小檗堿對PCOS模型大鼠子宮內膜的影響

劉逸超，付楊，郭瀅，郭琦，韓鳳娟

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱市第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150056；3.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

小檗堿對PCOS模型大鼠子宮內膜的影響

劉逸超1，2，付楊1，郭瀅1，郭琦1，韓鳳娟3*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱市第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150056；3.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：探討小檗堿對PCOS模型大鼠血清睪酮、子宮內膜相關基因及蛋白信號的影響。方法：90日齡清潔級SD雌性大鼠根據Poretsky造模方法皮下注射胰島素及絨毛膜促性腺激素,連續22日構建PCOS模型。小檗堿灌胃治療28日，采用ELISA法檢測睪酮激素水平，采用免疫組化法檢測子宮內膜組織ERα蛋白表達情況，qRT-PCR技術檢測子宮內膜Kras、PTEN mRNA基因表達水平。結果：與模型組相比，小檗堿組睪酮水平顯著降低(P<0.05)；ERα陽性表達率下降(P<0.05)；Kras、PTEN mRNA表達水平下降(P<0.05)。結論：小檗堿對PCOS模型大鼠子宮內膜有顯著影響，對激素合成、細胞癌變等信號分子具有調控作用。

多囊卵巢綜合征；子宮內膜癌；小檗堿

多囊卵巢綜合征是臨床常見的生殖功能障礙與糖代謝異常并存的內分泌紊亂性疾病，由Stem和Leventhal于1935年首次提出，發病率約占育齡期婦女的10%，目前研究認為胰島素抵抗和高雄激素血癥可能是PCOS發生子宮內膜癌變的高危風險[1]。研究發現,小檗堿具有與二甲雙胍相似的生物學行為，可改善胰島素抵抗，同時具有抑制卵巢細胞分泌雄激素水平的作用[2]，因此本研究選擇小檗堿作為治療藥物，進一步探討小檗堿對PCOS模型大鼠子宮內膜病變的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

小檗堿(上海康九化工有限公司)；二甲雙胍 (Sigma公司)；重組人胰島素注射液(禮來蘇州制藥有限公司)；注射用人絨毛膜促性腺激素 (麗珠集團麗珠制藥廠)；酶聯免疫吸附試驗睪酮檢測試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司)；電化學發光試劑盒(Roche公司)；兔二步法檢測試劑盒(中杉金橋)；ERα(Santa Cruze公司)；PCR 逆轉錄試劑盒(TaKaRa公司)。

1.2 實驗方法

根據Poretsky法[3]建立PCOS大鼠模型，選取 90日齡 SD 雌性大鼠120只，體質量180 g左右。分籠正常飼養，正常飲食水，隨機分為：1)對照組30只，每日皮下注射注射用生理鹽水 0.2 ml，連續注射22日。建模后第23日起每只大鼠給予吐溫-80生理鹽水混合液2 ml灌胃，1次/日，連續灌胃28日。2)模型組、小檗堿組及二甲雙胍組各30只，采用Poretsky法構建PCOS大鼠模型，每只皮下注射HCG 3.0 IU/d;每日皮下注射胰島素,第1日自0.5 IU/d開始，逐漸遞增至6.0 IU/d,并按此劑量維持至第22日。建模第23日起每只大鼠給予吐溫-80生理鹽水混合液2 ml灌胃，每日1次，連續灌胃28日。藥粉均溶在吐溫-80生理鹽水混合液，以小檗堿200 mg/(kg·d)[4]，二甲雙胍300 mg/(kg·d)[5]為灌胃濃度。

1.3 睪酮水平檢測

待藥物干預治療結束，抽取眼眶靜脈血離心后，檢測血清T水平。酶聯免疫吸附試驗試劑盒檢測睪酮。

1.4 ERα蛋白檢測

實驗大鼠斷髓處死后取子宮組織，應用免疫組化檢測ERα蛋白表達情況。

1.5 qRT-PCR技術檢測mRNA相對表達量

各組大鼠斷髓處死后取子宮內膜組織，應用qRT-PCR技術檢測PTEN、Kras mRNA 在各組大鼠子宮內膜組織基因表達情況。使用SYBR Green PCR Master Mix 進行熒光定量PCR 檢測。檢測反應管內的熒光信號到達設定閾值所經歷的循環數(Ct) ，求出基因相對內參基因β-actin表達量的變化ΔCt，即ΔCt=目的基因Ctmean-內參基因Ctmean，計算2-ΔΔCt數值進行統計比較。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠睪酮水平比較

