糖腎降濁顆粒對糖尿病腎病大鼠腎組織AGEs和轉(zhuǎn)移因子β1的影響及作用機制探討

徐孝旺，徐孝興

(1.唐山市古冶區(qū)中醫(yī)院，河北 唐山 063101；2.華北理工大學(xué)，河北 唐山 063100)

糖腎降濁顆粒對糖尿病腎病大鼠腎組織AGEs和轉(zhuǎn)移因子β1的影響及作用機制探討

徐孝旺1，徐孝興2

(1.唐山市古冶區(qū)中醫(yī)院，河北 唐山 063101；2.華北理工大學(xué)，河北 唐山 063100)

目的：探討糖腎降濁顆粒對糖尿病腎病大鼠腎組織糖基化終產(chǎn)物(AGEs)及轉(zhuǎn)移因子β1的影響，探討其治療糖尿病腎病的作用機制。方法：采用鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射制備糖尿病腎病大鼠模型，隨機分為模型組、西藥組、中藥組，給藥8周后采用免疫組化法檢測各組大鼠腎組織中AGEs及TGF-β1的水平，比較血尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、尿蛋白(Pro)水平及腎組織C-反應(yīng)蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量。結(jié)果：中藥組腎組織中AGEs及轉(zhuǎn)移因子β1明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。中藥組大鼠BUN、SCr和Pro水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。中藥組大鼠CRP、IL-6和TNF-α含量顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：糖腎降濁顆粒能夠減少糖尿病腎病模型大鼠AGEs及TGF-β1表達，降低炎癥反應(yīng)，延緩腎臟損傷。

糖腎降濁顆粒；AGEs；TGF-β1；早期糖尿病腎??；炎癥因子

糖尿病腎病發(fā)生與長期高糖狀態(tài)導(dǎo)致體內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)而形成不可逆的晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glyclation end-products,AGEs)引發(fā)生物學(xué)效應(yīng)，對轉(zhuǎn)移因子β1的合成有直接促進作用，是糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)發(fā)病機制中最主要因素[1-3]。轉(zhuǎn)移因子β1具有腎臟結(jié)構(gòu)改變，加速腎臟纖維化作用[4-5]。通過免疫組織化學(xué)方法檢測糖腎降濁顆粒對糖尿病腎病模型大鼠腎臟AGEs和TGF-β1、腎功能指標(biāo)和炎癥因子的影響，探討糖腎降濁顆粒對糖尿病腎臟大鼠的腎臟保護作用及其作用機理。

1 材料與方法

1.1 藥物

糖腎降濁顆粒組成：黃芪15 g，酒大黃10 g，丹參15 g，茵陳10 g，赤芍10 g，知母15 g，黃連10 g，干姜10 g，水蛭粉3 g;免煎顆粒(天津紅日康仁堂藥業(yè)有限公司，批號14021821)。貝那普利片(10 mg/片，北京諾華制藥有限公司，批號20140518)。

1.2 試劑與儀器

注射鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)；免疫組化用兔抗大鼠AGEs受體試劑盒(北京奧博生物技術(shù)有限公司)；TGF-β1(BA0290，武漢博士德生物技術(shù)有限公司)；CRP、IL-6和TGF-β1試劑盒(南京建成生物科技公司)；OLYMPUSAU5400全自動生化分析儀(日本奧林巴斯有限公司)；ELx800酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)。

1.3 動物模型建立及分組

1.3.1 模型建立

40只大鼠，體質(zhì)量(200g±20)g,采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合大鼠尾靜脈一次性注射鏈脲佐菌素(STZ)42 mg/kg的造模方法[6]。高脂飼料配方：2.5%膽固醇，10%豬油脂，20%蔗糖，1%膽酸鹽，5%蛋黃粉，61.5%基礎(chǔ)飼料。喂養(yǎng)8周，分別于4、8周用代謝籠收集24 h尿液，測24 h尿蛋白定量。4周后成功制備動物模型，導(dǎo)致微量白蛋白尿的出現(xiàn)。注射STZ后72 h，測定空腹血糖≥16.7 mmol/L,為糖尿病造模成功。4周后再測尿微量白蛋白，24h尿蛋白定量≥30 mg判定為DN大鼠造模成功。造模成功共30只大鼠。

