不同變頻組合電針預處理對急性腦缺血大鼠神經功能和腦皮質促紅細胞生成素的影響

梁 超,姜 濤,王靜芝,曾曉玲，劉建民,鄭肇良

(1.海口市中醫醫院，海南 海口 570216；2.湖北中醫藥大學針灸骨傷學院,武漢 430000)

【針灸研究】

不同變頻組合電針預處理對急性腦缺血大鼠神經功能和腦皮質促紅細胞生成素的影響

梁 超1,姜 濤1,王靜芝2,曾曉玲2，劉建民2,鄭肇良1

(1.海口市中醫醫院，海南 海口 570216；2.湖北中醫藥大學針灸骨傷學院,武漢 430000)

目的: 觀察不同頻率電針預處理對大腦中動脈梗塞(middle cerebral artery occulation，MCAO)大鼠神經功能和腦皮質促紅細胞生成素(EPO)表達影響。方法: SD大鼠按隨機數字表法分為正常對照組、模型組、安慰針刺組、預處理1組、預處理2組、預處理3組每組各10只，不同頻率電針頭穴進行預處理后制備MCAO模型；參照Longa標準評估神經功能，免疫組化法檢測EPO陽性細胞數目，實時熒光定量PCR檢測EPOmRNA表達。結果：不同頻率電針預處理后MCAO大鼠神經功能損傷明顯減輕，其中以2Hz/100Hz的頻率最為明顯；各預處理組EPO陽性表達細胞數差異明顯，2Hz/100Hz頻率預處理后陽性細胞數目最多；電針預處理能促進EPOmRNA的表達增加，其中以2Hz/100Hz頻率電針預處理組的表達最明顯。結論: 不同變頻組合電針頭穴的預處理能減輕腦缺血后神經功能的損傷，這可能與調節缺血局部腦皮質EPO蛋白和基因的表達有關，不同頻率電針其效應不同，其中以2Hz/100Hz頻率電針的效果最顯著。

MACO大鼠；電針頻率；頭穴；預處理；EPO

缺血性腦血管病是一種好發于中老年人的疾病，高發病率、高致殘率使其備受關注。美國缺血性卒中和短暫性腦缺血發作患者卒中預防指南明確提出該病的積極預防意義遠大于治療[1～2]。針灸作為一種缺血預處理手段，被廣泛應用于該病的研究中，能明顯減輕缺血后神經元損傷，減輕炎癥反應，幫助神經功能恢復[3～4]。本研究在之前基礎上，觀察不同時間電針預處理對局灶性腦缺血大鼠局部腦皮質中促紅細胞生成素(Erythropoietin，EPO)表達變化及受損神經功能的影響，初步探討電針預防急性腦血管病的相關機制。

1 材料

1.1 實驗動物

健康成年SPF級SD大鼠60只(湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號SCXK(鄂)2015-0018)，雌雄不拘，體質量(200±20) g。于實驗前1周一次性購進，飼養于安靜、溫暖且避強光的環境中，室溫(20±2)℃，自由飲水飲食。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 兔抗大鼠EPO多克隆抗體、HRP標記山羊抗兔抗體、DAB顯色劑、免疫組化試劑盒、濃縮型正常山羊血清(封閉)、熒光(Cy3)標記羊抗兔IgG(均購自武漢博士德生物工程有限公司)、DAPI、抗熒光淬滅封片劑(碧云天生物科技有限公司)；Trizol(Aidlab)、DL2000 DNA Marker(TAKARA)引物合成(擎科科技有限公司)。

1.2.2 主要儀器 病理切片機(德國Leica RM 2016輪轉式切片機)、熒光顯微鏡(NIKON Eclipse 80i生物顯微鏡)、微量移液器(北京大龍公司)、實時熒光定量PCR儀(ABI7900 / illumina eco)、熒光定量PCR管(EXTRAGENE / illumina)、分光光度計(上海舜宇恒科學儀器有限公司)、PH計(德國Metter-Toledo GmbH公司)、水平電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)、紫外分析儀(北京君意東方電泳設備有限公司)。

2 方法

2.1 動物分組及處理

60只SD大鼠采用隨機數字表法分為正常對照組、模型組、安慰針刺組及預處理1組、預處理2組、預處理3組各10只；正常對照組不予處理，正常給水給食；模型組按要求制備MCAO模型；安慰針刺組和預處理各組按治療方法給予不同處理，治療完成后制備MCAO模型。

