四株解磷菌分泌有機酸與溶解磷酸三鈣能力的研究

劉勝亮，朱舒亮，祁先慧，李曉原，張富瑋，楊文英，李建貴,3

(1.新疆農業大學林業研究所，烏魯木齊 830052；2.新疆農業大學/新疆紅棗工程技術研究中心，烏魯木齊 830052；3.新疆農業大學2612團隊，烏魯木齊 830052)

四株解磷菌分泌有機酸與溶解磷酸三鈣能力的研究

劉勝亮1,2，朱舒亮1,2，祁先慧1,2，李曉原1，張富瑋1，楊文英1，李建貴1,2,3

(1.新疆農業大學林業研究所，烏魯木齊 830052；2.新疆農業大學/新疆紅棗工程技術研究中心，烏魯木齊 830052；3.新疆農業大學2612團隊，烏魯木齊 830052)

【目的】研究解磷細菌溶解難溶性磷酸鹽及溶磷過程中有機酸的作用。【方法】對P7、P13、P15、P18四株解磷菌進行培養，并對其進行動態觀測，用高效液相色譜法測定其有機酸種類及含量，研究其解磷量與有機酸之間的關系。【結果】4株解磷菌溶解磷酸三鈣能力有顯著差異，解磷能力大小依次是P15>P13>P18>P7。4株解磷菌產生有機酸的含量差異很大，并且同一株解磷菌在培養過程中產生的有機酸種類也會不同。經分析發現有機酸對速效磷的直接影響由強至弱排序依次是：丙酮酸、酒石酸、乳酸、乙酸、草酸。【結論】解磷能力最強的是P15菌株，丙酮酸對溶解磷酸三鈣的直接影響系數最大。

解磷微生物；酸解作用；有機酸

0 引 言

【研究意義】磷是植物生命過程不可或缺的礦物質元素之一，在植物的生長發育和生理代謝活動中起著重要作用[1]。土壤中的磷大約有95%是植物難以直接吸收利用的無效磷，可溶性的磷在被施入土壤后大部分也迅速轉化為植物難以利用的磷酸鹽，因此提高土壤中磷素的利用效率，對于促進植物生長發育具有重要意義[2]。【前人研究進展】土壤中存在一些微生物，可通過新陳代謝將難溶的磷酸鹽轉化為植物可以吸收利用的形態，增加土壤中有效磷含量，促進作物生長[3]。相關研究發現，一些微生物可以產生有機酸來溶解土壤中難以被吸收利用的磷酸鹽，或者通過有機酸的螯合作用使難以被植物吸收利用的磷酸鹽溶解。伊鋆等[4]對解磷菌株PSB28解磷機理進行了研究，經高效液相色譜測定結果發現，有機酸種類和含量都發生了顯著變化，因此判斷該菌株解磷的主要原因是有機酸的螯合作用。鐘傳青等[5]研究發現解磷細菌能夠產生檸檬酸、琥珀酸、乳酸以及乙酸等有機酸，這些有機酸可能與磷礦粉中的金屬離子發生螯合作用產生溶磷效果。王同等[6]在研究紅壤溶磷菌的篩選及溶磷機制時發現，目標菌株B1主要分泌草酸和蘋果酸，通過添加有機酸對磷酸鋁活化的對比試驗表明，分泌有機酸溶磷僅是菌株B1溶磷機制之一。潘虹等[7]在研究石灰性土壤解磷細菌時發現，草酸是高螯合活性的有機酸，適合于溶解石灰性土壤中的難溶性無機磷。王法威等[8]的研究發現A9解磷細菌通過分泌有機酸來溶解土壤無機磷。Whitelaw等[9]研究發現解磷細菌在溶解磷酸鹽時產生大量有機酸，其中葡萄糖酸含量最高，葡萄糖酸通過降低pH值，進而溶解難溶性磷以及與A13+螯合釋放磷酸根。【本研究切入點】研究四種不同解磷微生物菌株產生有機酸及不同有機酸溶解磷酸三鈣的能力。【擬解決的關鍵問題】對解磷細菌溶解難溶性磷酸鹽的溶解作用及溶磷過程中有機酸的作用進行進一步的解釋。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試菌株為新疆農業大學林業研究所微生物試驗室分離保存的高效解磷細菌：P7(Bacillussp.)、P13(Acinetobactersp.)、P15(Acinetobactersp.)、P18(Enternhactersp.)

