表達引起蛻皮激素水平降低造成的。該研究表明，在蛹期利用特異性啟動子控制egt基因的特異表達，可以延緩蠶蛹的發育，有利于鮮繭繅絲。

3.2 egt基因與生物殺蟲活性

與傳統化學殺蟲劑相比，桿狀病毒作為生物殺蟲劑擁有宿主專一性和不污染環境的優點。但過高的宿主特異性和緩慢的發病致死作用兩大缺陷，限制了桿狀病毒作為農業殺蟲劑的應用，因此昆蟲病毒基因工程主要集中解決以上兩個方面。egt基因作為病毒復制的一個非必需的早期表達基因，敲除后能夠增強病毒毒力，加速害蟲死亡和減少食物消耗。

早在上世紀90年代，O’Reilly和MⅡler通過生物測定發現，與野生型AcMNPV相比，缺失egt基因的AcMNPV感染的苜蓿尺蠖夜蛾死亡率提高［2］。之后20年間，研究者在不同的病毒上研究了egt基因突變體的功能。湯欣欣等［4］利用egt基因缺失型和蝎毒基因重組型的斜紋夜蛾核型多角體病毒（Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus，SpltNPV）感染3齡斜紋夜蛾，發現與野生型病毒相比，兩種重組病毒的LT50分別降低了25%和28%。Oihane Simón等［10］選用來自密蘇里和尼加拉瓜的草地貪夜蛾核型多角體病毒（Spodoptera frugiperda multipleNucleo?polyhedrovirus，SfMNPV）進行研究，發現egt基因的缺失或突變是導致桿狀病毒產生快速殺蟲現象的主要因素。

雖然有許多證據表明egt基因的缺失會加快昆蟲的殺滅速度，但其缺失的影響是否取決于昆蟲的幼蟲階段，并沒有詳細的研究。在Susumu Katsuma和Toru Shimada的研究中［11］，利用egt基因突變的BmNPV在家蠶4齡和5齡幼蟲的連續10個時間段進行感染和生物學測定。結果表明，egt缺失導致的快速殺蟲特性只有在幼蟲-幼蟲過渡的過程中進行病毒感染才有效，在幼蟲-蛹的過渡時期，殺蟲速度反而減慢。所有被缺失型病毒感染的4齡第2天的幼蟲均進入蛻皮階段并且比野生型病毒感染的幼蟲死亡得更早。缺失型病毒感染的幼蟲尸體內充滿液體，推測是馬氏管退化引起的。在4齡或5齡早期進行病毒感染的幼蟲，兩種病毒引起的死亡時間相差不大，但在5齡中期以后進行實驗時，被egt基因缺失型病毒感染的幼蟲存活時間卻比野生型病毒感染的幼蟲明顯更長。這些結果表明，egt基因的缺失對桿狀病毒殺蟲速度的影響在很大程度上是依賴于宿主幼蟲的發育階段，這對于理解egt基因在桿狀病毒對宿主昆蟲調控中的作用以及egt基因位點的修飾在桿狀病毒殺蟲特性中的應用，都具有重要的意義。

4 egt基因影響宿主昆蟲的運動行為

許多病毒和寄生蟲都能夠在感染昆蟲后改變宿主的行為，例如蟋蟀受到線蟲感染后，產生自殺行為；蟑螂被寶石黃蜂寄生后，出現長時間的運動行為減弱現象。普遍認為，寄生引起的宿主行為變化有利于病毒和寄生蟲的再生、傳播和存活。桿狀病毒能夠引起昆蟲的行為改變，表現出多動癥和“樹高癥”，爬高的昆蟲被鳥類捕食之后會將病毒在更多的區域進行擴散，從而在更廣的范圍內傳播病毒。

Hoover等的一項研究表明［3］，LdMNPV的egt基因可以引起舞毒夜蛾幼蟲產生樹高癥。然而與Ld?MNPV不同，當敲除AcMNPV基因組中的egt基因，感染的幼蟲仍然會在植物的頂端位置死亡，說明在AcMNPV中egt基因并不是誘導樹高癥產生的決定性因素［12］。

