HPLC-PDA法同時測定痛瀉要方中五種有效成分

王艷宏，張秋樾，歷凱，王智，旺建偉*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱市食品藥品監督管理局，黑龍江 哈爾濱 150036；3.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150001)

質量工藝

HPLC-PDA法同時測定痛瀉要方中五種有效成分

王艷宏1，張秋樾1，歷凱2，王智3，旺建偉1*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱市食品藥品監督管理局，黑龍江 哈爾濱 150036；3.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150001)

目的：建立HPLC-PDA方法同時測定痛瀉要方水煎液中白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，芍藥苷，芍藥內酯苷五種有效成分的含量。方法：采用Thermo Fisher C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱，白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，芍藥苷，芍藥內酯苷以乙腈(A)-水(B)為流動相梯度洗脫，運行時間：32 min；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：白術內酯Ⅰ及白術內酯Ⅲ為222 nm，白術內酯Ⅱ為278 nm；芍藥苷、芍藥內酯苷為232 nm；進樣量：10 μL。結果：對檢測結果進行線性考察，以峰面積(Y)與濃度(X)進行線性回歸，結果表明白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在0.032～0.320μg之間線性關系良好，芍藥苷、芍藥內酯苷在0.6～6.0μg之間線性關系良好(r≥0.999 5)，平均加樣回收率分別為：100.16%(RSD=2.7%)，100.01%(RSD=1.7%)，99.95%(RSD=1.5 %)，99.57%(RSD=0.5%)，99.34%(RSD=0.9%)；供試品在24 h內穩定；痛瀉要方中白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，芍藥苷，芍藥內酯苷含量分別為(n=3)：0.043 6、0.037 0、0.155 7、4.688 7、1.524 5 mg/g。結論：建立HPLC-PDA方法可同時測定痛瀉要方中白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，芍藥苷，芍藥內酯苷的含量，該方法簡單便捷，重復性好，可用于痛瀉要方的質量控制評價。

HPLC-PDA；痛瀉要方；白術內酯Ⅰ；白術內酯Ⅱ；白術內酯Ⅲ；芍藥苷；芍藥內酯苷

痛瀉要方又名白術芍藥散，為《景岳全書》所載經典名方，由白術(炒)、白芍(炒)、陳皮、防風等四味中藥組成。方中白術健脾燥濕,白芍緩急止痛,陳皮理氣和中,防風散肝舒脾;四藥相配，可以補脾土而瀉肝木，調氣機以止痛瀉，能夠治療腹痛泄瀉，結腸炎。有研究表明對治療肝郁脾虛型腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome，IBS)有著獨特的優勢[1-4]。

目前已有大量文獻研究報道了痛瀉要方的藥理作用及其治療腸易激綜合征的機制(調節腦腸軸、改善內臟感覺高敏感、調節免疫功能、抑制腸道平滑肌收縮、調控水通道蛋白表達、保護腸黏膜屏障等)[5-6]，而對于其質量控制研究較少見。通過對中藥材，飲片，提取物，單方及復方制劑中的質量標志物進行定性定量分析來實現對中藥的質量控制已被廣泛接受[7-9]，在該復方中白術-白芍藥對為該方發揮療效的重要支撐[10]，因而本文將白術、白芍中的主要有效成分白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，芍藥苷，芍藥內酯苷定為目標成分，首次采用HPLC-PDA方法對痛瀉要方水煎液中上述五種成分進行同時定量分析，實現對痛瀉要方的質量控制研究，為相關質量控制提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑

Thermo fisher Ultimate 3000 UHPLC高效液相色譜儀(美國Thermo fisher科技有限公司)；ALC110.4十萬分之一電子天平(北京賽多利斯系統有限公司)；KQ-800KDE超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)；RE52CS-2旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵、B-260恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)。

分析甲醇(批號20160322，天津市富宇精細化工有限公司)；色譜乙腈(批號R141201，50101 DiKMA 美國)；蒸餾水(批號20160516，屈臣氏)。

1.2 對照品與供試藥材

對照品白術內酯Ⅰ(批號111975-201501)、白術內酯Ⅱ(批號111976-201501)、白術內酯Ⅲ(批號111978-201501)、芍藥苷(批號150726)，中國食品藥品檢定研究院，質量分數均≥98%；芍藥內酯苷(批號wkq16060804)，四川省維克奇生物科技有限公司，質量分數≥98%。

白術、白芍、陳皮和防風藥材均購自哈爾濱市盛泰中藥飲片廠，經黑龍江中醫藥大學藥學院孫慧峰教授鑒定,為菊科植物白術(AtractylodesmacrocephalaeKoidz)的干燥根莖，毛茛科植物芍藥(PaeoniaelactifloraPall.)的干燥根，蕓香科植物橘(CitrireticulataeBlanco)的干燥成熟果皮，傘形科植物防風(Saposhnikoviaedivaricata (Turcz.)Schischk.)的干燥根。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備

