用液相色譜串聯質譜法測定漁業水樣中6種農藥的含量

高磊，覃東立,2，吳松，黃曉麗，陳中祥，湯施展，黃麗，王鵬

（1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.農業部水產品質量安全控制重點實驗室，北京 100141）

用液相色譜串聯質譜法測定漁業水樣中6種農藥的含量

高磊1，覃東立1,2，吳松1，黃曉麗1，陳中祥1，湯施展1，黃麗1，王鵬1

（1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.農業部水產品質量安全控制重點實驗室，北京 100141）

本文建立了一種快速檢測漁業水質樣本中酰胺類除草劑乙草胺、丙草胺、丁草胺、三嗪類除草劑莠去津、煙堿類殺蟲劑噻蟲嗪、三唑類殺菌劑苯醚甲環唑6種農藥含量的液相色譜串聯質譜法。采用乙腈-水-甲酸梯度洗脫、電噴霧電離方式、多反應監測模式測定考察檢出限、線性范圍、日內精密度及日間精密度。在三種加標濃度下，該方法的回收率為78.2%～104.7%。用液相色譜-四級桿-飛行時間質譜對疑似目標物質進行定性，用精確質量數、同位素豐度比和二級碎片解析方式等解析定性結構。該方法能夠滿足檢測這六種農藥的要求，能準確定性，自建的譜庫可為漁業污染事故鑒定和水產品質量安全風險評估做支撐。

漁業水質；農藥；液相色譜串聯質譜；高分辨質譜

現代農業中大量使用的除草劑已經嚴重危害了環境。目前，在哈爾濱市附近漁場周邊的農田稻田調研發現有乙草胺（acetochlor）、丙草胺（pretilachlor）、丁草胺（butachlor）、莠去津（atrazine）、噻蟲嗪（thiamethoxam）、苯醚甲環唑（difenoconazole）等廢棄外包裝，其中丁草胺是我國用量最大的三種除草劑之一。丁草胺是一種酰胺類除草劑，被廣泛用于防除旱地以及水田的一年生莎草[1]、禾本科雜草和某些一年生闊葉雜草。施用丁草胺后，易被土壤膠體粒子吸附，在土壤中具有明顯的持留性[2]。噻蟲嗪屬于煙堿類殺蟲劑，主要用于防治水稻、小麥、棉花及果樹、蔬菜作物上的刺吸式口器害蟲，如稻飛虱Nilaparvata lugens、蚜蟲 Aphidoidea、葉蟬 Cicadellidae、薊馬 Thripidae、白粉虱 Trialeurodes vaporariorum Westwood等[3]。苯醚甲環唑屬于三唑類殺菌劑，內息性強，殺菌譜廣，可用于防治葉斑病、梨黑星病等[4]。農田、稻田所施用的除草劑殺蟲劑等會滲入到養殖水體中，進入附近的土壤和水體中。

研究表明，丁草胺可引起鯰Silurus asotus的紅細胞變異[5]；噻蟲嗪會導致斑馬魚Barchydanio rerio var肝臟細胞損傷，損傷程度隨濃度和時間升高[6]；苯醚甲環唑對水生生物毒性較大，0.50 a.i.mg·L-1的苯醚甲環唑可使斑馬魚的體色顯著加黑、心率降低[7,8]。可見，大量使用這些農藥不僅對農田造成很多負面影響，還會威脅養殖水體生態環境安全，危害水產品的品質。

檢測上述農藥的方法主要包括液相色譜法[9]、液相色譜串聯質譜法[10,11]、氣相色譜法[12-17]，氣相色譜質譜法[18-21]和免疫親合法[22-24]。其中氣相色譜和液相色譜通過保留時間進行定性，很容易出現假陽性結果。氣相色譜串聯質譜和液相色譜串聯質譜很好解決了定性的問題[25]。

本研究建立了適用于漁業水質快速檢測酰胺類除草劑（乙草胺，丙草胺，丁草胺）、三嗪類除草劑（莠去津）、煙堿類殺蟲劑（噻蟲嗪）、三唑類殺菌劑（苯醚甲環唑）的方法。本研究采用液相色譜串聯質譜法檢測上述農藥，在此基礎上，將所做的污染物加入高分辨圖譜庫，方便日后篩查檢測。液相色譜四級桿飛行時間質譜不僅可以通過保留時間定性，還可以通過精確分子量、同位素豐度比以及二級碎片解析精確定性。最后將所做的污染物進行結構解析，加入自建的飛行時間質譜譜庫，用于日后篩查污染物，為漁業污染事故鑒定和水產品質量安全風險評估提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑耗材

色譜純乙腈、質譜純乙腈、色譜純甲醇、質譜純甲酸，0.22μm有機相微孔濾膜購于上海安譜公司；超純水（電阻率≥18.0 MΩ·cm）；氬氣純度高于99.999%；HLB固相萃取小柱。