供試菌株活化采用牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，蛋白胨10.0 g，pH 7.0～7.2，蒸餾水1 000 mL。

菌株解磷能力測定采用無機磷基礎培養基：葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO40.3 g，FeSO40.03 g，MnSO41.0 g，Ca3(PO4)25.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.5。研究發現石灰性土壤中磷素以磷酸鈣型磷占全磷比例最大，而新疆土壤以石灰性土壤為主，所以試驗選擇磷酸三鈣為磷源進行研究[10]。

1.2 方 法

1.2.1 菌液制備和培養

種子液的制備：將用300 μg/mL利福平標記過的P7、P13、P15、P18抗利福平菌株接種于盛有250 mL牛肉膏蛋白胨培養基的三角瓶中，在180 r/min，30℃的環境中搖床培養48 h。待細菌生長充分后，用無菌水調節各種子液濃度至1×108cfu/mL。

菌液培養：向250 mL三角瓶中加入100 mL無機磷基礎培養基，在高溫滅菌鍋中滅菌，冷卻至室溫靜置1 d。分別將2 mL含有P7、P13、P15、P18解磷菌的種子懸液接種到無機磷培養基中，同時設不接種對照(CK)，180 r/min，30℃搖床培養8 d。每個處理三次重復。

1.2.2 菌液中pH、可溶性磷和活菌數的測定

pH的測定：每隔48 h在超凈工作臺的無菌環境中從培養液中吸取4 mL發酵液，在4℃、6 000 r/min條件下離心10 min，取上清液使用pH計測定菌液pH值，每個樣品重復三次。

可溶性磷的測定：取上述條件下離心的上清液0.1 mL，加入4.9 m蒸餾水，然后加入0.2 mL 10%VC溶液，30 s后再加入0.4 mL鉬銻抗存儲液，并以蒸餾水定容至10 mL，搖勻，放置15 min后，于660 nm處比色，計算可溶性磷含量，測量時每個樣品重復三次。

活菌數的測定：取1 mL菌液用平板涂布法測定細菌活菌數，每個梯度三次重復。

1.2.3 菌液中有機酸種類和含量的測定

自培養開始，分別在0、48、96、144和192 h取菌液1 mL，在4℃、6 000 r/min條件下離心10 min，再經0.22 μm濾膜真空抽濾后，用高效液相色譜測定菌液有機酸。分離條件:采用U3000液相色譜儀和C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 pm)，柱溫為30℃，流動相為0.02 mol/L KH2PO4緩沖溶液一甲醇溶液(99∶1，用1 mol/L磷酸調節pH至2.60，紫外檢測波長210 nm，進樣量20 μL，流速0.5 mL/min，測定有機酸的種類和含量在不同時間的變化情況，每個樣品三次重復。

1.3 數據處理

試驗數據采用Spss19.0和Excel2003進行處理。

2 結果與分析

2.1 不同處理對菌液pH、解磷能力以及菌體生長狀況的影響

2.1.1 搖瓶培養過程中菌株生長動態

將接種P7、P13、P15、P18接種到無機磷基礎培養基進行培養，CK不作處理，每2 d進行計數，其結果顯示，4種菌株在接種種子液后開始快速繁殖，在6 d時活菌數普遍達到較高水平，之后活菌數呈現緩慢下降態勢，8 d時活菌數普遍低于6 d的活菌數。P15菌株雖然也在6 d達到較高水平，但是其在前4 d生長較其他菌株慢，且后期下降速度比其他菌株快，P15菌株對環境更加敏感。表1

表1 4種菌株搖瓶培養后活菌計數
Table 1 Four kinds of bacteria count
Table after shake flask culture

