子癇前期宮內環境導致子代大鼠海馬HPA軸相關基因表達改變

胡 蓉 劉學淵 姚晴晴 李笑天

(復旦大學附屬婦產科醫院產科 上海 200011)

子癇前期宮內環境導致子代大鼠海馬HPA軸相關基因表達改變

胡 蓉 劉學淵 姚晴晴 李笑天△

(復旦大學附屬婦產科醫院產科 上海 200011)

目的 研究子癇前期宮內環境對子代SD大鼠海馬下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)軸相關基因表達的影響。方法 通過給妊娠第14天SD大鼠連續皮下注射亞硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)至分娩的方法建立子癇前期大鼠動物模型,對照組予生理鹽水1 mL皮下注射。用酶聯免疫檢測(ELISA)方法檢測新生子代大鼠血皮質酮(corticosterone,CORT)濃度。用Real-time PCR方法和Western bolt分別檢測8周齡子代大鼠海馬組織糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor,GR)、促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)、CRH受體1 (CRH receptor 1,CRHR1)和IL-6的mRNA水平及其蛋白質水平。結果 與正常子代新生鼠相比,子癇前期子代新生鼠血CORT濃度升高(P<0.05)。與正常子代鼠相比,子癇前期青少年子代鼠海馬GR、CRH 和CRHR1 mRNA和蛋白質水平均增加(P<0.05),炎性因子IL-6 mRNA和蛋白質水平均增加(P<0.05)。結論 子癇前期宮內環境影響子代大鼠海馬HPA軸相關基因的表達,在子代學習記憶能力受損中起作用。

子癇前期; 子代大鼠; 糖皮質激素受體; CRH; CRHR1; IL-6

子癇前期是妊娠期最常見的以高血壓、蛋白尿為主要特征的并發癥,國外報道發病率達到7%～10%,我國大約為9.4%。子癇前期對胎兒最重要的影響是慢性宮內缺氧的應激環境,其對子代各臟器結構和功能的程序化影響是多方面的[1-2],其中學習記憶能力和生活質量密切相關。

臨床流行病學研究發現,與正常人群子代相比,子癇前期的子代幼年期、青少年期和成年后學習記憶能力下降、IQ平均值較低[2-5]。我們運用子癇前期的大鼠動物模型研究,發現子代鼠青少年期和成年期智力受損、學習記憶和空間定位能力降低[6],伴海馬神經干細胞增殖受到抑制[7]。也有研究發現子癇前期的子代鼠表現為大腦缺氧改變、神經元遷移和凋亡的改變。但子癇前期宮內環境導致子代學習記憶能力受損的分子機制尚不清楚。

下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA軸)對海馬依賴的學習記憶能力有調控作用,同時受孕期宮內應激環境的程序化影響[8],宮內應激的作用時間、種類和強度的不同,子代可能表現為應激損傷或者對應激的適應性改變,并引起腦內HPA軸相關基因表達的改變。例如胚胎發育期的應激會引起海馬糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor,GR)的過度激活和海馬損傷,對HPA軸的負反饋抑制減弱,導致HPA軸過度興奮,下丘腦分泌更多的促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin releasing hormone,CRH),激活垂體產生促腎上腺皮質激素(adrenocortico tropic hormone,ACTH),ACTH作用于腎上腺皮質促進皮質酮(corticoserone,CORT)的生成和分泌,并進一步損傷海馬造成惡性循環[9]。CRH過表達的轉基因小鼠存在學習記憶缺陷,給予促腎上腺皮質激素釋放激素受體(CRHR)拮抗劑能糾正應激引起的記憶障礙以及海馬樹突丟失[10]。炎性因子白介素-6 (IL-6)在GR受體通路以及大腦缺血缺氧改變的研究中發揮作用,孕期高脂飲食導致子代大腦GR信號通路發生改變,IL-6在其中發揮作用[11]。