分別稱取白術81 g，白芍54 g，陳皮41 g，防風27 g，用10倍量的蒸餾水浸泡0.5 h后煎煮2次，第1次煎煮1.5 h，第2次煎煮1 h，合并兩次濾液，減壓回收至干，取0.5 g精密稱定，加甲醇適量超聲溶解，定容至5 mL，經0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.2 混合對照品溶液的制備

分別取白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，芍藥苷、芍藥內酯苷對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解制成含白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ0.16 mg/mL，含芍藥苷，芍藥內酯苷3.00 mg/mL的混合對照品儲備液，4℃冰箱儲存備用。

2.1.3 陰性對照品溶液的制備

白術中含有白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，白芍中含有芍藥苷和芍藥內酯苷，按處方分別制備不含白術、白芍的供試品，按“2.1.1”項下方法制備陰性供試品溶液。

2.2 色譜條件及系統適應性

色譜柱：Thermo Fisher C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)，流動相為乙腈(A)-水(B)梯度洗脫：0～8 min：90%～80% B，8～10 min：80%～70%B，10～13 min:70%～40%B，13～23 min：40%～30%B，23～26 min：30%～20%B，26～28 min：20%～60%B，28～30 min：60%～90%B，30～32 min：90%B；運行時間：32 min；柱溫：30℃；流速：1.0 ml/min；檢測波長：白術內酯Ⅰ及白術內酯Ⅲ為222 nm，白術內酯Ⅱ為278 nm，芍藥苷，芍藥內酯苷為232 nm；進樣量：10 μl。取混合對照品溶液，供試品溶液，陰性樣品溶液在上述色譜條件下進行分析，色譜圖見圖1，理論塔板數均>7 000。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察

精密吸取“2.1.2”項下混合對照品儲備液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0 ml置于10 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到系列質量濃度的混合對照品溶液，在“2.2”條件下進樣分析，以峰面積(Y)對質量濃度(X)進行線性回歸，得回歸方程，結果見表1。表明各成分在線性范圍內線性關系良好。

表1 5種成分線性關系

2.3.2 專屬性試驗

精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液各10 μl，在“2.2”條件下進樣分析，發現陰性供試品與對照品色譜圖相比，在相應的保留時間處陰性供試品未見吸收峰，表明處方中其他藥味對測定結果無干擾，色譜圖結果見圖1。

圖1 HPLC色譜圖注：1.芍藥內酯苷；2.芍藥苷；3.白術內酯Ⅲ；4.白術內酯Ⅰ；5.白術內酯Ⅱ。

2.3.3 精密度試驗

精密吸取“2.1.2”下的混合對照品溶液10 μl，在“2.2”色譜條件下連續進樣6次 ，測得白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，芍藥苷、芍藥內酯苷峰面積的RSD(n=6)值分別為0.4%，0.5%，0.3%，0.6%，0.4%，結果表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗

取同一批次痛瀉要方樣品(150505)6份，每份0.5 g，按“2.1.1”條件制備供試品溶液，在“2.2”色譜條件下進樣，計算白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，芍藥苷、芍藥內酯苷含量的RSD(n=6)值分別為1.2%，1.5%，1.6%，1.3%，1.8%，結果表明該方法重復性良好。

2.3.5 穩定性試驗

取痛瀉要方供試品溶液分別在0、2、4、6、12和24 h按“2.2”色譜條件下進行測定，計算白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，芍藥苷、芍藥內酯苷的峰面積的RSD值均小于2.0%,結果表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.6 加樣回收試驗

取同批(150601)已知白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、芍藥苷、芍藥內酯苷含量的痛瀉要方樣品6份，每份0.25 g，加入含有白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，芍藥苷，芍藥內酯苷濃度分別為10.18 μg/mL、9.28 μg/mL、27.95 μg/mL、1 000.53 μg/mL、383.78 μg/mL的混合對照品1 mL。按“2.1.1”條件下制成供試品溶液，按“2.2”色譜條件進行測定，計算平均回收率，結果痛瀉要方中白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，芍藥苷、芍藥內酯苷的平均加樣回收率分別為100.16%(RSD=2.7%)，100.01%(RSD=1.7%)，99.95%(RSD=1.5 %)，99.57%(RSD=0.5%)，99.34%(RSD=0.9%)，結果見表2。

2.3.7 樣品含量測定

將5批痛瀉要方樣品，平行稱量3份，每份0.5 g，按“2.1.1”制成的供試品溶液，取10 μl，在“2.2”條件下進樣分析，通過回歸方程，計算含量(mg/g)，結果見表3。