已經有許多關于樹高癥的研究，旨在解開桿狀病毒誘導宿主行為變化的可能機制。Yue Han等人［13］對于egt基因在SeMNPV誘導昆蟲樹高癥的過程中發揮的作用進行研究：將經過病毒感染的甜菜夜蛾幼蟲單獨放置在罐中，每天兩次觀察并記錄幼蟲垂直位置，直到其死亡。研究發現，野生型病毒感染的甜菜夜蛾幼蟲在死亡之前爬高并最終在高處死亡，而被egt突變型的SeMNPV感染的幼蟲卻不會爬高。研究者推斷，這種差異是因為被突變型病毒感染的幼蟲較快死亡，因而并未來得及出現爬高行為，表明egt基因是通過延長幼蟲的死亡時間促使樹高癥的發生。此外該研究也發現，敲除egt的開放閱讀框或是其ATG起始密碼子，都能阻止樹高癥的出現，說明EGT酶對于樹高癥這一行為現象是必需的。

5展望

目前，關于EGT如何阻斷昆蟲蛻皮激素的分子機制并不清楚，深入開展該方面的研究，不僅具有重要的科學理論意義，而且也具有重要的實際生產價值。例如，家蠶是一種重要的經濟昆蟲，為防止蠶蛹羽化破壞蠶繭，目前是利用高溫烘繭的方式將蠶蛹殺死后進行繅絲，不僅成本高，而且質量無法與鮮蠶繭媲美。巧妙地控制EGT基因的表達，將有利于上述目標的實現。研究表明［9］，可以通過轉egt基因的表達控制家蠶的發育和變態，阻止蠶蛹蛻變成蛾。此外，Gal4/UAS雙元轉基因系統已在2005年應用于家蠶中［14］，若將兩者交叉構建一個完整的轉基因體系，使蠶蛹處于停滯狀態，可使鮮蠶繭繅絲成為可能。

迄今為止，對egt基因影響宿主幼蟲殺死速度的研究結果并不一致，對于這種差異，我們分析主要有兩個原因：一是幼蟲齡期和感染時間的影響，二是試驗中所用重組病毒的構建方式有差異。egt基因缺失型病毒基本可以分為兩類，一種是突變體帶有標記基因（如lacZ），另一種是僅帶有缺陷egt的突變體。已有實驗證明［15］，在桿狀病毒基因組中通過插入lacZ破壞egt基因，會阻礙相鄰基因的表達，對EGT的殺蟲速度產生不確定影響。改善egt基因敲除型病毒的構建方法，在幼蟲的不同齡期連續進行感染，并從分子水平闡明其殺蟲效果作用機制，將為桿狀病毒作為生物殺蟲劑的應用提供新的參考。

關于桿狀病毒感染晚期egt基因使宿主昆蟲產生樹高癥的現象，我們認為今后該領域的研究工作應集中在兩個方面。一是EGT酶在GroupⅠ和Ⅱ桿狀病毒中作用的保守性有待研究，對此可以采用分子進化分析，并根據兩種病毒類型基因組成上的差異展開研究。二是在能夠誘導宿主產生樹高癥現象的LdMNPV和SeMNPV中，其操縱宿主行為的分子機制有待深入研究。新技術的交叉應用如轉錄組學、蛋白組學、神經生物學與基因組分析等相結合，將成為揭示病毒改變宿主行為機制的重要途徑。

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The Research Progress of Baculovirus egt Gene

WANG Hai-Ping,WU Xiao-Feng＊
（College of Animal Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China）

Baculoviruses are characterized by a large circular double-stranded DNA genome,the ecdysteroid UDP-glucosyltransferase(EGT)was produced by egt gene after infecting insects.Catalytic activity of EGT can inactivate ecdysteroids,prevent the metamorphosis of larvae,thus contributing to the virus reproduction.Several lines of evidence have shown that the deletion of the egt from the nucleopolyhedrovirus genome shorten the dearth time and eliminate the upward climbing behavior of lepidopteran larval host.A recent study reported that egt expression in egt-transgenic silkworms results in arrest of metamorphosis from pupae to moths.Studies on the molecular mechanism of EGT and its interaction with host proteins will deepen our understanding of the effect of baculovirus on host growth and behavior changes.It is not only conducive to the production of agriculture(especially the silk industry,such as fresh cocoon reeling),but also provides new ideas for the research and development of new efficient biopesticides.

Baculovirus;egt gene;host insect;growth;behavior

Q786

A

0258-4069［2017］01-010-04

王海萍（1990-），女，山東煙臺人，博士研究生，從事家蠶桿狀病毒分子生物學研究。E-mail：1083196719@qq.com

吳小鋒，男，教授、博士生導師。E-mail：wuxiaofeng@zju.edu.cn