1.3.2 分組和給藥

4周后，采用隨機數(shù)字表法將30只糖尿病腎病模型大鼠隨機分為3組，模型組10只，西藥組10只，中藥組10只。模型組給予生理鹽水灌胃，中藥組按照正常成人劑量(g/kg)的6.3倍灌胃給藥。西藥組給予貝那普利灌胃，給藥量按照正常成人給藥量等效量換算成年大鼠給藥量，即0.9 mg/(kg·d)，灌胃劑量均為5 ml/kg。連續(xù)給藥8周，每日1次。

1.4 檢測指標(biāo)

大鼠的腎組織經(jīng)甲醛固定，石蠟切片，進行AGEs、TGF-β1免疫組化檢測。采用免疫組織化學(xué)染色法(SABC法)檢測腎組織中的AGEs、TGF-β1。顯色結(jié)果以高清晰度彩色分析系統(tǒng)分析，在400×高倍鏡下，隨機選取10個不連續(xù)視野，計算平均光密度值。

大鼠眶下靜脈取血2 ml，采用全自動生化分析儀測定血尿素氮(BUN)、肌酐(SC)、尿蛋白(Pro)等腎功能指標(biāo)水平。

取腎組織約100 mg，PBS 緩沖液漂洗，除去血液，稱重。加入10倍的PBS緩沖液研碎腎組織，制備腎組織勻漿。腎組織勻漿3 000 r/min離心15 min，取上清，-80℃保存待用。采用Elisa法檢測腎組織 C-反應(yīng)蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量，設(shè)3個復(fù)孔，嚴(yán)格按產(chǎn)品說明書進行操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠AGEs和 TGF-β1表達情況比較

中藥組腎組織中AGEs及轉(zhuǎn)移因子β1明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。中藥組腎組織中AGEs及轉(zhuǎn)移因子β1與西藥組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠AGEs和 TGF-β1表達比較(平均光密度值

注：與模型組比較，aP<0.05;與西藥組比較，bP>0.05。

2.2 各組大鼠腎功能指標(biāo)情況比較

中藥組大鼠經(jīng)中藥治療后BUN、SCr和Pro水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。中藥組BUN、SCr和Pro水平與西藥組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠BUN、SCr和Pro情況比較

注：與模型組比較，aP<0.05;與西藥組比較，bP>0.05。

2.3 各組大鼠炎癥因子比較

中藥組大鼠CRP、IL-6和TNF-α含量顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。中藥組大鼠CRP、IL-6和TNF-α含量與西藥組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠炎癥因子含量比較

注：與模型組比較，aP<0.05;與西藥組比較,bP>0.05。

3 討論

糖尿病腎病屬中醫(yī)學(xué)“消渴”“虛勞”“水腫”等范疇，早期糖尿病腎病明顯的證候是“瘀證”。糖尿病腎病的主要病機是以脾腎氣陰兩虛為本，以血瘀阻滯為標(biāo)，病變部位在絡(luò)脈，血瘀為直接因素[7-12]。炎癥參與糖尿病腎病發(fā)病，CRP、IL-6等炎癥標(biāo)志物升高，代謝紊亂與血流動力學(xué)異常是炎癥持續(xù)進展關(guān)鍵因素[13]。本研究通過腎組織中AGEs、TGF-β1表達情況,腎功能BUN、SCr、Pro水平和CRP、IL-6和TNF-α含量的對比研究，旨在探討糖腎降濁顆粒治療糖尿病腎病大鼠的作用機制。

TGF-β1是纖維化的中心環(huán)節(jié)，參與成纖維細胞的活化、增生和表型轉(zhuǎn)化及細胞外基質(zhì)增多的過程[14];AGEs對腎臟有直接毒性作用。研究表明，糖尿病腎組織中TGF-β1上調(diào)與AGES的增加關(guān)系密切，將AGEs注入正常鼠體內(nèi)，4周后發(fā)現(xiàn)腎小球細胞外基質(zhì)和表達產(chǎn)物均有明顯增加，AGEs可以促進腎臟合成、分泌TGF-β1[15]。

