大鼠CD90+Lin-骨髓細胞誘導分化為肝細胞過程中Klf4、Nanog基因的表達及啟動子區甲基化觀察

劉欽成，張梓朗，潘潤華，劉寧，韓曉玉，郭凌宏，王春明，廖彩仙

(南方醫科大學南方醫院，廣州 510515)

大鼠CD90+Lin-骨髓細胞誘導分化為肝細胞過程中Klf4、Nanog基因的表達及啟動子區甲基化觀察

劉欽成，張梓朗，潘潤華，劉寧，韓曉玉，郭凌宏，王春明，廖彩仙

(南方醫科大學南方醫院，廣州 510515)

目的 觀察大鼠CD90+Lin-骨髓細胞誘導分化為肝細胞過程中Klf4、Nanog基因表達及啟動子區CpG位點的甲基化變化。方法 大鼠CD90+Lin-骨髓細胞在體外用25 μg/L重組人肝細胞生長因子和0.1 nmol/L地塞米松誘導其分化，在誘導第0、7、14天分別提取細胞DNA和RNA。采用實時熒光定量PCR法檢測Klf4、Nanog基因mRNA，甲基化特異性PCR法觀察Klf4、Nanog基因啟動子區CpG位點甲基化。結果 與誘導第0天比較，第7、14天Klf4 mRNA相對表達量降低(P均<0.05)；與誘導第0天比較，第7、14天Nanog mRNA相對表達量均降低(P均<0.05)。與誘導第0天比較，誘導第7天Klf4啟動子區第1、2個CpG位點甲基化頻率升高(P均<0.05)；與誘導第7天比較，誘導第14天Klf4啟動子區第1個CpG位點甲基化頻率升高，第2、3個CpG位點甲基化頻率降低,P均<0.05。與誘導第0天比較，誘導第7天Nanog啟動子區第1個CpG位點甲基化頻率降低，第2個CpG位點甲基化頻率升高，P均<0.05；與誘導第7天比較，誘導第14天Nanog啟動子區第1個CpG位點甲基化頻率升高，第2個CpG位點甲基化頻率降低，P均<0.05。結論 大鼠CD90+Lin-骨髓細胞在體外誘導向肝細胞分化過程中，Klf4、Nanog基因表達隨誘導時間增加呈現先下降后回升趨勢，兩者啟動子區CpG位點甲基化程度隨誘導時間增加出現不同程度變化；Klf4和Nanog基因啟動子區CpG位點的甲基化變化不僅會影響Klf4、Nanog基因的表達，而且起到重要的調控作用。

骨髓間充質干細胞；CD90+Lin-骨髓細胞；Nanog基因；Klf4基因

CD90+Lin-骨髓細胞具有分化形成肝細胞的潛能已得到實驗研究和臨床試驗證實[1，2]，但其向肝細胞分化的表觀遺傳學調控機制尚不清楚。本課題組潘潤華等[3]曾對大鼠骨髓間充質干細胞在體外誘導向肝細胞分化過程中OCT4基因表達及其啟動子區甲基化變化進行觀察，發現OCT4表達量和啟動子區甲基化頻率隨分化進程不同而變化。而Oct4與Klf4、Nanog等是一組多潛能性基因，在維持干細胞的多能性方面均起著重要作用[4，5]。本研究觀察了大鼠CD90+Lin-骨髓細胞誘導分化為肝細胞過程中Klf4、Nanog基因表達及其啟動子區甲基化變化，以期從多角度認識骨髓間充質干細胞向肝細胞分化的表觀遺傳學調控機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 高糖DMEM F12培養基(美國Hyclone公司)；澳洲特級胎牛血清(以色列BioInd 公司)；青霉素-鏈霉素(美國Gibco公司)；0.25%胰酶-EDTA(美國Gibco公司)；重組人肝細胞生長因子(美國Peprotech公司)；EpiTect Bisulfite Kit(德國Qiagen公司)；TaKaRa EpiTaq HS(Takara公司)；Biospin細胞基因組DNA提取試劑盒(杭州博日科技公司)；Gel Extraction膠回收試劑盒(Omega公司)；Glodview(廣州展晨生物科技公司)；RNasin特異性核糖核酸酶抑制劑(Promega公司)；DL 2 000 bp Marker(Takara公司)；TRIzol RNA提取試劑(Takara公司)；Diethy pyrocarbonate；DEPC(Sigma公司)；RT-PCR試劑(DBI公司)；逆轉錄試劑盒(DBI公司)。