因此,我們研究了子癇前期宮內環境對青少年子代大鼠海馬HPA軸相關基因GR、CRH和CRHR1表達的影響,和對子代海馬炎性因子IL-6表達的影響,以探討子癇前期宮內環境對子代學習記憶能力影響的分子機制,為出生后干預尋找可能的方向。

材 料 和 方 法

動物實驗 清潔級雌性SD大鼠8只(斯萊克實驗動物有限公司),體質量230～260 g,于室溫18～20 ℃自由飲食。于發情期與雄性SD大鼠8只合籠飼養,陰栓脫落日定為妊娠第1天,分籠飼養。母鼠隨機分為2組。在妊娠第14天開始,實驗組每天給予亞硝基左旋精氨酸甲酯(美國Sigma公司) 125 mg/kg,對照組給予生理鹽水1 mL皮下注射,每天1次直至分娩。自然分娩后,部分仔鼠以斷頭法取血,血樣以2 000×g/min離心10 min,血清-80 ℃保存。部分仔鼠和母鼠一起飼養,每籠1只母鼠所帶仔鼠數目相同。各組仔鼠由母鼠哺乳至21天斷奶后,分籠飼養至8周齡(56天)以頸椎脫位法處死,取海馬組織置于-80 ℃冰箱保存備用。

酶聯免疫檢測(ELISA法) 取血清按酶聯免疫吸附試驗檢測試劑盒說明書檢測血清CORT。

Real-time PCR檢測 細胞總RNA用Trizol常規抽提。逆轉錄用PrimeScriptTMRT試劑盒(日本TAKARA公司),操作步驟嚴格按照說明書。real-time PCR 在Applied Biosystems FTC3000HT 熒光定量PCR儀(加拿大Funglyn Biotech公司)上完成。PCR樣品總反應體積為25 μL,反應體系包括cDNA模板1 μL、引物各0.8 μL、SYBRgreen mix (2×) 10 μL,ROX (50×) 0.4 μL,ddH2O (滅菌蒸餾水) 7 μL。經95 ℃ 30 s預變性后,95 ℃ 5 s、60 ℃ 30～34 s循環40個,每個循環結束前LightCycle系統自動檢測熒光產物的量,所有循環結束后,繪制融解曲線判斷擴增產物的特異性。為排除基因組DNA的污染每個樣品均設置相應未經逆轉錄的模板作為陰性對照。每組實驗重復3次,每次各樣品均設復孔。利用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

表1 PCR引物序列

Western blot檢測 以RIPA裂解組織,4 ℃下10 000×g離心5 min后取上清液。BCA法蛋白質定量后經SDS-PAGE分離,轉膜后,用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h,加人對應一抗于4 ℃孵育過夜,以TBST洗滌3次后,加入二抗于室溫孵育1 h,再以TBST洗滌3次后,采用ECL試劑曝光顯色。應用一抗如下:GR (ab3579,英國Abcam公司)、CRH (ab8901,美國Abcam公司)、CRHR1 (sc-12383,美國Santa Cruz公司),IL-6 (ab9324,英國Abcam公司),內參選用GAPDH (ab-9485,美國Abcam公司)。

結 果

子癇前期宮內環境導致子代新生大鼠HPA軸血清CORT濃度的變化 一氧化氮(nitricoxide,NO)合成減少與子癇前期發病相關。Yallampalli等首次用NO合成抑制劑L-NAME建立子癇前期的大鼠動物模型,本研究同樣運用孕鼠皮下注射L-NAME的方法建立模型。ELlSA檢測結果顯示,與正常子代P0期新生鼠相比,子癇前期子代新生大鼠血清CORT濃度明顯升高(P < 0.05,圖1)。有研究發現子癇前期的新生兒血漿皮質醇濃度較高[12],而L-NAME的使用可能會導致血清皮質酮含量降低[13],因此子代新生大鼠血清CORT濃度升高,提示了子癇前期宮內環境引起子代高CORT的內環境。

Compared with normal neonatal rats,the serum CORT concentration of neonatal rats with preeclampsia was increased.