糖腎降濁顆粒中黃芪補脾益氣，溫運陽氣，益于消渴本身血瘀阻絡(luò)的治療，仝教授[16]善用黃芪祛瘀排濁;丹參活血逐瘀;水蛭通絡(luò)消瘀,血脈通暢，濕濁排瀉。茵陳歸脾胃，肝膽經(jīng)，主要化學(xué)成分為香豆素類,香豆素有擴血管、降血脂，抗凝血作用,對實驗性高膽固醇血癥家兔，茵陳煎劑組較對照組的血脂明顯下降，動脈壁粥樣硬化減輕，內(nèi)臟脂肪沉著減少，主動脈壁膽固醇含量減低[17]。知母、赤芍主治煩熱消渴，大便燥結(jié)，小便不利。王好古曰：“瀉肺火，滋腎水，治命門相火有余”?，F(xiàn)代研究也表明知母有較好的降血糖作用[18]。黃連可清泄中焦胃熱及諸臟之熱，使熱退則消谷減，火退則消渴愈，熱苦能治甜，使血糖得以調(diào)整。干姜性辛，溫，佐治黃連、知母過于苦寒，涼膩?！翱嗨嶂铺稹敝纹錁?biāo)，直接針對高血糖[19]。

本研究結(jié)果可見，中藥組腎組織中AGEs及轉(zhuǎn)移因子β1明顯低于模型組，BUN、SCr和Pro水平顯著低于模型組，CRP、IL-6和TNF-α含量顯著低于模型組。經(jīng)過糖腎降濁顆粒治療后大鼠腎組織中AGEs及轉(zhuǎn)移因子明顯減少，BUN、SCr和Pro水平顯著降低，CRP、IL-6和TNF-α含量顯著降低。因此，可以推測糖腎降濁顆粒具有抑制DN大鼠腎臟蛋白非酶糖基化作用，使AGEs積累減少、TGF-β1的表達下調(diào)，降低腎臟組織損害，減輕炎癥反應(yīng)，提示糖腎降濁顆粒對腎臟具有明顯的保護作用。

[1] 杜月光,高宗磊,柴可夫,等.早期糖尿病腎病“氣陰兩虛，絡(luò)脈瘀阻”病機與AGE-RAGE軸相關(guān)性研究[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2016,40(2):75-80.

[2] 劉彩紅,郭志鵬,閆峰,等.SDS-AGE在糖尿病腎損傷診斷中的應(yīng)用[J].山東醫(yī)藥,2014,54(11):100-101.

[3] 許兆忠,王明,王艷靖,等.硝基酪氨酸對糖尿病腎病大鼠腎臟NF-κB、MCP-1及TGF-β1表達的影響[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2013,33(3):346-350.

[4] 劉圣,陳象青,唐麗琴,等.復(fù)方黃連膠囊對早期糖尿病腎病大鼠腎組織TGF-β1/BMP-7表達失衡及其Smad信號通路的調(diào)控作用[J].中國中藥雜志,2015,40(5):938-945.

[5] 田雪,于倩,張捷,等.糖尿病大鼠腎組織中PPAR-γ對TGF-β1、c-Ski調(diào)控作用的研究[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2013,19(1):31-35.

[6] 郭維文,黎帥,陳玲玲,等.黃芪甲苷對糖尿病腎病大鼠腎臟的保護作用及其機制[J].中國病理生理雜志,2014,30(2):351-354.

[7] 文利,陳蕾,孫一碹,等.柚皮素通過抑制TGF-β1/smad信號傳導(dǎo)通路緩解糖尿病腎病大鼠腎損傷[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2016,36(7):896-901.

[8] 李鳳婷,李夢,王馨瑤,等.固本通絡(luò)湯對糖尿病腎病模型大鼠TGF-β1、MMP-9、TIMP-1表達的影響[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2014,35(1):118-121.