1.1.2 儀器

液相色譜-串聯三重四級桿質譜儀（ACQUITY UPLCTQ-S，美國沃特世公司），配有ESI離子源；液相色譜-四級桿-飛行時間質譜（ABSciex TOF 5600+，美國愛博才思公司），配有ESI源及APCI源；超聲波清洗機（KQ-700E，昆山超聲儀器有限公司）；氮吹儀（N-EVAPTM111，美國 Organomation公司）；渦旋混勻器（德國IKA公司）；24位負壓SPE裝置（天津博納艾杰爾科技有限公司）；純水器（美國Millipore公司）；氮氣發生器（美國畢克公司）。

1.1.3 標準溶液配置

莠去津、乙草胺、噻蟲嗪、丙草胺、丁草胺和苯醚甲環唑標準品均購于北京萊耀生物科技有限公司。準確稱取各農藥標準品10mg（精確到0.1mg），用乙腈溶解，定容于100mL容量瓶中，配制成100mg·L-1的農藥混合標準貯備溶液，-18℃保存。儲備液用乙腈稀釋，配制成各濃度的混合標準工作溶液，于4℃保存，現用現配。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理方法

量取100.0mL采集后的水樣，經濾紙過濾，至于250mL燒杯中。分別用2.0mL甲醇和2.0mL水過HLB小柱，再將過濾的水樣過HLB固相萃取小柱。用1.0mL 3%甲醇水溶液淋洗固相萃取小柱，用1.0mL乙腈洗脫目標物。收集的洗脫液，于40℃小氣流氮氣吹干，加入1.0mL 5%乙腈水溶液（V乙腈∶V水∶V甲酸 =5∶95∶0.1），重新溶解殘渣，超聲渦旋30s。用0.22μm有機相微孔濾膜過濾到進樣瓶中，待液相色譜串聯質譜和液相色譜四級桿飛行時間質譜檢測。按照上述前處理方法處理100.0mL超純水，得到空白待測液。向超純水中加入一定量標準品用于比對回收率實驗。

1.2.2 儀器分析條件

液相色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18（50mm×2.1mm，1.7μm）色譜柱。流動相A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脫：0～2.0min，95%A；2.0～4.2min，95% ～5%A；4.2～6.4min，5%A；6.4～6.5min，5%～95%A；6.5～8.0min，95%A。流速 0.3mL·min-1，柱溫 30.0℃，樣品室溫度 10.0℃，進樣體積 2.0μL。

串聯四級桿質譜條件：ESI+電離方式，毛細管電壓2.5kV，偏轉電壓40V，離子源溫度150℃，去溶劑溫度450℃，脫溶劑流量800L·Hr-1，錐孔氣流量250L·Hr-1，離子對及其他質譜參數見表1。

表1 六種農藥的質譜檢測條件Tab.1 Mass spectrum parameters of six pesticides

四級桿-飛行時間質譜儀器條件：ESI+及APCI+混合源，液相色譜流出部分進ESI源，校正液進APCI源。毛細管電壓5500V，氣簾氣30psi，霧化器55psi，CE 為 35V，CES為 15V。

2 結果與分析

2.1 樣品提取及凈化

2.1.1 樣品濃縮優化

水質分析中液液萃取是一種很常用的提取手段，但液液萃取需要使用與水不互溶的有機溶劑。一般用正己烷、二氯甲烷和石油醚等試劑，但這些溶劑都影響操作者的健康。選擇固相萃取方式進行樣品前處理，使用的有機溶劑較少，更環保，固相萃取得到的除草劑的回收率和檢出限均能得到滿意的結果。

2.1.2 淋洗溶劑選擇

圖1 淋洗溶劑對回收率的影響Fig.1 Effects of wash solution on the pesticide recovery

漁業水樣基質復雜會影響農藥的測定。而在富集水樣時，通過淋洗，可以洗脫掉部分雜質。采用1.0mL的1%、2%、3%、4%和5%甲醇水溶液淋洗雜質。如圖1所示，3%甲醇水溶液可以在保證較高回收率的前提下淋洗掉盡可能多的雜質。

2.1.3 洗脫溶劑優化

選取0.5mL、1.0mL和1.5mL的甲醇或乙腈作為洗脫劑，分別進行了試驗。如圖2所示，選1.0mL和1.5mL的乙腈作為洗脫劑效果最好，可選1.0mL乙腈作為洗脫溶劑。

2.2 儀器條件優化

2.2.1 色譜柱的選擇

在相同長度下，粒徑更小的填料擁有更大的柱效。當達到實驗要求的條件下，選取更短的色譜柱可以縮短分析時間，降低分析成本。因此，應用50mm×2.1mm，填料顆粒為1.7μm的色譜柱進行分離檢測。

2.2.2 串聯質譜參數優化

將標準溶液分別稀釋成50～100ng·mL-1，分別對每個物質采用Combine方式進行一級全掃描獲取母離子，優化毛細管電壓等參數，再選用子離子模式優化碰撞能量、錐孔電壓等參數，得到最優的質譜條件。