圖1 子癇前期宮內環境對子代新生大鼠血清CORT濃度的影響

Fig 1 Effect of preeclampsia on serum CORT concentration in neonatal offspring rats

子癇前期宮內環境導致8周齡子代大鼠海馬GR、CRH和CRHR1表達的改變 分別取實驗組和對照組8周齡的子代鼠(相當于人類青春期的年齡)海馬組織,Real-time PCR檢測發現,子癇前期8周齡子代大鼠海馬GR mRNA的水平增加(P<0.05),CRH和CRHR1 mRNA的水平均增加(P<0.05,圖2)。 Western blot檢測發現,子癇前期8周齡子代大鼠海馬GR、CRH、CRHR1蛋白質水平均增加(P<0.05,圖3)。

Compared with normal adolescent offspring,the expression of GR,CRH and CRHR1 mRNA was increased in the hippocampus of adolescent rats with preeclampsia.

圖2 子癇前期宮內環境導致8周齡子代大鼠海馬GR、CRH和CRHR1 mRNA水平的改變

Fig 2 Effect of preeclampsia on expressions of GR,CRH and CRHR1 mRNA in the hippocampus of 8-week offspring rats

Compared with normal adolescent offspring,the expression of GR,CRH and CRHR1 protein was increased in the hippocampus of adolescent rats with preeclampsia.

圖3 子癇前期宮內環境導致8周齡子代大鼠海馬GR、CRH和CRHR1蛋白水平的改變

Fig 3 Effect of preeclampsia on expressions of GR,CRH and CRHR1 protein in the hippocampus of 8-week offspring rats

子癇前期宮內環境導致8周齡子代大鼠海馬炎性因子IL-6 表達的變化 本研究也檢測了GR相關的IL-6的表達,Real-time PCR和Western blot檢測,與對照組8周齡子代大鼠相比,子癇前期子代大鼠海馬中促炎性因子IL-6 mRNA和蛋白質水平均增加(P< 0.05,圖4～5)。

Compared with normal adolescent offspring,the expression of IL-6 mRNA was increased in the hippocampus of adolescent rats with preeclampsia.

圖4 子癇前期宮內環境導致8周齡子代大鼠海馬炎性因子IL-6 mRNA水平的變化

Fig 4 Effect of preeclampsia on expressions of IL-6 mRNA in the hippocampus of 8-week offspring rats

圖5 子癇前期宮內環境導致8周齡子代大鼠海馬炎性因子IL-6蛋白水平的變化

討 論

本研究發現,首先子癇前期子代新生大鼠血清皮質酮濃度升高,其次8周齡子代大鼠海馬GR、CRH和CRHR1 mRNA水平均增加,8周齡子代大鼠海馬促炎性因子IL-6 mRNA水平也增加。提示子癇前期宮內環境導致子代大鼠出生時血清高皮質酮,以及8周齡海馬HPA軸相關基因表達的改變,可能在子代學習記憶能力受損中發揮作用。

子癇前期子代可能處于高糖皮質激素的宮內環境水平,依據:(1)子癇前期的新生兒血漿皮質醇濃度較高[12];(2)胎盤局部11β-HSD2酶可以降解糖皮質激素,作為胎盤屏障,避免胎兒處于高糖皮質激素的環境,子癇前期由于胎盤11β-HSD2酶表達的減少,導致局部的屏障作用受損,胎兒暴露于高糖皮質激素環境中[14];(3)子癇前期孕婦的早產兒,與其他同胎齡兒相比,肺透明膜病變發病率較低。本研究運用子癇前期動物模型,發現子癇前期子代新生大鼠出生后血清皮質酮濃度升高,提示了子癇前期子代存在宮內高糖皮質激素的環境,并可能對HPA軸產生影響。有研究發現子癇前期子代到了青少年期,血漿皮質酮水平也較高,提示子癇前期子代HPA軸活性的過度激活[15]。