處理編號Processingnumber菌液活菌數Viablebacteriacount(CFU/mL)0d2d4d6d8dP70.15×1082.02×1083.56×1084.04×1083.38×108P130.1×1081.84×1083.35×1083.37×1083.15×108P150.08×1080.28×1081.78×1083.70×1082.10×108P180.12×1081.79×1083.39×1083.54×1082.91×108CK0×1080.07×1080.08×1080.08×1080.13×108

2.1.2 不同菌株解磷能力

分別在0、2、4、6和8 d測定五種不同處理的無機磷基礎培養基中速效磷含量，研究表明，處理P13、P15速效磷含量明顯高于CK的含量，處理P7、P18與CK相比速效磷含量也有一定的提高。在培養的前4 d，處理P13和P15的速效磷含量明顯高于處理P7和P18，P13、P15與CK之間存在顯著差異，而P7、P18與CK間的差異未達到顯著水平。P15菌株對磷酸三鈣的分解能力最強，結合表1可以看出，細菌對磷酸三鈣的分解能力與活菌數關系不大，菌株生長過程中對磷的需求可能是促進細菌分解磷酸三鈣的重要因素。而處理P13中在4 d后速效磷下降明顯快于處理P15，可能與P13活菌數高于P15有關。雖然不同時間各菌表現出的溶磷能力不同，但是總體來看各菌對磷酸三鈣分解能力從大到小依次為：P15>P13>P18>P7>CK。培養基中可溶性速效磷含量呈現出先增后減趨勢，最后處于平穩，說明有機酸通過螯合作用來溶磷酸三鈣的過程是一個逐漸平衡的過程。表2

表2 不同菌株下解磷能力變化Tabel 2 Effect of different bacteria on phosphate dissolving ability

處理編號Processingnumber不同時間解磷量Phosphorusremovalatdifferenttimes(mg/kg)0d2d4d6d8dP7020.71d27.37b26.52ab24.8aP13087.43b99.8a16.52b10.45bP15095.81a121.96a87.14a26.86aP18027.77c26.99b35.03ab30.11aCK00.38e5.28b7.1ab7.3a

注：不同小寫宇母表示差異顯著(P< 0.05 )，下同

Note: The different lowercases indicate significant differences(P<0.05). The same as below

2.1.3 不同菌株對pH產生的影響

5組不同處理的pH值整體呈現出先下降后緩慢升高的趨勢，在第4 d時pH最低，其后緩慢上升，這與培養基中速效磷含量呈負相關。速效磷含量較高的的P13、P15兩組處理中pH下降速度也比其他處理快。CK處理由于未加入任何菌株，pH雖然也下降但是下降速度較慢，且下降幅度也比其他處理小。研究6～8 d的pH與速效磷含量變化可以看出，P7菌株雖然pH明顯降低，但是速效磷含量并沒有顯著上升；P15菌株的速效磷含量明顯降低，但是其pH變化卻不明顯。這說明pH不是導致解磷菌溶解磷酸三鈣的主要因素。圖1

2.2 不同菌株產生有機酸情況及不同有機酸對磷酸三鈣溶解能力的分析

2.2.1 不同菌株產生有機酸情況及解磷能力比較

對接種不同菌株的培養基進行測定，研究表明，四種細菌所產生的有機酸整體變化規律是，有機酸含量先上升后下降，或者是先上升后下降再上升，這與虞偉斌[11]以及Illmer等[12]的研究結果相近，研究認為，解磷菌溶解磷酸鹽能力的大小與取樣的時間具有較強的關系。研究表明，大部分有機酸含量會在第4或者第6 d時達到最高，隨后開始下降，部分菌種產生的有機酸也會上升。各不同菌株產生的丙酮酸、酒石酸、草酸的變化規律較為一致，但是不同菌株間產生有機酸的含量差異較大，P13酒石酸最大濃度可達140 μg/kg，而丙酮酸含量最高只有9.53 μg/kg。不同解磷菌株所產生的乳酸含量變化差異較大，P18菌產生的乳酸在第2 d時達到最高，而P7菌在第4 d達到最高，P15菌在第6 d達到最高，P7菌在第8 d達到最高。P7和P18菌株在第8 d時都未檢測到乳酸。不同菌株產生的乙酸的變化也很不規律，但研究發現，解磷能力較弱的P7、P18菌株培養基中乙酸含量比其他菌株高，乙酸的解磷能力與另外四種有機酸相比要弱。研究表明，解磷能力較好的P13、P15菌株產生的五種有機酸的含量明顯高于解磷能力較弱的P7、P18菌株，有機酸溶解磷酸三鈣是由多種有機酸共同作用的結果。在試驗過程中五種有機酸都出現過含量特別低，甚至檢測不出該種有機酸的情況，P13菌株在2 d時產生五種有機酸，在6 d時只能產三種有機酸。解磷微生物產生的有機酸的含量和種類是隨著時間而變化的。圖2～6

