中藥對心肌缺血再灌注損傷過程中自噬的調控

鄭晴+包怡敏

[摘要]自噬是一種利用溶酶體來清除細胞內不必要或受損的細胞器，以維持細胞內環境穩態的基本過程。近年來的研究表明，自噬在心肌缺血再灌注過程中發揮著重要的作用。在心肌缺血階段，適度的自噬可以保護細胞免受各種壓力；然而在再灌注階段時，過度的自噬使細胞死亡進一步增強。因此，自噬在心肌缺血再灌注過程中具有的雙重作用為心臟疾病的治療提供了新的治療靶點。近年來，越來越多的中藥被證實可以通過調節心肌細胞的自噬水平，通過增強自噬或抑制自噬，對受損心肌產生保護作用。該文綜述了心肌缺血再灌注損傷過程中自噬的主要分子機制和作用及中藥對其的調控作用。

[關鍵詞]中藥； 心肌缺血再灌注； 自噬

Regulatory effects of traditional Chinese medicine on

autophagy in myocardial ischemia reperfusion injury

ZHENG Qing， BAO Yimin*

（College of Basic Medicine， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China）

[Abstract]Autophagy is a basic process of eliminating unnecessary or damaged organelles by lysosome to maintain the internal environment homeostasis Recent studies have revealed that autophagy plays an important role in pathology of myocardial ischemia reperfusion In the phase of ischemia， moderate autophagy can protect the cells against various stress； but in the phase of reperfusion， excessive autophagy can increase the death of cells Therefore， the dual role of autophagy in myocardial ischemia reperfusion provides a new therapeutic target for the treatment of heart disease In recent years， more and more Chinese medicines have been proved to adjust the autophagy in myocardial cells， and protect the damaged myocardium by enhancing or inhibiting autophagy This article would review the molecular mechanisms of autophagy and its role in myocardial ischemia reperfusion injury as well as the regulation effect of Chinese medicine on it

[Key words]traditional Chinese medicine； myocardial ischemiareperfusion； autophagy

自噬是指在細胞內衰老、受損的蛋白質及細胞器通過溶酶體被降解成氨基酸等小分子物質，從而為生物合成提供原料和能量，維持細胞內環境穩態的過程。細胞在饑餓、缺氧、氧化應激、病原體感染和內質網應激等刺激條件下可誘導自噬的發生。研究表明，適度的自噬通過緩解能源危機、維持蛋白質內穩態、清除受損細胞等發揮對組織細胞的保護作用；但是自噬的長期上調可以導致細胞過度降解而死亡。近年來，關于自噬在心血管疾病中的作用的研究越來越多，但其在心肌缺血再灌注（ischemiareperfusion，I/R）中的作用仍存在爭議。隨著中醫藥研究的不斷發展，中藥在調節自噬方面取得了一定的進展。本文旨在討論自噬在心肌缺血再灌注損傷中所發揮的作用與機制，以及中藥對其的影響。

1自噬與心肌缺血再灌注損傷

11自噬的類型和過程

自噬存在于大多數真核細胞中，是溶酶體依賴性的降解機制。根據不同的分類標準，自噬具有不同的分類方式。根據包裹物和運輸方式的不同，可分為：巨自噬（macroautophagy）、微自噬（microautophagy），以及分子伴侶介導的自噬（chaperonmediated autophagy，CMA），其中巨自噬為最主要的形式，即通常所說的自噬[1]。自噬過程可以分為4個階段：①自噬的誘導：細胞在自噬起始信號的調控下，在內質網上生成歐米茄體，并形成了有雙層膜的杯狀隔離膜，也稱為前自噬泡；②自噬體的形成：前自噬泡不斷的向兩邊延伸，細胞器等細胞質的成分也隨之被吞噬，最后隔離膜封閉形成雙層膜結構的自噬小體；③自噬溶酶體的形成：自噬小體的外膜與溶酶體融合形成自噬溶酶體；④自噬溶酶體的降解與再利用：溶酶體水解酶包括組織蛋白酶、脂酶等會降解自噬體的內膜及其內部成分，而被降解的產物會被送回到胞漿之中，供細胞重新循環利用[2]。