宮內應激或其他不良環境會影響子代HPA軸的功能。孕晚期反復遭受社會壓力應激的子代,青少年期出現胰島素抵抗、成年后出現應激時HPA軸過度激活、海馬GR和CRH mRNA水平均增加[16-17]。孕期高糖低蛋白飲食導致子代的HPA功能異常和成年后高血壓等代謝綜合征發病增加[18]。宮內缺氧應激可導致子代鼠HPA軸敏感性的改變和crhr1 DNA CpG島甲基化的改變[19]。但也有海馬GR過表達導致負反饋增強和HPA軸功能減弱的研究結果[20],例如出生后獲得充分母愛的仔鼠,遇到應激時GR表達增加,CRH、ACTH和糖皮質激素分泌均減少,表現為HPA軸的負反饋增加,減少應激時HPA軸的反應性[21-22]。本研究發現子癇前期的子代大鼠8周齡時GR、CRH和CRHR1 表達增加,提示8周齡時子代表現為對HPA軸的負反饋抑制減弱和HPA軸的過度激活,進一步可通過CRHR的拮抗劑或激動劑來檢測應激狀態下HPA軸的功能。

HPA軸與海馬依賴的學習記憶能力有關。有研究發現胚胎發育期應激會導致CRH和CRHR過表達[23],給予CRHR拮抗劑能糾正應激引起的記憶障礙以及海馬樹突丟失[10]。小劑量CRH能增強大鼠的空間學習能力,CRH直接注入大鼠腦可導致神經元長時程突觸效應的持續增強,該效應能被CRHR拮抗劑所阻斷,提示CRH通過其受體參與調節海馬神經元的長時程突觸效應,進而影響海馬依賴的學習記憶功能。CRH通過CRHRl抑制神經元突起的發育[24],并涉及AC/PKC以及MAPK信號轉導通路,有NMDA、AMPA和GABA受體參與[25-26]。因此我們推測子癇前期宮內環境導致子代CRH/CRHR1表達的增加,提示了子癇前期子代HPA軸的過度激活,與出生后學習記憶能力受損有關。

糖皮質激素有促進炎癥或者抗炎癥的作用,因此本研究也檢測了海馬中與GR信號轉導通路和宮內應激環境改變有關的炎癥基因IL-6 的水平[27]。發現子癇前期的8周齡子代大鼠的IL-6 水平增加,提示GR下游的炎癥促進因子可能在子癇前期子代學習記憶能力抑制的過程中發揮作用。在神經退行性疾病研究中發現,慢性糖皮質激素高暴露導致海馬IL-6、NF-κB和IL-18等水平增加,提示糖皮質激素導致的海馬炎癥反應與神經退行性改變有關[28]。研究發現,抑郁癥人群中糖皮質激素暴露導致血IL-6水平升高與海馬體積縮小有關,提示了IL-6在海馬神經細胞分化生成異常和神經可塑性的異常中起作用[29]。

目前胎源性成人疾病已成為研究熱點,子癇前期是妊娠期最常見的并發癥之一,隨著圍產醫學的發展,重度子癇前期圍產兒出生率的增加,子癇前期宮內環境對子代的影響深遠,包括代謝性疾病發病率的增加等,其中學習記憶能力的影響引起我們的關注。本研究結果初步提示,子癇前期大鼠宮內高糖皮質激素的環境影響了子代的HPA軸的功能,可能在子代學習記憶能力受損中起作用,為出生后干預提供了可能的環節。但本研究未對子代HPA軸應激情況下的功能進行研究,是后續要開展的內容。

[1] SEIDMAN DS,LAOR A,GALE R,etal.Pre-eclampsia and offspring′s blood pressure,cognitive ability and physical development at 17-years-of-age[J].BrJObstetGynaecol,1991,98(10):1009-1014.

[2] VAN WASSENAER AG,WESTERA J,VAN SCHIE PEM,etal.Outcome at 4.5 years of children born after expectant management of early-onset hypertensive disorders of pregnancy[J].AmJObstecGynecol,2011,204:510.e1-9.

[3] EHRENSTEIN V1,ROTHMAN KJ,PEDERSEN L,etal.Pregnancy-associated hypertensive disorders and adult cognitive function among Danish conscripts[J].AmJEpidemiol,2009,170(8):1025-1031.