模型組與空白組比較，睪酮分別為(339.33±66.41)、(243.04±69.08)pg/ml，差異極顯著(P<0.01)。小檗堿組與模型組比較，睪酮分別為(206.14±14.63)、(339.33±66.41)pg/ml，差異極顯著(P<0.01)。二甲雙胍組與模型組比較，睪酮分別為(250.67±33.23)、(339.33±66.41)pg/ml，差異極顯著(P<0.01)。結果見表1。

表1 各組大鼠睪酮水平比較

注：與空白組比較，*P<0.01;與模型組比較，△P<0.01。

2.2 雌激素受體α蛋白在子宮內膜的表達情況比較

模型組與空白組比較，ERα蛋白表達陽性率分別為91.67%、16.67%,差異具有統計學意義(P<0.05)。小檗堿組與模型組比較，ERα蛋白表達陽性率分別33.33%、91.67%，差異具有統計學意義(P<0.05)。二甲雙胍組與模型組比較，ERα蛋白表達陽性率分別為25.00%、91.67%，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2和圖1。

表2 雌激素受體α(ERα)表達[n(%)]

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05。

圖1 小檗堿對PCOS模型大鼠子宮內膜ERα蛋白的影響

2.3 PCOS模型大鼠子宮內膜組織Kras mRNA、PTEN mRNA的表達情況比較

模型組與空白組比較，Kras mRNA相對表達量分別為(82.915 9±8.836 7)、(1.000 0±0.000 0),t=-20.728,P=0.000。小檗堿組與模型組比較，Kras mRNA相對表達量分別為(12.432 9±1.872 2)、(82.915 9±8.836 7),t=-17.448,P=0.000；二甲雙胍組與模型組比較，Kras mRNA相對表達量分別為(1.397 0±0.406 6)、(82.915 9±8.836 7),t=-20.606,P=0.000。結果見表3，圖2。

表3 各組大鼠子宮內膜組織Kras mRNA、PTEN mRNA情況比較

注：與空白組比較，*P<0.01;與模型組比較，△P<0.01。

圖2 小檗堿對PCOS模型大鼠子宮內膜Kras mRNA的影響

模型組與空白組比較，PTEN mRNA相對表達量分別為(20.540 9 ±4.701 9)、(1.000 0±0.000 0),t=-9.293,P=0.000。小檗堿組與模型組比較，PTEN mRNA相對表達量分別為(0.168 6±0.264 8)、(20.540 9±4.701 9),t=-9.673,P=0.000；二甲雙胍組與模型組比較，PTEN mRNA相對表達量分別為(0.529 9±0.362 6)、(20.540 9±4.701 9),t=-9.488,P=0.000。結果見表3,圖3。

圖3 小檗堿對PCOS模型大鼠子宮內膜PTEN mRNA的影響

3 討論

多囊卵巢綜合征患者發生子宮內膜癌變的發病率逐年升高[6-10]，研究發現子宮內膜持續受到雌激素的刺激、高胰島素血癥以及肥胖是促使形成子宮內膜癌變的重要因素[11]。Harding等研究發現,在子宮內膜癌發病的影響因素里胰島素抵抗發揮著非常重要的作用，甚至與因接觸外源性雌激素導致子宮內膜癌變的患者相比，胰島素抵抗患者更具有發生子宮內膜癌變的高危風險[12]。Shafiee進行一項回顧性研究評估PCOS患者子宮內膜癌發病的機制，可能是通過分子級細胞調控的，胰島素樣生長因子及胰島素樣生長因子結合蛋白的功能被激活，導致胰島素水平升高，通過激活PI3K/AKT及Ras/MAPK信號通路，加速細胞有絲分裂的作用[13]。基因組學和蛋白組學已經證實在PCOS患者子宮內膜組織里胰島素信號傳導通路影響子宮內膜癌變的基因和蛋白，其表達均上調[14]。Savaris研究也指出,過度激活PCOS子宮內膜MAPK/ERK信號傳導通路，可以導致PCOS發生子宮內膜病變，而激活MAPK/ERK信號傳導通路是由胰島素抵抗和高胰島素血癥調控的[15]。