圖1 不同處理培養基pH動態變化
Fig.1 The changes of pH in different treatments

圖2 培養基中乳酸變化

Fig.2 Changes of lactic

圖3 培養基中丙酮酸變化
Fig.3 Changes of pyruvate

圖4 培養基中乙酸變化
Fig.4 Changes of acetic acid

圖5 培養基中酒石酸變化
Fig.5 Changes of tartaric acid

圖6 培養基中草酸變化
Fig.6 Changes of oxalate

2.2.2 不同有機酸對磷酸三鈣溶解能力

通徑分析是通過對自變量與因變量之間的表面直接相關性進行分解，來闡述自變量對因變量的直接影響和間接影響[13]。試驗利用通徑分析的方法對草酸、酒石酸、丙酮酸、乳酸、乙酸五種有機酸對速效磷的影響進行了研究。研究表明，微生物對速效磷的溶解與產生的丙酮酸、酒石酸以及草酸含量在0.01水平上呈顯著正相關，微生物對速效磷的溶解量與產生的乙酸含量在0.05水平上呈顯著正相關，說明隨著這四種有機酸升高，微生物的溶解磷酸三鈣的能力也會明顯增強。而乳酸與速效磷的含量之間則不具備相關性。表3

表3 速效磷含量與不同有機酸之間相關系數
Table 3 Correlation coefficient between phosphorus content and different organic acids

草酸Oxalicacid酒石酸Tartaricacid丙酮酸Pyruvicacid乳酸Lacticacid乙酸Aceticacid簡單相關系數 Simplecorrelationcoefficient0.759**0.824**0.9**0.3220.45*偏相關系數 Partialcorrelationcoefficient0.4180.7920.7830.1650.239

注：N=20 “*”表示在P<0.05水平上相關性顯著;“**”表示在P<0.01水平上相關性顯著

Note: N=20 “*”indicates significant correlation atP<0.05 level, and‘**”indicates significant correlation atP<0.01 level

經計算得知，F=36.172，P<0.000 1，R2=0.928，整后的R2= 0.902，構建多元線性回歸模型是成立的。結合理論經分析可知，各變量的標準化參數值即為各有機酸對速效磷影響的直接通徑。剩余因子e=0.432，該值較大，說明對速效磷產生影響的自變量還有其他較大的影響因素未被考慮進來，因此，對微生物溶解磷酸三鈣的機理還需要進一步進行深入研究。

通過計算，得出各有機酸對速效磷含量的影響的通徑分析結果，通過對直接通徑系數的研究發現，在上述五種有機酸對速效磷的影響中，丙酮酸對速效磷的直接影響最大，其直接通徑系數是0.775，其后依次是酒石酸、乳酸、乙酸，而草酸對速效磷的直接影響是最小的。雖然草酸與速效磷之間存在顯著相關，但是其直接通徑系數為-0.264，因此，在討論草酸對速效磷的影響時應該主要考慮間接影響。對間接通徑系數進行分析發現，草酸通過影響酒石酸對速效磷的間接通徑系數是0.292，通過影響丙酮酸對速效磷的間接通徑系數是0.530，都大于它對速效磷的直接通徑系數，因此，草酸對速效磷的影響主要是通過丙酮酸和酒石酸來實現的。丙酮酸對速效磷的直接通徑系數為0.775，同時它還通過草酸對速效磷產生負向間接效應。在剔除了草酸、酒石酸、乙酸后，發現乳酸對速效磷的影響主要通過丙酮酸產生。表4