[4] MANY A,FATTAL A,LEITNER Y,etal.Neurodevelopmental and cognitive assessment of children born growth restricted to mothers with and without preeclampsia[J].HypertensPregnancy,2003,22(1):25-29.

[5] WHITEHOUSE AJ,ROBINSON M,NEWNHAM JP,etal.Do hypertensive diseases of pregnancy disrupt neurocognitive development in offspring[J].PaediatrPerinatEpidemiol,2012,26(2):101-108.

[6] 朱蔚敏,王春芳,李笑天,等.妊娠期L-NAME干預對子代大鼠學習認知能力的影響[J].實驗動物與比較醫學,2009,29(4):223-227.

[7] LIU X,ZHAO W,LIU H,etal,Developmental and functional brain impairment in offspring from preeclampsia-like rats[J].MolNeurobiol,2016,53(2):1009-1019.

[8] HARRISA,SECKL J.Glucocorticoids,prenatal stress and the programming of disease[J].HormBehav,2011,59:279-289.

[9] BANERJEE SB,ARTERBERY AS,FERGUS DJ,etal.Deprivation of maternal care has long-lasting consequences for the hypothalamic-pituitary- adrenal axis of zebra finches[J].ProcBiolSci,2012,279(1729):759-766.

[10] VEENIT V,RICCIO O,SANDI C.CRHR1 links peripuberty stress with deficits in social and stress-coping behaviors[J].JPsychiatrRes,2014,53:1-7.

[11] SASAKI A,DE VEGA W,SIVANATHAN S,etal.Maternal high-fat diet alters anxiety behavior and glucocorticoid signaling in adolescent offspring[J].Neuroscience,2014,272:92-101.

[12] 宋燕燕,吳育群,宋淑本,等.母妊高征對新生兒血糖、胰島素及皮質醇水平的影響[J].中國優生與遺傳雜志,2002,10(3):84-85.

[13] JOUNG HYJUNG EY,KIM K,etal.The differential role of NOS inhibitors on stress-induced anxiety and neuroendocrine alterations in the rat[J].BehavBrainRes,2012,235(2):176-181.

[14] SCHOOF E,GIRSTL M,FROBENIUS W,etal.Decreased gene expression of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 and 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase in human placenta of patients with preeclampsia[J].JClinEndocrinolMetab,2001,86(3):1313-1317.

[15] HENLEY D,BROWN S,PENNELL C,etal.Evidence for central hypercortisolism and elevated blood pressure in adolescent offspring of mothers with pre-eclampsia[J].ClinEndocrinol(Oxf),2016,85(4):583-589.

[16] BRUNTONPJ,RUSSELL JA.Prenatal social stress in the rat programmes neuroendocrine and behavioural responses to stress in the adult offspring:sex specific effects[J].JNeuroendocrinol,2010,22(4):258-271.

[17] ENTRINGER S,WüST S,KUMSTA R,etal.Prenatal psychosocial stress exposure is associated with insulin resistance in young adults[J].AmJObstetGynecol,2008,199(5):498.e1-e7.

[18] OTTEN W,KANITZ E,TUCHSCHERER M,etal.Effects of low and high protein:carbohydrate ratios in the diet of pregnant gilts on maternal cortisol concentrations and the adrenocortical and sympathoadrenal reactivity in their offspring[J].JAnimSci.2013,91(6):2680-2692.

[19] WANG XMENG FS,LIU ZY,etal.Gestational hypoxia induces sex-differential methylation of Crhr1 linked to anxiety-like behavior[J].MolNeurobiol,2013,48(3):544-555.

[20] VAZQUEZ DM,NEAL CR JR,PATEL PD,etal.Regulation of corticoid and serotonin receptor brain system following early life exposure of glucocorticoids:long term implications for the neurobiology of mood[J].Psychoneuroendocrinology,2012,37(3):421-437.

