馬鈴薯黑痣病生防菌的篩選鑒定及生長條件研究

馬龍，楊莉莉，馬興，賈蕊鴻，董星辰，邱慧珍*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院/甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730070；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，陜西楊陵712100）

病蟲防治

馬鈴薯黑痣病生防菌的篩選鑒定及生長條件研究

馬龍1，楊莉莉2，馬興1，賈蕊鴻1，董星辰1，邱慧珍1*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院/甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730070；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，陜西楊陵712100）

采用稀釋平板法，從馬鈴薯根際土壤中篩選到1株對(duì)馬鈴薯黑痣病病原菌立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）有良好拮抗效果的生防菌株QHZ-M1，抑菌率達(dá)到59.8%；通過生理生化和16S rDNA鑒定，QHZ-M1與芽孢桿菌屬（Bacillus）同源性高達(dá)99%，且與B.axarquiensis CR-119親緣關(guān)系最近，由此將其鑒定為芽孢桿菌Bacillus axarquiensis。對(duì)其生長條件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，菌株QHZ-M1的生長速率較快，接種20 h后就進(jìn)入穩(wěn)定期，其生長最適溫度為37℃，最適pH 8，最適鹽度＜25 g/L，最適碳源和氮源分別為蔗糖和酵母浸粉。QHZ-M1對(duì)馬鈴薯黑痣病具有較好的防治效果，具有作為生防制劑的潛力。

馬鈴薯；黑痣病；拮抗菌；芽孢桿菌

馬鈴薯糧菜兼用，營養(yǎng)全面，適應(yīng)性廣，是繼玉米、小麥和水稻之后的世界第四大糧食作物[1]。統(tǒng)計(jì)資料顯示，2014年中國馬鈴薯的種植面積和總產(chǎn)量分別達(dá)到564.50萬hm2和9 608萬t，近50年分別增加了4.33和7.44倍[2]。馬鈴薯種植業(yè)已成為中國農(nóng)村收入來源和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的一個(gè)重要支柱產(chǎn)業(yè)。近年來，隨著種植面積的增加，許多馬鈴薯主要產(chǎn)區(qū)由于無法實(shí)現(xiàn)輪作倒茬致使黑痣病的發(fā)生與危害日益嚴(yán)重，嚴(yán)重地塊的發(fā)病率可達(dá)到70%～80%，嚴(yán)重影響了馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)[3,4]，使之成為制約中國馬鈴薯發(fā)展的主要因素之一。

馬鈴薯黑痣病又稱為立枯絲核菌病，是一種真菌性的土傳病害。目前，中國馬鈴薯黑痣病的最常用防治方法是播前藥劑處理和土壤消毒[5,6]，這一方法在一定程度上有效控制了土傳病害的發(fā)生。但是，多年來使用高毒農(nóng)藥導(dǎo)致病原菌對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)生了抗藥性，因此，防治效果越來越差，同時(shí)帶來了一系列的環(huán)境污染；且農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量的增加，將帶來食品安全問題[7]。因此，環(huán)境友好型的生物防治已成為當(dāng)今各類植物病害防治研究的重點(diǎn)[8]。

目前用生物防治方法防治植物病害已有很多研究，李衛(wèi)利等[9]篩選出1株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和1株解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）對(duì)黃瓜白粉病有很好的防治效果，王玲等[10]篩選出一株解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）對(duì)于辣椒青枯病有很好的防治效果。目前，關(guān)于馬鈴薯黑痣病的防治報(bào)道較少，尤其是甘肅省。本研究從甘肅省白銀市連作馬鈴薯田植株周圍耕作層采集土樣，從中篩選出針對(duì)馬鈴薯黑痣病具有生防效果的菌株，旨在為甘肅白銀地區(qū)馬鈴薯黑痣病的生物防治提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 土樣采集

采用隨機(jī)取樣法，每個(gè)小區(qū)選取5個(gè)點(diǎn)（發(fā)病植株旁邊的健康植株），采集馬鈴薯根際0～20 cm處土壤樣品，采樣時(shí)鏟去表土，將帶土植株取出，輕輕抖掉根系外圍土，再用毛刷輕刷粘附在根表面的土壤，混勻裝入自封袋中，編號(hào)，帶回實(shí)驗(yàn)室，保存在-20℃冰箱中，用于拮抗微生物的分離篩選。

1.1.2 供試菌株

菌株QHZ-M1由本試驗(yàn)分離獲得，立枯絲核菌由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：NaCl 5 g、蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.0～7.2。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、NaCl 2.5 g、牛肉膏3 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.0～7.2。