表4 各有機酸對速效磷含量通徑系數
Table 4 Path analysis of available phosphorus in different organic acids

自變量Independentvariable簡單相關系數Simplecorrelationcoefficient直接通徑系數(直接作用)Directpathcoefficient間接通徑系數(間接作用)草酸Oxalicacid酒石酸Tartaricacid丙酮酸Pyruvicacid乳酸Lacticacid乙酸Aceticacid合計草酸 Oxalicacid0.759-0.264-0.2920.530-0.029-0.0340.758酒石酸 Tartaricacid0.8240.544-0.081-0.065-0.018-0.037-0.071丙酮酸 Pyruvicacid0.90.775-0.1970.087-0.061-0.040-0.089乳酸 Lacticacid0.3220.0540.038-0.0870.218--0.00010.169乙酸 Aceticacid0.45-0.0790.036-0.1400.1120.0001-0.009

3 討 論

微生物的解磷過程是一個非常復雜的過程，酸解作用被認為是一種重要的解磷機理，它是指在微生物代謝過程中分泌各種小分子量有機酸與磷礦粉發生一系列作用使磷礦粉溶解的過程。伊鋆等[4]在研究PSB28菌株解磷的機理時，發現有機酸在溶解磷酸鹽時主要是通過與金屬陽離子的螯合作用來實現；虞偉斌等[11]研究也發現K3分泌的蘋果酸的在溶磷作用中起主要作用。試驗對P7、P13、P15、P18四種解磷菌在磷脅迫條件下，產生有機酸溶解磷酸三鈣的過程進行了研究，發現四種解磷菌都可以產生草酸、酒石酸、丙酮酸、乳酸、乙酸等五種有機酸。林啟美等[14]在研究微生物解磷機理時發現，不同的微生物在溶解磷酸鹽時，產生的有機酸的數量和種類都有很大的差異。Deubel等[15]研究指出解磷細菌解磷時分泌有機酸的種類和數量也是在不斷變化的。試驗中雖然4株解磷菌都能產生草酸、酒石酸、丙酮酸、乳酸、乙酸等五種有機酸，但是不同解磷菌產生有機酸的含量差異也很大，同一種解磷菌在不同時間產生的有機酸種類也有所不同，產生的有機酸的含量也有很大的差異。試驗結果表明，P13、P15菌種溶解磷酸三鈣能力明顯高于P7、P18菌種，P13、P15產生的有機酸的含量特別是丙酮酸、草酸、酒石酸含量也明顯高于其他菌種，這說明有機酸在溶解磷酸三鈣的過程中起主要作用。

試驗利用通經分析的方法對草酸、酒石酸、丙酮酸、乳酸、乙酸五種有機酸對速效磷的影響進行了探討。由通徑系數反映的有機酸對速效磷的直接影響由大到小排序依次是：丙酮酸、酒石酸、乳酸、乙酸、草酸。對間接通徑系數進行分析發現，草酸對速效磷的影響主要是通過丙酮酸和酒石酸來實現的，乳酸對速效磷的影響主要通過丙酮酸產生。研究還發現剩余因子值較大，說明對速效磷產生影響的自變量還有其他較大的影響因素未被考慮進來，由于試驗條件的限制，試驗無法對所有的影響因素都進行分析，因此，對微生物溶解磷酸三鈣的過程還需要進行更深一步的研究。

目前學者們對于微生物的解磷機理依然有很多爭論，Lin等[16]研究認為，微生物在溶解磷酸鹽時雖然會產生葡萄糖酸，但最終是葡萄糖酸中質子使難溶性的無機磷溶解。虞偉斌等[18]認為是有機酸起主導作用，他們在研究中調節培養基的pH，人工模擬質子的酸溶作用對解磷量的影響，發現解磷菌K3不僅分泌有機酸同時也產生了H+，然而質子的酸溶效果遠遠低于有機酸的溶磷效果。趙小蓉等[17]認為是質子作用和有機酸作用同時存在，他們在研究中發現培養基中的速效磷含量與pH值之間存有一定的相關性，他們還發現培養液中pH的降低并不是解磷微生物溶解磷酸鹽的必要條件。研究也發現，當pH明顯上升或下降時，速效磷含量的變化與pH變化并不完全一致，這說明pH不是導致解磷菌溶解磷酸三鈣的主要因素。