12再灌注過程中自噬的調控機制

121活性氧介導自噬發生活性氧（ROS）是經典的自噬誘導劑[3]，細胞內的活性氧或細胞外過度的氧化應激反應可以通過上調自噬維持細胞內穩態。越來越多的證據表明，自噬可導致氧化應激條件下的細胞死亡，清除活性氧可明顯的抑制自噬[4]。最新研究表明，在內質網應激或者氧化應激狀態下，ROS通過調控絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和自噬流導致細胞死亡[5]。

122Beclin1介導的自噬Beclin1是自噬的關鍵蛋白之一，它參與了自噬體膜的形成過程，可作為自噬的標記蛋白。在心肌缺血期間，自噬的誘發主要依賴AMPK信號通路；而在再灌注期間則主要依賴Beclin1，且自噬的激活又可以引起Beclin1的上調。因此，隨著自噬的不斷增強，Beclin1蛋白表達也隨之增加。目前也有研究發現通過競爭性結合Beclin1和Bcl2以及Beclin1與Bcl2的磷酸化修飾，可以在介導凋亡機制發生的同時，促進自噬的發生[6]。

123Bnip3介導線粒體自噬Bnip3位于線粒體外膜，它不僅是一種可以誘導線粒體功能發生障礙和細胞死亡的促凋亡蛋白，也是細胞自噬的強力誘導劑。Bnip3的過表達可以引起成年心肌細胞自噬增多。有研究稱在再灌注過程中由于活性氧、鈣超載等因素影響，導致Bnip3調控的線粒體通透性轉換孔（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）開放，使線粒體膜通透性增加，同時釋放細胞色素C等促凋亡信號，進而誘導自噬的發生，mPTP的抑制劑環孢素可以阻斷mPTP的開放，并在HL1細胞發生缺血再灌注后使自噬減弱[7]，說明mPTP可能是心肌I/R損傷中調節自噬的上游分子。但也有報道稱，作為心肌細胞中自噬的有效誘導物，Bnip3可以不依賴于活性氧、鈣超載、mPTP開放而是通過破壞Beclin1和Bcl2之間的相互作用而誘發自噬[8]。目前也有研究表明，Bnip3可以與自噬關鍵蛋白LC3相互作用，誘導線粒體自噬，通過清除受損的線粒體發揮對心肌的保護作用[9]。

124PI3K/Akt/mTOR信號通路調節細胞自噬哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）屬于磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3kinase，PI3K）相關激酶（PIKK）家族成員，影響自噬體成熟階段的形成。心肌缺血時，mTOR被抑制，誘導自噬的產生；再灌注時，mTOR被激活，從而抑制自噬[10]。PI3K/Akt信號通路是mTOR眾多調控機制中最經典的一條信號轉導通路，也是自噬起始階段最主要的信號通路。PI3K是一種可使肌醇環第3位羥基磷酸化的磷酯酰肌醇激酶，按照結構可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型PI3K激活可以抑制自噬；Ⅱ型PI3K激活與自噬無太大關系；Ⅲ型PI3K參與初期自噬體的形成，并促進自噬。Akt是PI3K的下游分子，活化后可通過影響mTOR對細胞自噬進行調控。最近的研究證明，在I/R早期，自噬被過度激活，藥物治療可刺激PI3K/Akt磷酸化，進一步增強mTOR信號從而抑制自噬[11]。

心肌缺血再灌注損傷中自噬的主要調控機制見圖1。

13自噬在心肌缺血再灌注過程中的雙重作用

131自噬在心肌缺血再灌注過程中起到的保護作用從心肌缺血階段開始，自噬信號的激活可誘導細胞產生ATP以緩解能源危機。有研究證實，自噬抑制劑3甲基嘌呤可以降低ATP的產生，加重缺糖損傷時的心肌細胞死亡[12]。自噬在心肌缺血再灌注階段作為一種能量的恢復過程，是心肌細胞存活的關鍵。同時，自噬對蛋白質內穩態也有重要的影響。泛素蛋白酶系統和自噬是2種主要的蛋白質水解系統，可以通過清除錯誤折疊和受損的蛋白質及細胞器，起到維護細胞完整性的作用。但是在心肌缺血再灌注過程中，泛素蛋白酶系統功能失調，導致心肌泛素化蛋白聚集體的合成增加[13]；而此時自噬活性的增加可以彌補泛素化蛋白受損的功能，并使蛋白水解維持在一個適當的水平。因此，在心肌缺血再灌注的起始階段，自噬對心肌是起到保護作用的。