1.2 細(xì)菌的分離純化

稱取土樣5 g，加入裝有45 mL無菌水的150 mL三角瓶中，加入玻璃球，30℃，180 r/min振蕩15 min。取上清液進(jìn)行稀釋，取1.0×10-4，1.0×10-5和1.0× 10-6g/mL的上清液100 μL涂于細(xì)菌固體培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂）上，每梯度重復(fù)3次，于30℃恒溫條件下培養(yǎng)48 h后，篩選并挑取培養(yǎng)特征相異的單個(gè)菌落，純化培養(yǎng)后作為候選生防菌株。

1.3 拮抗菌的篩選

采用PDA平板對(duì)峙法，在平板中央點(diǎn)接立枯絲核菌菌餅，將已分離純化的菌株點(diǎn)接在距離立枯絲核菌菌餅2.5 cm處的4個(gè)點(diǎn)上，以只點(diǎn)接立枯絲核菌菌餅的作為對(duì)照，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。當(dāng)對(duì)照菌餅長滿整個(gè)培養(yǎng)皿，測(cè)定每個(gè)處理的菌落直徑，每處理4次重復(fù)。選取對(duì)立枯病病原菌有較強(qiáng)拮抗作用的拮抗菌株進(jìn)行復(fù)篩，選擇抑制效果比較明顯的菌株[11]。

抑菌率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%。

1.4 拮抗菌株的鑒定

1.4.1 菌株的培養(yǎng)特征及形態(tài)特征鑒定

參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[12]的試驗(yàn)方法，將所篩選的菌株接種于細(xì)菌培養(yǎng)基（LB）上，在28℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)26 h后挑去做革蘭氏染色，培養(yǎng)48 h后觀察菌落的形態(tài)。

1.4.2 拮抗菌的生理生化特征

根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[13]的方法，將篩選的菌株，接種到細(xì)菌液體培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，做生理生化的測(cè)定。

1.4.3 16S rDNA序列測(cè)定及分析

按照細(xì)菌基因組柱式提取試劑盒的方法，提取菌株的基因，以上述所有DNA按照比例稀釋至5 ng/μL作為模板，采用引物27F（5'-AGAGTTTGATCATG GCTCAG-3'）和1492R（5'-GGYTACCTTGTTACG ACTT-3'）對(duì)樣品16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，引物由南京瑞真生物技術(shù)有限責(zé)任公司（Realgene Biotech，Nanjing，China）合成，按照說明書要求添加相應(yīng)的ddH2O將其配置成10 μmol/L的工作液。

PCR反應(yīng)的體系為50 μL，包含：25 μL TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye（TaKaRa，Dalian，China）、27F/1492R（10 μmol/L）引物各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 21 μL。

PCR反應(yīng)條件：95℃5 min；30 cycles（94℃45 s，55℃45 s，72℃1 min）；72℃7 min；4℃Hold。每個(gè)樣品3次重復(fù)，同時(shí)做陰性對(duì)照，以確保試驗(yàn)過程中不存在污染，測(cè)序結(jié)果在NCBI基因庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，并利用MEGA5.1軟件構(gòu)成系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2003作圖，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的分析采用SPSS 22統(tǒng)計(jì)軟件，不同處理間的差異顯著性檢驗(yàn)采用Duncan's新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的篩選

通過對(duì)峙試驗(yàn)獲得對(duì)馬鈴薯黑痣病病原菌生長有強(qiáng)烈抑制作用的細(xì)菌4株（表1），對(duì)峙培養(yǎng)3 d抑菌率分別為59.8%、51.0%、46.6%和44.5%。其中QHZ-M1抑菌效果最佳，對(duì)立枯絲核菌的抑菌帶寬度達(dá)到5.22 mm，抑菌圈半徑＞2.5 cm，抑菌率達(dá)到59.8%（圖1）。表明，菌株QHZ-M1對(duì)馬鈴薯立枯絲核菌有很好的防治效果。

2.2 拮抗菌的鑒定

2.2.1 拮抗菌的形態(tài)特征及生理生化測(cè)定

QHZ-M1在細(xì)菌培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)2 d即可出現(xiàn)明顯的菌落，其菌落呈球形、橢球形或不規(guī)則形，菌落不透明，乳白色，革蘭氏染色為陽性，菌體呈桿狀（圖2）。

表1 對(duì)峙培養(yǎng)3 d后菌株QHZ-M1對(duì)立枯絲核菌的抑制率Table 1 Strain QHZ-M1 inhibition on Rhizoctonia solani growth after three days of confrontation training