3 討論

本研究在提取方式上選取傳統的水煎液方式。最傳統的中藥劑型有膏、丹、丸、散、湯，千百年來沿用至今，而目前中藥湯劑依然是中藥給藥的主流途徑，原因是其價格較中成藥，中藥顆粒劑廉價，患者可自制，方便易得[11]，另外通過有效成分的定量定性分析來實現復方水煎液的質量控制的相關報道較少，故本文采用最傳統的水煎液的提取方式。在色譜條件選擇方面，通過比較甲醇-水，甲醇-0.1%磷酸，乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸，發現在乙腈-水條件下，五種有效成分的峰形，分離度較好，干擾較少，又因五種成分的極性不同，故本文選用在乙腈-水的條件下梯度洗脫的方式。在波長選擇方面，根據在210～400 nm范圍內的五種成分紫外吸收情況，結果發現白術內酯Ⅰ、Ⅲ在222 nm處有最大吸收，白術內酯Ⅱ在278 nm處有最大吸收，芍藥內酯苷和芍藥苷在232 nm處有最大吸收，與文獻報道一致[12-14]，故選用“2.2”項下的檢測波長進行測定。

表2 加樣回收率試驗結果(n=6)

表3 樣品含量測定結果(mg/g，n=3)

本實驗采用HPLC-PDA法首次嘗試對痛瀉要方水煎液中白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、芍藥苷、芍藥內酯苷的含量同時測定，結果表明該方法快速簡捷，準確可靠。含量測定結果顯示不同批次藥材之間測得的復方中有效成分的含量存在差異，也會導致療效存在差異[15-16]，這與藥材源于不同的產地，藥材質量有關，大量文獻總結可得出相同的結論[17-18]，這為藥材的選擇優化提供科學依據。

綜上所述，本實驗建立的HPLC-PDA法能夠同時測定上述五種有效成分的含量，快速準確，重復性良好，可用于痛瀉要方的質量控制研究。

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SimultaneousDeterminationofFiveEffectiveConstituentsinTongxieYaofangbyHPLC-PDA

WANGYan-hong1,ZHANGQiu-yue1,LIKai2,WANGZhi3,WANGJian-wei1*

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 2.HarbinFoodandDrugAdministration,Harbin150036,China;3.TheSecondAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150001,China)

Objective:To establish an HPLC-PDA method for the simultaneous determination of five effective constituents(atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III, paeoniflorin, and albiflorin)in Tongxie Yaofang decoction. Method:The column of Thermo Fisher C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm) was used, atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III, paeoniflorin and albiflorin were eluted with acetonitrile (A)-water (B) as the gradient mobile phase; running time was 32mins; column temperature was 30℃; and the flow rate was 1.0 mL/min; the detection wavelengths were set at 222nm for atractylenolide I and atractylenolide III, 278nm for atractylenolide II, and 232nm for paeoniflorin and albiflorin; and the sample size was 10 μL. Results: Linear investigation of test results was performed with peak area (Y) and concentration (X), the result showed that the atractylenolide I, atractylenolide II, and atractylenolide III had good linearity in the range of 0.032～0.320 μg and paeoniflorin and albiflorin were at 0.6～6.0 μg (r≥0.999 5); The average recoveries were 100.16%(RSD=2.7%),100.01%(RSD=1.7%),99.95%(RSD=1.5 %),99.57%(RSD=0.5%),and 99.34%(RSD=0.9%); the sample solution was stable within 24h, and the contents were 0.0436, 0.0370, 0.1557, 4.6887, 1.5245(mg/g). Conclusion:The established method for determination of atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III, Paeoniflorin, and Albiflorin was accurate and reliable, it can be used for quality control of Tongxie Yaofang.

HPLC-PDA; Tongxie Yaofang; AtractylenolideⅠ; AtractylenolideⅡ; AtractylenolideⅢ; Paeoniflorin; Albiflorin

國家自然科學基金面上項目(No.81573870)；中國博士后科學基金第八批特別資助項目(No.2015T80376)；黑龍江省自然科學基金(面上項目)(No.H2015020)；黑龍江中醫藥大學優秀創新人才支持計劃資助(優秀青年學術帶頭人)(No.051217)

王艷宏(1972-)，女，博士，教授，碩士研究生導師，主要研究方向：中藥制劑新技術、新劑型研究。

旺建偉*(1974-)，女，博士，教授，碩士研究生導師，主要研究方向：中藥基本理論及組方配伍規律研究。

2017-01-20

修回日期：2017-02-07

R28

：A

：1002-2406(2017)05-0020-04