2.2 動物模型制備

按Longa[5]線栓法制備MCAO模型。大鼠造模前禁食不禁水24 h，以10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉；常規備皮消毒，頸部正中切口，鈍性分離皮下筋膜和肌肉，暴露并分離出右側頸總動脈(Common carotid arternal,CCA)、頸內動脈(Internal carotid artery,ICA)、頸外動脈(External carotid artery,ECA)；電凝ECA的分支，結扎游離ECA主干，分離ICA主干至翼腭動脈(Pterygo palatine artery,PPA)，并在其起始部和CCA的近心端各置一動脈夾；線栓從ECA殘端小口進入，輕推經CCA分叉部沿ICA入顱，至大腦中動脈(Middle cerebral artery,MCA)；尼龍線插入深度由CCA分叉部計約18 mm，栓塞60 min后拉出縫合切口并消毒，術后大鼠室溫下禁食給水喂養，蘇醒后進行神經功能障礙評分，評分在1級以上的大鼠為造模成功。

2.3 治療方法

根據中國針灸學會制定的《頭皮針穴名國際標準化方案》[6]選取雙側頂顳前斜線、頂顳后斜線，并結合《實驗針灸學》[7]大鼠穴位圖譜模擬人體經穴定位。頂顳后斜線:“百會”(頂骨正中點)至“曲鬢”(為耳緣直上與耳尖水平線的交點)；頂顳前斜線:頂顳后斜線向前平移0.1 寸。選用30號1寸一次性無菌針灸針，分別從頂骨中點向耳根前與頭皮呈15°夾角透刺0.5～0.8寸，快速捻轉至針下沉澀感后，同側頭穴為一對。安慰針刺組采用套迭式頓頭安慰針，底座固定于穴位處，左手固定針管，右手快速叩擊頓頭安慰針，局部皮膚針刺感，但不刺入皮膚，不予加電刺激；電針治療采用LH202H型韓氏儀，疏密波，電流強度lmA，電針預處理1組、2組和3組分別選用頻率為2 Hz/150 Hz、2 Hz/100 Hz和2 Hz/50 Hz，連續治療10 d，每日1次，每次30 min。

3 指標及方法

3.1 神經功能缺損評分(NSS)

參照Longa神經功能評分標準評估：1級：左前肢不能充分伸展計1分；2級：向左環形運動，輕度局灶神經功能缺失計2分；3級：向左側倒，中度局灶神經功能缺失計3分；4級：不能自然行走，重度局灶神經功能缺失計4分。

3.2 EPO陽性表達細胞數目

大鼠灌注后迅速取腦，剝離腦膜除去嗅球、延髓和小腦，在視交叉平面前后2mm處將腦冠狀切開，分離右側大腦皮層，仔細切取缺血區域大腦皮層組織塊(即右側頂顳葉皮層組織)約1 mm×1 mm×1 mm，按免疫組化S-ABC法操作(步驟按試劑盒說明)，一抗(EPO抗體)稀釋度為1∶200；以細胞漿出現棕黃色顆粒為陽性細胞；在高倍(×400)光學顯微鏡下，隨機選取5個視野，計算陽性細胞數，并取平均值為EPO蛋白表達的陽性細胞數目。

3.3 EPOmRNA表達的檢測

按上述方法取右側頂顳葉皮層組織約1 mm×1 mm×1 mm，清洗后保存于-80℃冰箱；按照TRizol說明書的方法提取腦缺血組織中總RNA；在20μL反轉錄反應體系中，以1μL RNA為模板將mRNA反轉錄為cDNA；PCR反應以β-actin mRNA為內參，上游引物：5-CGTTGACATCCGTAAAG ACCTC-3’，下游引物：5’-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3’；EPO mRNA引物序列，上游引物：5-CACCCTGCTGCTTTTACTATCCTT-3’,下游引物：5-CATTGTGACATTTTCTGCCTCCT-3’；反應體系為20μL，擴增結束后，PCR產物的定量校正和判定分析采用β-actin mRNA作為內參，用β-actin mRNA的拷貝數作為校正基數，各樣本中EPOmRNA的CT(cycle threshold)值，分別與對應樣本中β-actin mRNA的CT值相減，即獲得EPOmRNA的△CT值；分別以模型組的△CT值作為校正，得出-△△CT值，2-△△Ct公式計算出個樣本中EPOmRNA的表達。

4 統計學方法

5 結果

表1圖1顯示，缺血后各組大鼠神經功能損傷評分均升高，模型組與安慰針刺組比較差異無統計學意義(P>0.05)，預處理后NSS分值低于模型組和安慰針刺組，預處理2組分值最低(P<0.01)，預處理1組和預處理3組分值間比較差異無統計學意義(P>0.05)；安慰針刺組EPO陽性細胞數目與模型組的區別不大(P>0.05)，各預處理組比安慰針刺組的細胞數目均多(P<0.05)，預處理2組EPO 陽性表達最多(P<0.01)，預處理1組和預處理3組間比較差異無統計學意義(P>0.05)；安慰針刺組EPOmRNA表達量與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)；不同電針頻率預處理后其表達量各不相同，預處理3組表達量最少(P<0.05)，預處理1組的表達量次之(P<0.05)，預處理2組的表達量最多(P<0.01)。