圖1 菌株QHZ-M1對(duì)立枯絲核菌生長的影響（3 d）Figure 1 Effect of strain QHZ-M1 on Rhizoctonia solani growth

對(duì)QHZ-M1生理生化特征進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果為葡萄糖為發(fā)酵型，丙二酸鹽、檸檬酸鹽利用為陽性，V-P試驗(yàn)、接觸酶反應(yīng)、產(chǎn)氨試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生均為陽性，可以水解淀粉、明膠、色氨酸、酪氨酸，能夠產(chǎn)生吲哚，苯丙氨酸水解、酒石酸鹽水解、M-P試驗(yàn)均為陰性（表2）。通過自動(dòng)檢索數(shù)據(jù)庫對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行鑒定該菌株屬于芽孢桿菌屬。

圖2 菌株QHZ-M1形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果Figure 2 Morphological identification results of strain QHZ-M1

表2 菌株QHZ-M1生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical property results of strain QHZ-M1

2.2.2 拮抗菌的分子生物學(xué)鑒定

PCR反應(yīng)完成后，采用1.8%瓊脂糖凝膠，0.5× TAE緩沖液條件下電泳檢測(cè)，Marker選用DL 5 000（TaKaRa，Dalian，China）。QHZ-M1的電泳條帶如圖3，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行測(cè)序，得到QHZ-M1的16S rDNA的序列長度為1 411 bp，把菌株QHZ-M1的16S rDNA進(jìn)行BLAST比對(duì)，選擇同源性不低于99%的序列，利用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），結(jié)果表明，QHZ-M1與芽孢桿菌屬同源性高達(dá)99%，與B.axarquiensis CR-119親緣關(guān)系最近，結(jié)合生理生化測(cè)定結(jié)果，初步確定QHZ-M1為芽孢桿菌B.axarquiensis。

2.3 菌株QHZ-M1生長特性

2.3.1 QHZ-M1的生長特征曲線

由圖5可以看出QHZ-M1菌株生長迅速，接種到LB培養(yǎng)基后，很快進(jìn)入對(duì)數(shù)期，在20 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，說明該菌株生長迅速。

2.3.2 QHZ-M1的生長條件研究

從表3中可以看出，菌株QHZ-M1在pH 8時(shí)菌株生產(chǎn)量高于其他pH處理；溫度在37℃時(shí)菌株的生長量顯著高于其他溫度處理；鹽分含量在0～25 g/ L時(shí)菌株生長量顯著高于鹽分＞25 g/L的處理；氮源

是蛋白胨、酵母浸粉和牛肉膏的菌株生長量顯著高于其他氮源處理；碳源是蔗糖的菌株的生長量顯著高于其他碳源處理。因此，菌株生長的最適pH 8；最適溫度是37℃；最適鹽度是0～25 g/L；最適碳源和氮源分別為蔗糖和酵母浸粉。

圖3 QHZ-M1 PCR產(chǎn)物的電泳Figure 3 PCR product electrophoretogram of strain QHZ-M1

圖4 QHZ-M1的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 4 Phylogenetic tree of strain QHZ-M1

表3 QHZ-M1生長條件Table 3 Growth conditions of strain QHZ-M1

圖5 QHZ-M1生長曲線Figure 5 Growth curve of strain QHZ-M1

3 討論

利用微生物代謝產(chǎn)物和有益微生物是防治作物病害的有效防治技術(shù)和方法[14]。耕作層及植物根際土壤中具有豐富的微生物類群，土壤中不缺乏有益拮抗微生物資源。目前，植物病害的生物防治主要集中在芽胞桿菌類群，枯草芽胞桿菌（B.subtilis）、蠟狀芽胞桿菌（B.cereus）、短小芽胞桿菌（B. pumilus）、多粘芽胞桿菌（B.polymyxa）等幾個(gè)種[15]。Zhang等[16]報(bào)道，枯草芽孢桿菌B.subtilis N11可以有效防治香蕉枯萎病的發(fā)生，Cao等[17]研究表明，枯草芽孢桿菌B.subtilis SQR 9可在作物根際定植，可很好的抑制香蕉枯萎病的發(fā)生，發(fā)病幾率降低了49%～61%。孫淑琴等[18]篩選出一株菌株Bs-18，后經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌，該菌株對(duì)于黃瓜白粉病有良好的防治效果，盆栽防治效率可達(dá)到82.22%。