[9] 金麗霞,金麗軍,宋立群,等.基于三焦氣化理論辨治糖尿病腎病[J].中醫(yī)藥信息,2017,34(1):44-46.

[10] 楊文軍,錢秋海.錢秋海教授采用溫腎解毒化積法治療糖尿病腎病探析[J].中醫(yī)藥信息,2015,32(6):56-58.

[11] 周妍,王曉婷.益氣養(yǎng)陰化痰通絡(luò)方治療糖尿病腎病臨床觀察[J].中醫(yī)藥學(xué)報,2015,43(2):132-134.

[12] 徐艷秋,黃芳,王怡.因虛致瘀理論與糖尿病腎病[J].中醫(yī)藥學(xué)報,2014,42(1):7-8.

[13] 劉國玲,沈永杰,尤麗菊,等.雷公藤多苷降低糖尿病腎病大鼠炎性細胞因子的表達[J].細胞與分子免疫學(xué)雜志,2014,30(7):721-724.

[14] 馮英,胡昭,張佼佼,等.糖尿病腎病大鼠腎組織中TSP-1、TGF-β、APP、VEGF、ColⅠ的表達及意義[J].山東醫(yī)藥,2013,53(28):5-8.

[15] 亞莉,馮婕,姜莎莎,等.單核細胞趨化蛋白-1和轉(zhuǎn)化生長因子β1及結(jié)締組織生長因子在2型糖尿病腎病大鼠腎組織中的表達[J].中國全科醫(yī)學(xué),2013,16(21):2473-2476.

[16] 王涵.周強,仝小林,等.仝小林治療糖尿病并發(fā)癥應(yīng)用黃芪經(jīng)驗[J].環(huán)球中醫(yī)藥雜志,2013,4(6):272-274.

[17] 徐孝旺.糖腎降濁顆粒治療糖尿病腎病76例療效觀察[J].中國繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育,2015,7(15):180-181.

[18] 吳瑩,宋澤璧,高慧,等.知母鹽制前后降血糖作用及其機制[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2014,34(23):1977-1980.

[19] 吳瑩,高慧,宋澤璧,等.鹽知母不同有效部位改善鏈脲佐菌素誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠糖代謝的研究[J].現(xiàn)代藥物與臨床,2016,31(3):280-283.

EffectandMechanismofTangShenJiangZhuoGranuleonAGEsandTGF-β1inDiabeticNephropathyRats

XUXiao-wang1，XUXiao-xing2

(1.GuyeDistrictHospitalofTraditionalChineseMedicine,Tangshan063101,China；2.NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063100,China)

Objective:To observe the influences of Tangshen Jiangzhuo granule on advanced glycation end products(AGEs) and transforming growth factor β1(TGF-β1) in the nephridial tissues of diabetic nephropathy(DN) rats. Methods:Streptozotocin(STZ) was used to establish the DN model in rats by intraperitoneal injection. The rats were randomized into the model group, the western medicine group, and Chinese medicine group. After eight weeks, the content of AGEs and TGF-β1 were detected by immunohistochemical method. The levels of BUN(urea nitrogen), SCr(creatinine), Pro(urine protein)in blood, as well as CRP (C- reactive protein), IL-6 and TNF-α in kidney tissues were tested. Results:The contents and levels of AGEs, TGF-β1, BUN, SCr, Pro, CRP, IL-6, and TNF-a in the Chinese medicine group were all significantly lower than those of the model group(P<0.05). Conclusion:Tangshen Jiangzhuo granule may reduce the expressions of AGEs and TGF-β1, and depress the inflammatory responses to delay kidney damages.

Tangshen Jiangzhuo granule; AGEs; TGF-β1; Early diabetic nephropathy; Inflammatory factors

河北省中醫(yī)藥管理局科研計劃(No.2016236)

徐孝旺(1981-)，女，主治醫(yī)師，主要研究方向：中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)科。

2016-08-24

修回日期：2016-09-10

R285.5

：A

：1002-2406(2017)05-0034-03