[21] LIU D,DIORIO J,TANNENBAUM B,etal.Maternal care,hippocampal glucocorticoid receptors,and hypothalamic-pituitary-adrenal responses to stress[J].Science,1997,277(5332):1659-1662.

[22] CALDJI C,TANNENBAUM B,SHARMA S,etal.Maternal care during infancy regulates the development of neural systems mediating the expression of fearfulness in the rat[J].ProcNatlAcadSciUSA,1998,95(9):5335-5340.

[23] WANG XD,RAMMES G,KRAEV I,etal.Forebrain CRF(1) modulates early-life stress-programmed cognitive deficits[J].JNeurosci,2011,31(38):13625-13634.

[24] CHEN Y,DUBE C,RICE C,etal.Rapid loss of dendritic spines after stress involves derangement of spine dynamics by corticotropin-releasing hormone[J].JNeurosci,2008,28(11):2903-2911.

[25] KATSOULI S,STAMATAKIS A,GIOMPRES P,etal.Sexually dimorphic long-term effects of an early life experience on AMPA receptor subunit expression in rat brain[J].Neuroscience,2014,257:49-64.

[26] ANDRES AL,REGEV L,PHI L,etal.NMDA receptor activation and calpain contribute to disruption of dendritic spines by the stress neuropeptide CRH[J].JNeurosci,2013,33(43):16945-16960.

[27] FRANK MG,HERSHMAN SA,WEBER MD,etal.Chronic exposure to exogenous glucocorticoids primes microglia to pro-inflammatory stimuli and induces NLRP3 mRNA in the hippocampus[J].Psychoneuroendocrinology,2014,40:191-200.

[28] HU W,ZHANG Y,WU W,etal.Chronic glucocorticoids exposure enhances neurodegeneration in the frontal cortex and hippocampus via NLRP-1 inflammasome activation in male mice[J].BrainBehavImmun,2016,52:58-70.

[29] FRODL T,CARBALLEDO A,HUGHES MM,etal.Reduced expression of glucocorticoid-inducible genes GILZ and SGK-1:high IL-6 levels are associated with reduced hippocampal volumes in major depressive disorder[J].TranslPsychiatry,2012,2:e88.

Preeclampsia alters the expression of HPA axis related genes in the hippocampus of offspring rats

HU Rong, LIU Xue-yuan, YAO Qing-qing, LI Xiao-tian△

(DepartmenofObstetrics,Obstetrics&GynecologyHospital,FudanUniversity,Shanghai200011,China)

Objective To explore the effect of preeclampsia on the expression of hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis related genes in the hippocampus of adolescent offspring rats. MethodsThe pregnant Sprague-Dawley rats were randomly divided into two groups to be given 125 mg·kg-1·d-1L-NAME or 1 mL pure saline by daily injection from day 14 to delivery.Serum corticosterone (CORT) levels in neonatal offspring rats were detected by ELISA.The mRNA and protein levels of glucocorticoid receptor (GR),corticotropin releasing hormone (CRH),CRH receptor 1 (CRHR1) and IL-6 in the hippocampus of 8-week offspring rats were determined by real-time PCR and Western blot,respectively. Results Compared with normal neonatal rats,the serum CORT concentration of neonatal rats with preeclampsia was increased (P<0.05).Compared with normal adolescent offspring,the levels of GR,CRH and CRHR1 mRNA and protein were increased in the hippocampus of adolescent rats with preeclampsia (P<0.05),accompanied by increased IL-6 mRNA and protein (P<

0.05),as a downstream inflammatory gene of the GR. Conclusions We found that adolescent SD rats exposed to preeclampsia showed alteration in the expression of HPA related genes in the hippocampus,which played a role in the impairment of learning and memory in children.

preeclampsia; offspring rats; glucocorticoid receptor; CRH; CRHR1; IL-6

國家自然科學基金(81571460,81270712)

R714.24+5

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.04.007

2016-12-06;編輯:沈玲)

△Corresponding author E-mail:xiaotianli555@163.com

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81571460,81270712).