胰島素增敏劑二甲雙胍通過改善胰島素抵抗，可以逆轉子宮內膜的增生，降低PCOS發生子宮內膜癌變的風險。Engelman等研究認為,二甲雙胍作為胰島素增敏劑，通過改善胰島素敏感性，減輕體質量，可阻止PCOS患者發展成子宮內膜癌，臨床上可以顯著阻止癌癥細胞的癌變[16]。國內外學者已經將具有胰島素增敏作用的二甲雙胍作為治療子宮內膜癌的參考用藥。動物實驗及臨床試驗已經證實,二甲雙胍可以阻止子宮內膜增生，在使增生的子宮內膜組織恢復正常的過程中起到積極地調控作用[17]。

Hsu等通過研究發現,小檗堿可以改善AKT/PI3K信號通路，改善胰島素信號傳導，顯著改善胰島素抵抗[18]。同時小檗堿具有植物性抗癌成分，作為從植物中提取的生物堿，具有廣泛的生物學活性，可以治療多種疾病。子宮內膜病變與雌孕激素長期刺激密切相關，本研究發現小檗堿可以顯著降低雌激素受體α蛋白的表達，使雌激素的生物學功能在子宮內膜局部的作用降低，減少雌激素對子宮內膜的持續刺激，降低發生癌變的風險。本實驗通過檢測甾體激素水平發現,小檗堿具有降低睪酮水平的作用，并且小檗堿降低雄激素睪酮的療效優于二甲雙胍。本實驗為研究PCOS相關子宮內膜癌變的作用機制，選取原癌基因Kras和抑癌基因PTEN作為研究指標。小檗堿可以使PCOS模型大鼠子宮內膜組織Kras和PTEN mRNA表達均下降，與二甲雙胍作用趨勢是一致的。PTEN mRNA表達下降的原因可能是PTEN廣泛影響細胞功能，細胞內PTEN表達降低，可能使更多的AKT蛋白發生磷酸化反應，使胰島素信號通路發生變化，PTEN編碼的蛋白具有酪氨酸磷酸化特性，可以負反饋調節與癌變相關的信號通路[19]。因此，小檗堿通過增加胰島素敏感性，改善胰島素抵抗，抑制細胞增殖，對甾體激素合成、細胞增殖、內膜癌變等信號分子具有調控作用,可以防治PCOS發生子宮內膜癌變。

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EffectofBerberineontheEndometriaofthePCOSRats

LIUYi-chao1,2,FUYang1,GUOYing1,GUOQi1,HANFeng-juan3*

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 2.TheSecondHospitalofHarbin,Harbin150056China; 3.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective:To explore the influence of Berberine on testosterone level and the expressions of endometrial gene and its protein in rats with polycystic ovarian syndrome (PCOS). Methods:120 female Sprague-Dawley rats of 90 days were made into PCOS models with 22-day subcutaneous injection of insulin and human chorionic gonadotropin(HCG). After modeling, Berberine was given to rats in the next 28 days. The testosterone levels was tested by ELISA method; the protein expression of endometrial estrogen receptor α(Era) was detected with immunohistochemical method; the expression levels of endometrial Kras and PTEN mRNA gene were detected with qRT-PCR technique. Results:Compared to the model group, the testosterone level in Berberine group was significantly decreased(P<0.05); the positive protein expression of Era, and the gene expressions of Kras and PTEN mRNA were significantly reduced in endometrial tissue(P<0.05). Conclusion: Berberine has significant effects on the endometria of PCOS rats, which regulates the hormone synthesis and cell carcinoma.

Polycystic ovary syndrome(PCOS); Endometrial carcinoma; Berberine

國家中醫藥管理局國家中醫臨床研究基地業務建設科研專項課題(No.JDZX2012038)

劉逸超(1983-)，女，黑龍江中醫藥大學中醫婦科學專業博士研究生，主治醫師，主要研究方向：中醫治療婦科疾病。

韓鳳娟*(1971-)，女，主任醫師，博士研究生導師，主要研究方向：婦科腫瘤。

2017-03-15

修回日期：2017-04-10

R285.5

：A

：1002-2406(2017)05-0016-04