132自噬在心肌缺血再灌注過程中起到的損害作用雖然自噬有利于ATP的生成和細胞內環境穩態的維持，但在再灌注時過度的自噬可導致心肌細胞的過度死亡。自噬是一種負責細胞內底物降解的過程，若自噬激活超過一定水平，溶酶體酶增加，過度清除了必要的蛋白質和細胞器，可導致細胞功能障礙，引起細胞自噬性死亡。有研究證實，使用自噬抑制劑3MA或敲除Beclin1時可以減少在心肌缺血再灌注損傷時的細胞死亡[14]。

自噬的另一個有害原因可能是自噬與凋亡之間的串擾。Bcl2蛋白是Bcl2家族中的抑制凋亡的蛋白，參與了細胞凋亡的調控，其表達下降可促進細胞凋亡的發生。值得注意的是，Bcl2蛋白表達上調可以抑制Beclin1依賴性自噬，并且再灌注時Beclin1的激活與Bcl2蛋白表達下調有關[15]。

2中藥通過抑制自噬來減輕心肌缺血再灌注損傷

研究表明，一些中藥及其有效成分在心肌缺血再灌注損傷的過程中具有抑制自噬的作用，如黃芩甲苷[16]、香青蘭總黃酮[17]、加味丹參飲[18]等，均可下調再灌注心肌Beclin1，LC3II，Atg5等自噬相關蛋白的表達。中藥及有效成分對自噬的抑制作用是通過多條途徑進行的。

21通過抗氧化途徑抑制自噬

現階段有研究證實，一些中藥提取物可以通過抗氧化應激來調控過度的自噬。例如銀杏總黃酮[19]、青蒿素[20]和橙皮苷[21]在治療大鼠心肌缺血再灌注模型時，氧化應激的相關指標丙二醛（MDA）水平明顯降低而超氧化物歧化酶（SOD）水平明顯升高，同時自噬的相關基因LC3II/I和Beclin1水平明顯降低，心肌損傷標記物肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）表達下降，說明它們是通過抗氧化應激抑制自噬從而緩解心肌缺血再灌注損傷。

22通過激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制自噬

PI3K/Akt/mTOR通路是目前研究最多的自噬相關機制之一。丹酚酸B（Sal B）來源于中藥丹參，它在自噬早期通過阻斷自噬流以及影響自噬體的形成來抑制自噬，并且減輕了自噬期間的細胞凋亡[22]。最近的研究發現，Sal B可以通過下調Beclin1和LC3II的表達來抑制自噬，然而在使用PI3K抑制劑LY294002后，消除了Sal B誘導的pAkt表達以及抗自噬的作用。因此Sal B抑制自噬減輕心肌細胞I/R損傷可能是通過對PI3K/Akt信號通路的調節[23]。九龍藤總黃酮（BCF）是龍須藤莖提取物的主要活性成分，以往的研究表明，BCF可清除自由基，改善心肌能量代謝，減輕炎癥反應和心肌損傷，抑制細胞凋亡和促進細胞缺氧/復氧損傷的心肌細胞的存活率[24]。進一步研究發現，BCF通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路來抑制細胞凋亡及過度的自噬，從而緩解心肌缺血再灌注損傷。BCF預處理可以下調自噬相關蛋白Beclin1，LC3II，上調PI3K和pAkt蛋白的表達，增加內皮型一氧化氮合酶（eNOS）蛋白水平 [25]。也有報道認為，BCF上調mTOR，下調Beclin1并影響了Beclin1誘導的自噬、凋亡互反饋的信號通路，抑制過度自噬，從而發揮對心肌的保護作用[26]。有報道稱，從玉郎傘中提取的玉郎傘查爾酮（YLSC）能降低再灌注造成的心肌Beclin1基因和LC3II蛋白表達的上調，抑制自噬的同時升高Akt的磷酸化水平，對PI3K/Akt通路下游的多個靶點（eNOS，NO，Caspase3）的表達也有影響，其作用可被PI3K特異性抑制劑wortmannin所阻斷，說明YLSC 是通過激活PI3K/Akt信號轉導通路從而抑制過度自噬來減輕缺血/再灌注損傷[27]。因此，多種中藥有效成分被證實是通過激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制自噬而發揮抗I/R損傷作用。