1.2 大鼠CD90+Lin-骨髓細胞培養、誘導分化 ①細胞培養：參照課題中黎冠宏等[4]方法獲得大鼠CD90+Lin-骨髓細胞，并將新鮮制備的細胞置于液氮中保存備用。②凍存細胞復蘇與培養：凍存的大鼠 CD90+Lin-骨髓細胞復蘇后，將其置于37 ℃含5%CO2孵箱中培養，培養液為高糖培養液(高糖DMEM F12培養基+10%胎牛血清+青霉素-鏈霉素)，3 d換液1次，細胞生長到約80%時用0.25%胰酶-EDTA消化傳代。③細胞誘導分化：誘導分化采用課題組中潘潤華等[3]報道的方案。把細胞培養至第三代的良好細胞，置入培養液(高糖DMEM F12培養基+10%胎牛血清+青霉素-鏈霉素+25 μg/L重組人肝細胞生長因子+0.1 nmol/L地塞米松)中進行誘導分化，3 d換液1次，連續誘導14 d。在第0、7、14天用顯微鏡記錄細胞形態，同時取未誘導的細胞作為對照。

1.3 大鼠CD90+Lin-骨髓細胞Klf4、Nanog基因mRNA檢測方法 采用熒光定量PCR法。按照RNA提取試劑盒方法(TRIzol+氯仿+異丙醇提取法)從培養至第0、7、14天的大鼠CD90+Lin-骨髓細胞中提取總RNA。把1 μg的總RNA作為模板，逆轉錄反應體系依照熒光定量PCR試劑說明書所配制，合成cDNA的第一鏈。定量熒光PCR擴增反應體系：PCR Forward Primer(10 μM)0.5 μL、Bestar?SybrGreen qPCRmasterMix 10 μL、cDNA模板1 μL、PCR Reverse Primer 0.5 μL、ddH2O 8 μL，一共20 μL。使用美國安捷倫Mx3000P熒光定量PCR儀進行實驗。反應條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環反應。PCR結果則依照2-ΔΔCt相對定量法計算，ΔCt=目的基因Ct-內參基因Ct；ΔΔCt=實驗組的目的基因ΔCt-參照組的目的基因ΔCt；相對樣品初始模板量=2-ΔΔCt。GAPDH為內參基因，GAPDH上游引物：5′-CCTCGTCTCATAGACAAGATGGT-3′，下游引物：5′-GGGTAGAGTCATACTGGAACATG-3′，片段長度為169 bp；Klf4上游引物：5′-GGAGACCGAGGAGTTCAACGAT-3′，下游引物：5′-AGGATGAAGCTGACGCCGAG-3′，片段長度為113 bp；Nanog上游引物：5′-AACGCTGCTCCGCTCCATAA-3′，下游引物：5′-GGCTTCCAAATTCGCCTCCAAA-3′，片段長度為102 bp。

1.4 大鼠CD90+Lin-骨髓細胞Klf4、Nanog基因啟動子區CpG位點甲基化觀察方法 ①DNA提取及甲基化修飾：按照細胞基因組DNA提取試劑盒說明書，從誘導第0、7、14天大鼠CD90+Lin-骨髓細胞中提取基因組DNA。然后使用EpiTect Bisulfite Kit試劑盒，按照說明將試劑添加在200 μL的PCR管中建立亞硫酸氫納反應體系，使用PCR儀進行熱循環將樣本DNA亞硫酸氫鹽修飾化。熱循環條件：95 ℃變性5 min，60 ℃孵化25 min，95 ℃變性5 min，60 ℃孵化85 min，95 ℃變性5 min，60 ℃孵化175 min，20 ℃保持冷卻。修飾純化后的DNA置于-80 ℃條件下保存。②引物選取及PCR擴增：選取Klf4、Nanog基因轉錄起始位點上游+1～-1 500 bp附近的啟動子區，分別含3個和2個CpG位點。Klf4、Nanog的引物設計均由上海生工生物技術有限公司所合成，其甲基化引物信息如下：Nanog-MF1：5′-AGTTGGTAGTTGAGAGGATAATTAC-3′，5′-Nanog-MR1：TAAACATTCTAAATAATTCCTCTAT-3′；Nanog-MF2：5′-TGAATTAGTAGTTTTTATTTTATTC-3′，Nanog-MR2：5′TACTAAACTCCTCACTAACACTAAA-3′；Klf4-MF1：5′-ATTAATATAGGTTTTAGGATTTCGG-3′，Klf4-MR1：5′-AACAACGTATACGTATACACTCGTT-3′；Klf4-MF2：5′-ATTTCGGGATTTAAATAGGTGAAAC-3′，Klf4-MR2：5′-ACTAATTAATGCTCCAGCCCAAACA-3′；Klf4-MF3：5′-TTAAATAGGTGAAACGATAGAGGAC-3′，Klf4-MR3：5′-TCACGATTAAACCCCCTAACTAAAA-3′。在0.2 mL PCR反應管中配制目的基因PCR擴增體系25 μL：TaKaRa EpiTaq HS 0.25 μL、10×EpiTaq PCR Buffer(Mg2+free) 2.5 μL、dNTP Mix 3 μL、MgCl22.5 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、甲基化修飾純化后DNA 1 μL、ddH2O 18.25 μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min，98 ℃變性10 s，51～61 ℃退火30 s(具體溫度由引物決定)，72 ℃延伸30 s，如此共循環30次。72 ℃延伸5 min，冷卻至4 ℃保存。取5 μL PCR的產物來行1%瓊脂糖凝膠電泳。