4 結 論

對P7、P13、P15、P18四株解磷菌進行培養，并對其進行動態觀測，研究其解磷量與有機酸之間的關系。四株解磷菌都能產生草酸、酒石酸、丙酮酸、乳酸、乙酸等五種有機酸，四種解磷菌溶解磷酸三鈣能力有顯著差異，解磷能力大小依次是P15>P13>P18>P7。五種有機酸對速效磷的直接影響由大到小排序依次是：丙酮酸>酒石酸>乳酸>乙酸>草酸。P13、P15產生的有機酸的含量特別是丙酮酸、草酸、酒石酸含量也明顯高于其他菌種，有機酸在溶解磷酸三鈣的過程中起主要作用。

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ZHAO Xiao-rong, LIN Qi-mei, LI Bao-guo. (2003). The Relationship between Rock Phosphate Solubilization and pH and Organic Acid Production of Microorganisms [J].JournalofMicrobiology, 23(2): 5-7. (in Chinese)

Study on Organic Acid Secreted from 4 Strains Phosphorus-solubilizing Bacteria and Calcium Phosphate Dissolving Ability

LIU Sheng-liang1,2, ZHU Shu-liang1,2, QI Xian-hui1,2, LI Xiao-yuan1, ZHANG Fu-wei1,YANG Wen-ying1, LI Jian-gui1,2

(1.ForestryInstitute，XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi830052，China; 2.XinjiangJujubeEngineeringTechnologyResearchCenter,XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi830052,China;3.XinjiangAgriculturalUniversity2612team,Urumqi830052，China)

【Objective】 To study organic acid secreted from phosphorus-solubilizing bacteria and calcium phosphate dissolving ability.【Method】The P7, P13, P15 and P18 phosphate-solubilizing bacteria were sent to cultivate for dynamic observation. The organic acid types and content were determined by high performance liquid chromatography (HPLC) method for studying the relationship between phosphate-solubilizing and organic acids. 【Result】The research showed that dissolving calcium phosphate capacity of the 4 strains of bacteria had significant difference, the order of which was: P15 > P13 > P18 > P7 and the content difference of four kinds of bacteria producing organic acids was also great, and organic acids produced by the same bacteria at different times were different, too. Through the path analysis, it was found that the direct effects of organic acids on available phosphorus in descending order were: pyruvic acid > tartaric acid > lactic acid > acetic acid > oxalic acid.【Conclusion】The strongest ability to solve phosphorus bacteria is the P15 strain and the direct influence coefficient of pyruvic acid on the dissolution of calcium phosphate is the largest.

phosphate dissolving microorganism; acid hydrolysis; organic acid

LI Jian-gui (1964- ), male, native place: Pingdu, Shandong. Professor, Doctor, research field: Ecology and Forestry economic management. (E-mail)lijiangui1971@163.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.06.019

2017-03-14

國家自然科學基金項目“土壤和肥料在新疆灰棗cAMP形成中的作用機制”(31360194)；新疆維吾爾自治區科技計劃項目“南疆紅棗專用PGPR制劑研制與應用”(201431106)；國家林業公益性項目重大專項課題“新疆紅棗、核桃專用微生物肥料研制與應用示范”(201304701)

劉勝亮(1990-)，男，山東沂水人，碩士研究生，研究方向為微生物生態學，(E-mail)lcu2010@163.com

李建貴(1971-)，男，山東平度人，教授，博士，研究方向為生態學、林業經濟管理，(E-mail)lijiangui1971@163.com

S154.34

A

1001-4330(2017)06-1114-08

Supported by: National Natural Science Foundation of China"Mechanism of Soil and Fertilizer in the Formation of cAMP in Xinjiang Jujube"(31360194)and Key Technology R&D Planning Program"Preparation and Application of Special PGPR for Soutern Xinjiang jujube"(201431106)