組別鼠數NSSEPO陽性細胞數EPOmRNA表達正常對照組100.01±0.31 15.38±0.380.14±0.38模型組103.21±0.81☆29.33±0.59☆0.27±1.01☆安慰針刺組102.97±1.2233.75±0.310.30±0.54預處理1組102.03±1.14★#57.18±1.55★#0.53±0.77★#▲預處理2組101.59±0.72★#△78.09±0.97★#△0.75±0.46★#△預處理3組101.87±0.95★#64.21±1.29★#0.42±0.59★#

注：與正常對照組比較：☆P<0.05；與模型組比較：★P<0.05；與安慰針刺組比較：#P<0.05；與預處理3組比較：▲P<0.05,△P<0.01

圖1 各組大鼠缺血局部腦皮質EPO免疫組化圖(10×40)

6 討論

急性腦缺血屬于中醫學“中風”范疇。《靈樞·五亂》記載：“亂于頭，則為厥逆，頭重眩仆……氣在于頭者，取之天柱大杼”，這是頭穴治療中風最早的起源。根據“病變在腦，首選督脈”，頭穴成為現代臨床治療該病的必選穴位。頭穴電針對缺血性腦損傷早期具有改善腦電活動、氧的代謝及減輕神經功能障礙等作用[8-10]，但不同電針頻率其作用機制的側重點也會不同。對于抑制神經元凋亡作用最好的頻率為20 Hz/80 Hz，主要通過降低Bax mRNA表達來實現[11-12]。2 Hz/15 Hz-15 Hz/30 Hz則減輕炎癥因子分泌，誘導膠質細胞增生效果明顯[13-14]。而2 Hz/100 Hz在修復血管內皮損傷方面療效顯著[15]。本實驗以往研究表明，該頻率電針能調控缺血腦皮質EPO蛋白表達，增加血流量并促進微血管內皮細胞增殖[16]；同樣頻率的頭針也能產生類似效應以改善局部血流、減輕腦缺血損傷[17]。但該頻率產生的血管新生效應是否與針刺預處理之間有關，是本研究觀察的目的之一。

以往關于EPO的研究僅局限于貧血疾病[18]，進一步研究發現部分中樞神經系統組織也可產生EPO及其受體，并對神經元具有廣泛的促生長與保護作用，能明顯減輕腦缺血再灌注損傷[19]。之前我們發現，電針頭穴可增加EPOmRNA表達以激活相關分子信號通路促進神經功能恢復，增加血管內皮細胞數量[20]。現在經過電針預處理EPO含量也增加，但不同頻率預處理EPO蛋白和基因表達不一樣，以2 Hz/100 Hz表達最多，2 Hz/50 Hz和2 Hz/150 Hz的表達較少。EPO的這一表達趨勢與神經功能損傷評分的分值變化一致，說明EPO在缺血腦皮質中的含量變化與神經功能的修復存在一定程度的關系[21]。

自“缺血預處理”概念提出后，針灸預防腦血管病一直是研究熱點之一。電針預處理可以在缺血后24 h和48 h明顯增加大鼠骨髓和外周血中EPCs含量[22]，調控血腦屏障MMP-9陽性細胞及VEGFmRNA表達，以提高缺血耐受效應[23]，促進MiRNA-290、MiRNA-494表達，降低AQP-4相對含量以減輕腦損傷[24-25]。本研究發現，不同頻率電針預處理其神經損傷改善程度不同，2 Hz/100 Hz頻率電針刺激后神經功能損傷評分最低，EPO蛋白陽性神經元數目最多，EPOmRNA表達最明顯。

綜上所述，不同頻率電針頭穴的預處理能促進缺血局部腦皮質EPO蛋白和基因的表達，增強缺血耐受效應，從而顯著改善腦缺血大鼠受損的神經功能；相同穴位、電流強度、針刺時間的基礎上，選擇不同頻率電針其神經保護效應不同，其中以2 Hz/100 Hz頻率電針的效果最顯著，但確切機制仍需繼續深入探究。

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海南省自然科學基金資助項目(20158371)-不同時間頭針對MCAO大鼠缺血局部腦皮質微血管新生的影響研究

梁 超(1984-)，女，湖北武漢人，主治醫師，醫學博士，從事針灸治療神經系統疾病的臨床與實驗研究。

R245.9+7

B

1006-3250(2017)05-0686-03

2016-11-26