2 結果

2.1 大鼠 CD90+Lin-骨髓細胞的培養和誘導分化 復蘇后的細胞分布均勻，形態均一，呈橢圓形。48 h后貼壁生長，呈長梭形，集落呈漩渦狀。細胞形態在誘導分化過程中逐漸變圓，至第14天時，細胞呈飽滿圓形。

2.2 大鼠 CD90+Lin-骨髓細胞Klf4、Nanog基因mRNA相對表達量比較 誘導第0、7、14天Klf4 mRNA相對表達量分別為1.00±0.04、0.31±0.01、0.94±0.01，Nanog mRNA相對表達量分別為0.94±0.08、0.46±0.04、0.57±0.04，第0天、第7天比較，第7天、第14天比較，P均<0.05。

2.3 大鼠CD90+Lin-骨髓細胞Klf4啟動子區CpG位點甲基化頻率比較 結果見表1。

2.4 大鼠CD90+Lin-骨髓細胞Nanog啟動子區CpG位點甲基化頻率比較 結果見表2。

表1 大鼠CD90+Lin-骨髓細胞Klf4啟動子區CpG位點甲基化頻率比較(%)

注：與誘導第0天比較，*P<0.05；與誘導第7天比較，△P<0.05。

表2 大鼠CD90+Lin-骨髓細胞Nanog啟動子區CpG位點甲基化頻率比較(%)

注：與誘導第0天比較，*P<0.05；與誘導第7天比較，△P<0.05。

3 討論

Klf4和Nanog在干細胞分化、增殖、維持自我更新和維持多能性等方面起重要作用，但兩者的作用又不完全相同。Klf4參與調節Wnt[6]、Notch[7]、TGF-β[8]等多種重要信號通路，在干細胞分化中起重要作用。Takahashi等[9]運用Klf4協同Oct4、Sox2及c-Myc轉錄因子，成功將小鼠胚胎和成體成纖維細胞轉化為誘導性多能干細胞。有研究[4]表明，Klf4可結合于Lefty1啟動子并促進Lefty1基因表達，從而促進Oct4及Sox2干細胞性因子的表達。Klf4還可調控p21的表達，在細胞周期中阻止G1/S期的進程以至于達到調控細胞增殖[10,11]。Klf4處于STAT3通路的下游，該通路激活后可上調Klf4的表達，達到促進干細胞自我更新的目的[12]。Nanog在胚胎干細胞中，有著維持自我更新以及多能性的功能，同時也是干細胞自我更新、增殖并保持其分化潛能所必需的[13]。Yu等[14]用Nanog、Oct4、Sox2、Lin28共4種多能性因子成功使人體細胞誘導成為多能性干細胞，充分表明了Nanog在干細胞多能性調控網絡中的地位。關于Nanog自我更新的機制，研究[15]表明其可通過調節下游靶向基因gata6、gata4來維持干細胞自我更新。

在多能性基因調控網絡中，Klf4和Nanog又是有聯系的。例如Klf4先與Oct4、Sox2結合，形成Oct4/Sox2/Klf4復合體，然后復合體再結合于Nanog基因啟動子區并促進其轉錄[16]。在胚胎干細胞中，Klf4不僅可以聯合PBX1直接作用于Nanog基因啟動子區，調節其表達[17]。而且Klf4還可以通過直接抑制p53的表達，從而間接調控了Nanog基因表達[18]。但在成體干細胞的橫向分化過程，Klf4和Nanog的調控作用和調控機理均未完全明了。