2.2.3 四級桿飛行時間質譜優化

用校正液校正四級桿質量軸及飛行器。采用MSScan、Production和IDA方式采集數據。對碰撞能量進行選擇，最終選擇（35V±15V）作為碰撞能量。

圖2 洗脫溶劑種類及體積對回收率的影響Fig.2 Effects of eluting solution on pesticide recovery

2.3 方法學

考察液相色譜串聯質譜法的線性范圍、檢出限、日內精密度以及日間精密度等方法學指標（表2）。進行1.0ng、5.0ng和10.0ng的加標回收實驗，結果顯示所有物質加標濃度的回收率均在78.2%～104.7%之間。

2.4 高分辨質譜譜庫的建立及應用

用現有的方法，檢測了養殖池塘水、部分地下水及品牌純凈水等樣品。檢測出哈爾濱市附近某池塘所用的養殖地下水中可能有少量莠去津的殘留。可能由于樣品基質復雜，樣品中離子對比例相差較大，需要進一步定性。因此，應用高分辨質譜采集數據，通過母離子精確分子量，同位素豐度比進行定性。為了進一步確證結果的可信性，又解析了裂解規律，將豐度較高的二級碎片進行解析，找到峰的歸屬（圖3），確證其確實存在少量莠去津。液相色譜串聯質譜測定其含量為0.12μg·L-1，低于國家《GB 5749-2006生活飲用水衛生標準》的限量2.0μg·L-1。最后將莠去津標準品信息錄入自建的高分辨質譜圖譜庫，為日后工作做準備。

3 討論

建立了檢測漁業水質樣本中乙草胺、丙草胺、丁草胺、莠去津、噻蟲嗪和苯醚甲環唑含量的液相色譜-串聯質譜法。樣品經過濾后固相萃取，濃縮富集凈化了基質較為復雜的水樣，用液相色譜串聯質譜定性定量檢測。當出現較為難辨認的“假陽性”樣品時，應用液相色譜-四級桿-飛行時間質譜檢測，通過精確分子量、同位素豐度比、二級質譜解析等對結構進行準確定性。本研究在前處理步驟中應用了3.1mL的甲醇乙腈甲酸等有機溶劑，而往往液液萃取會使用更多的有機試劑。如羅方方等[20]用73mL包含二氯甲烷正己烷有機溶劑處理水樣。在儀器分析檢測過程中用氣相色譜分析樣本時，往往需要20 min以上[16]，本研究采用超高效液相色譜分離，僅僅需要8 min即可，本研究相比于氣相色譜分析[16]檢出限更低。

綜上所述，本研究中樣品處理方法簡單，相對液液萃取方式應用有機溶劑更少、環境友好、分析速度快、分析靈敏度高，適用于實驗室開展其他水質此類農藥等污染物殘留的檢測。利用高分辨質譜可以更準確地定性污染物，再將污染物加入自建的高分辨譜庫，所得到的高分辨圖譜庫可以為日后漁業污染事故鑒定及水產品質量安全風險評估奠定基礎。

表2 六種農藥的線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限和日內日間精密度Tab.2 The linear regression equation,correlation coefficient,linear range,limit of detection,and intraday precision in the six pesticides

圖3 疑似目標物的高分辨質譜的一級質譜全掃描（TOFMS）及二級碎片掃描（TOFMSMS）解析Fig.3 The mass spectrum of suspected compound by TOFMS and TOFMSMS

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Detection of Six Pesticides in Fishery Waters by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

GAO Lei1,QIN Dong-li1,2,WU Song1,HUANG Xiao-li1,CHEN Zhong-xiang1,TANG Shi-zhan1,HUANG Li1,
WANG Peng1
（1.Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China;2.Key Laboratory of Control of Quality and Safety for Aquatic Products,Ministry of Agriculture,Beijing 100141,China）

A rapid detection method of six pesticides in fishery waters by liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）was established,including acetochlor,pretilachlor,butachlor,atrazine,thiamethoxam and difenoconazole.Mixtures of acetonitrile and 0.1% （φ）formic acid solution with different mixing ratio were used as eluants in the elution,and ESI+mode was used,and multi-reaction monitoring mode was employed.The limit of detection,linear range and relative standard deviations of within-and between-day were investigated.In all three spiked levels recoveries of spiked samples were ranged from 78.2%to 104.7%,and the suspected compounds were confirmed by liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometry（LC-Q-TOFMS）,due to its accurate mass,isotopic pattern and MS/MS.A simple solid-phase extraction method was applied to separate the six pesticides,and the analytes were detected by LC-MS/MS and LC-Q-TOFMS.This method was shown to be more accurate and qualitative,and the self-built library provides support for the assessment of fishery pollution accident,and quality and safety risk assessment of fishery products in future.

fishery water;pesticide;LC-MS/MS;LC-Q-TOFMS

X832

A

2017-03-27

中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金（HSY201608）.

高磊（1989-），男，碩士，研究實習員，從事漁業生態環境及水產品質量安全研究.E-mail:gaolei@hrfri.ac.cn

王鵬（1966-），男，副研究員.E-mail:wangpeng@hrfri.ac.cn

1005-3832（2017）04-0044-05