本試驗(yàn)篩選出了1株對(duì)于馬鈴薯黑痣病有拮抗效果相對(duì)最好的菌株QHZ-M1，鑒定為芽孢桿菌（B.axarquiensis），目前關(guān)于芽孢桿菌（Bacillus axarquiensis）的報(bào)道較少。2012年謝永麗等[19]分離得到的菌株中有1株是芽孢桿菌，該菌對(duì)于油菜菌核病病原真菌具有顯著的拮抗效果。楊成德等[20]篩選得到1株芽孢桿菌菌株，對(duì)馬鈴薯枯萎病的抑菌率達(dá)52.21%；曾紅和楊生強(qiáng)[21]篩選出的芽孢桿菌菌株，對(duì)棉花黃萎病病原菌具有較強(qiáng)抑菌活性，抑菌率可達(dá)到78.62%。因此，芽孢桿菌（B.axarquiensis）可作為優(yōu)秀的生物防治菌。

本試驗(yàn)從馬鈴薯根際土壤中篩選得到1株QHZ-M1，對(duì)于馬鈴薯黑痣病病原菌立枯絲核菌有良好的拮抗效果，抑菌率達(dá)到59.8%。通過生理生化和16S rDNA分子生物學(xué)鑒定，菌株QHZ-M1為芽孢桿菌（B.axarquiensis）。通過對(duì)其生長條件的研究，菌株QHZ-M1的生長速度較快，在接種20 h以后就進(jìn)入穩(wěn)定期，生長的最適溫度是37℃，最適pH 8，最適鹽度是0～25 g/L，最適碳源和氮源分別是蔗糖和酵母浸粉。菌株生長的最適條件跟土壤環(huán)境條件相近。菌株QHZ-M1適應(yīng)的溫度、pH和耐鹽度范圍較廣；可利用的碳源和氮源比較廣泛。因此菌株QHZ-M1具有馬鈴薯黑痣病生物防治的潛力。

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新書書訊

由中國農(nóng)業(yè)出版社出版，金光輝、王騰、呂文河撰寫的《黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)及抗病種質(zhì)資源研究》一書于2016年11月正式出版發(fā)行，該書針對(duì)黑龍江省馬鈴薯晚疫病發(fā)生發(fā)病規(guī)律，明確菌群群體遺傳結(jié)構(gòu)，以抗源鑒定研究為重點(diǎn)，利用有效的抗源篩選方法鑒定出重要的馬鈴薯晚疫病抗源。該書是我國馬鈴薯晚疫病研究方面比較全面深入的專著，值得馬鈴薯研究者和生產(chǎn)者擁有和珍藏。每本定價(jià)：45元（包括郵費(fèi)）。

有需購者請(qǐng)聯(lián)系微信號(hào)：tudou772480099，其微信名：馬鈴薯書籍。

Isolation,Identification and Growth Condition of Antagonistic Strains Against Potato Black Scurf

MA Long1,YANG Lili2,MA Xing1,JIA Ruihong1,DONG Xingchen1,QIU Huizhen1＊
(1.College of Resources and Environment,Gansu Agricultural University/Gansu Provincial Key Lab of Aridland Crop Science, Lanzhou,Gansu 730070,China;2.College of Resources and Environment,Northwest Agricultural and Forestry University, Yangling,Shaanxi,712100,China)

A bio-control strain(QHZ-M1)with good antagonistic activity against Rhizoctonia solani of potato black scurf pathogenic bacteria was filtrated from potato rhizosphere soil by plate dilution method.Its inhibition percentage reached 59.8%.Based on the physiological and biochemical characteristics,and 16s rDNA identification,QHZ-M1 had 99% homology with Bacillus and had a close relationship with B.axarquiensis CR-119.Thus,it was identified as B.axarquiensis. Growth conditions of QHZ-M1 were studied and the results showed that the strain growth rate was relatively fast,and reached a stable period after 20 h.The optimal temperature for the growth was 37℃,the optimal pH was 8,the optimal salinity was＜25 g/L,and the optimal carbon and nitrogen source was sucrose and yeast extract powder,respectively. QHZ-M1 has good control effect on potato black scurf disease and potential as bio-control agent.

potato;black scurf;antagonistic bacterium;Bacillus axarquiensis

S532

A

1672－3635（2017）04-0227-07

2016-03-31

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2015CB150501）；國家自然科學(xué)基金（31360500）；國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201103004）；白銀市白銀區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014-5N）。

馬龍（1989-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槟婢趁{迫與植物營養(yǎng)。

邱慧珍，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物營養(yǎng)與營養(yǎng)生態(tài)的教學(xué)與科研工作，E-mail:hzqiu＠gsau.edu.cn。