本研究顯示，誘導第0、7、14天，Klf4、Nanog mRNA相對表達量先下降后回升。牛朝詩等[19]發現，在膠質瘤干細胞中Nanog基因啟動子區呈低甲基化狀態，Nanog表達量明顯上調；而袁旦平等[20]發現，結腸癌組織的Klf4基因啟動子區明顯較正常癌旁組織甲基化程度高，結腸癌組織Klf4的表達量明顯下降。上述兩者研究對象均為腫瘤細胞，而本文則是針對大鼠CD90+Lin-骨髓細胞向肝細胞分化的過程中Klf4和Nanog的變化，結果顯示最終兩者表達量均較原始有所下降，這表明成熟肝細胞多能性下降。但是在此過程中兩者表達量并非呈現單方向線性下降，單方向僅上調或下降Klf4、Nanog的表達可能會導致細胞像上述腫瘤細胞方向發展。

DNA甲基化是表觀遺傳學主要的修飾方式之一，基因啟動子區的甲基化變化是調控基因表達的一個重要方式。DNA甲基化是在DNA甲基轉移酶的催化下，在CpG二核苷酸5′端胞嘧啶第5位碳原子插入一個甲基集團，使之轉變為5-甲基胞嘧啶的反應。本文結果顯示，與誘導第0天比較，誘導第7天Klf4啟動子區第1、2個CpG位點甲基化頻率升高；與誘導第7天比較，誘導第14天Klf4啟動子區第1個CpG位點甲基化頻率升高，第2、3個CpG位點甲基化頻率降低。與誘導第0天比較，誘導第7天Nanog啟動子區第1個CpG位點甲基化頻率降低，第2個CpG位點甲基化頻率升高；與誘導第7天比較，誘導第14天Nanog啟動子區第1個CpG位點甲基化頻率升高，第2個CpG位點甲基化頻率降低。上述結果提示，Klf4、Nanog基因啟動子區CpG位點的甲基化變化不僅會影響Klf4、Nanog的表達，還可能會影響到其他與分化有關基因的表達，在體外誘導大鼠CD90+Lin-骨髓細胞向肝細胞分化過程中很可能起重要的調控作用。

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Expression of Klf4 and Nanog and their promoter methylation during differentiation of rat bone marrow CD90+Lin-cells to hepatocytes

LIUQincheng,ZHANGZilang,PANRunhua,LIUNing,HANXiaoyu,GUOLinghong,WANGChunming,LIAOCaixian

(NanfangHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

Objective To observe the expression of Klf4 and Nanog and the promoter region CpG site methylation changes during differentiation of rat bone marrow CD90+Lin-cells to hepatocytes. Methods Rat bone marrow CD90+Lin-cells were induced in vitro by 25 μg/L recombinant human hepatocyte growth factor and 0.1 nmol/L dexamethasone. DNA and RNA were extracted from cells on day 0, 7, and 14 of induction. Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect Klf4 and Nanog mRNA expression. Methylation Specific PCR was performed to detect methylation variation of CpG sites in Klf4 and Nanog promoters. Results Compared with the day 0, the relative expression of Klf4 mRNA decreased on day 7 and day 14 (P<0.05); compared with the day 0, the relative expression of Nanog mRNA decreased on day 7 and day 14 (P<0.05). Compared with the day 0, the methylation frequency of the first and second CpG sites in Klf4 promoter increased on day 7 (P<0.05); compared with the day 7, the methylation frequency of the first CpG site in Klf4 promoter increased on day 14, while the second and third CpG sites in Klf4 promoter decreased (P<0.05). Compared with the day 0, the methylation frequency of the first site in Nanog promoter decreased in day 7, while the second sites in Nanog promoter increased (P<0.05); compared with the day 7, the methylation frequency of the first CpG site in Nanog promoter increased on day 14, while the second CpG site in Nanog promoter decreased (P<0.05).Conclusions During differentiation of rat bone marrow CD90+Lin-cells to hepatocytes in vitro, the expression of Klf4 and Nanog first increases and then decreases as time passes, and the CpG sites methylated degrees of both promoters vary as time passes. The methylation of CpG site in the promoter region of Klf4 and Nanog not only affects the expression of Klf4 and Nanog, but also plays an important regulatory role.

bone marrow mesenchymal stem cells; bone marrow CD90+Lin-cells; Nanog gene; Klf4 gene

廣東省科技計劃項目(2010B080701069)。

劉欽成(1992-)，男，在讀碩士，主要研究方向為肝和肝干細胞移植。E-mail： 276309233@qq.com

廖彩仙(1960-)，男，教授，主任醫師，博士生導師，主要研究方向為肝和肝干細胞移植。E-mail： liaocx@fimmu.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.31.004

R394.2

A

1002-266X(2017)31-0013-04

2017-06-13)